周 華

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)是一組以體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)代謝障礙為特征的臨床癥候群，主要的臨床表現(xiàn)為肥胖、血脂異常[三酰甘油(TG)升高、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低]、高血壓、糖尿病或葡萄糖耐量受損等，發(fā)病機制尚未明確，臨床上尚缺乏根治性的治療藥物或治療手段，該病的致死率、致殘率極高，是危害全球的公共健康問題之一[1]。病人糖脂代謝異常導(dǎo)致的脂肪在內(nèi)臟的異常堆積是代謝綜合征最為關(guān)鍵的危險因素[2]。研究表明，動物體內(nèi)的脂肪組織不僅可以產(chǎn)生游離的脂肪酸，參與機體能量的儲存，而且還能分泌諸多脂肪細(xì)胞因子(ADS)參與炎癥、胰島素抵抗、物質(zhì)代謝等病理過程[3]。脂肪細(xì)胞不僅能分泌多種炎性因子，增強炎性因子的表達(dá)，促進(jìn)炎性介質(zhì)的浸潤，激活更大范圍的炎性信號通路，增強脂肪組織中炎癥性應(yīng)激以及胰島素受體底物1絲氨酸磷酸化水平，最終致使病人出現(xiàn)胰島素抵抗，推動代謝綜合征的發(fā)展[4]。匹伐他汀(冠爽)在臨床上用于治療高膽固醇癥、家族性高膽固醇癥等。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，匹伐他汀能明顯調(diào)控病人的血脂指標(biāo)，影響病人的脂肪代謝[5]。過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPAR-α)/核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路在多種與脂肪代謝相關(guān)的疾病及高脂性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪肝等疾病中有重要作用[6]。研究表明，上調(diào)PPAR-α能明顯減輕糖尿病大鼠因胰島素抵抗而致的腎損傷[7]。本研究通過構(gòu)建大鼠代謝綜合征模型，從動物肝臟中糖脂代謝的角度，基于PPAR-α/NF-κB信號通路，探討匹伐他汀對代謝綜合征糖脂代謝的影響機制，以期為臨床藥物的開發(fā)利用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級9～10周齡SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，購自湖南省安生美藥物研究院有限公司，動物使用許可證號：SYXK(湘)2018-0005，根據(jù)我院實驗動物管理辦法，室溫下標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水、分籠(4籠)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于試驗。

1.2 主要試劑與儀器 匹伐他汀(冠爽，規(guī)格：每片2 mg，華潤雙鶴藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20080737)，二甲雙胍緩釋片(美噠靈，規(guī)格：每片0.5 g，上海上藥信宜藥廠有限公司，國藥準(zhǔn)字H20050699)。蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色試劑盒購自美國Selleck公司。組織裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒、3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)化學(xué)發(fā)光試劑盒購自北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司。PPAR-α、NF-κB抗體購自Santa公司。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)、酶聯(lián)免疫吸附法檢測用白細(xì)胞介素-6(interleukin 6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司?？崭寡?fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、血胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、TG、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、HDL-C購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。牛血清白蛋白(bovine serum albumin、BSA)、甲醇、丙酮、二甲苯、中性樹膠購自武漢博士德生物有限公司。兔抗大鼠NF-κB、PPARα以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technolohy公司。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒、SYBR Green PCR 試劑盒、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自德國Thermo公司。

羅氏Modular P800全自動生化分析儀(瑞士ROCHE公司)，AP-960全自動酶聯(lián)免疫分析儀(日本協(xié)和醫(yī)藥株式會社)，蘇凈Airtech超凈工作臺(北京六一儀器廠)，組織包埋機(德國Leica公司，型號：LEICAEG1150)，Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡(日本三菱公司，型號：H-7650)，5810R 型高速離心機(日本島津公司)，E-Gel Imager凝膠成像儀(美國Beckma公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 模型構(gòu)建與分組 按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、實驗組、對照組，每組15只。正常組大鼠始終給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，模型組、實驗組、對照組大鼠給予高脂、高鹽、高糖飼料喂養(yǎng)12周建立代謝綜合征動物模型[8]?；A(chǔ)飼料總熱量為14.32 kJ/g，主要包括玉米面、小麥麩、大豆油、全麥次粉、豆粕、鹽、氯化膽堿、必需氨基酸、礦質(zhì)元素以及復(fù)合維生素等。高脂、高鹽、高糖飼料總熱量為20.56 kJ/g，主要包括56%基礎(chǔ)飼料、15%蔗糖、15%動物脂肪、10%蛋黃等混合均勻后，再額外添加2%的食鹽和2%的膽固醇。兩種飼料均購自湖南大通農(nóng)業(yè)科技有限公司。

12周后，檢測大鼠動脈壓，腹靜脈采血測定其血糖、血脂水平判斷建模是否成功。建模成功后，實驗組和對照組大鼠分別給予匹伐他汀和二甲雙胍緩釋片100 mg/kg灌胃，每日1次；模型組和正常組給予等劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥4周。模型組、實驗組、對照組仍給予高脂、高鹽、高糖飼料，正常組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，所有大鼠均自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)動物房飼養(yǎng)。

末次給藥后，禁食12 h，稱量各組大鼠體重，腹靜脈采血2 mL，離心，留取上清液，低溫冷藏待測。麻醉動物后，斷頭處死，無菌剝離大鼠的胰腺組織、肝臟組織、腎周脂肪組織，依次使用PBS、生理鹽水清洗干凈，無菌濾紙吸掉水分，稱其質(zhì)量，迅速以液氮封存，低溫冷藏待測。大鼠胰腺的臟器系數(shù)=大鼠胰腺質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%，大鼠肝臟的臟器指數(shù)=大鼠肝臟質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%。

1.3.2 大鼠胰腺組織、肝臟組織病理變化的觀察 分別取各組大鼠10%的胰腺組織和肝臟組織，生理鹽水清洗，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)切片、貼片、烤片，HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.3 大鼠血清指標(biāo)的檢測 羅氏Modular P800全自動生化分析儀測定各組大鼠血清FPG、FINS、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，全自動酶聯(lián)免疫分析儀檢測各組大鼠血清中IL-6和TNF-α的含量。同時通過[FPG(mmol/L)× FINS(mU/L)]/22.5計算大鼠的胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)[9]。

1.3.4 PCR檢測各組大鼠肝臟中糖、脂代謝基因的mRNA表達(dá) 取20%的大鼠肝臟組織，常規(guī)提取各組細(xì)胞的總RNA，測定純度和完整度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR儀進(jìn)行擴增。GAPDH作為內(nèi)參；以2-△△Ct表示基因的相對表達(dá)量[10]。糖原合成基因(GS2)、胰島素誘導(dǎo)基因1(INSIG1)、胰島素誘導(dǎo)基因2(INSIG2)，脂肪酸合成的乙酰輔酶A羧化酶基因(ACC)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白基因(SREBP)、脂肪酸合成酶基因(FAS)以及GAPDH的正向序列和反向序列均由湖南潤美基因科技有限公司設(shè)計完成。各目的基因的引物序列詳見表1。

表1 糖、脂代謝基因及其引物序列

1.3.5 免疫組化法檢測各組大鼠肝臟組織中NF-κB、PPARα含量 取10%大鼠肝臟組織，用10%的中性甲醛固定，包埋，切片，脫蠟，去除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS修復(fù)抗原，分別加一抗(1∶100)4 ℃過夜孵育，次日加入二抗(1∶500)室溫孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，丙酮梯度脫水，二甲苯浸泡，中性樹膠封片，鏡檢觀察并記錄實驗結(jié)果；用圖像分析軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析NF-κB、PPARα的陽性細(xì)胞比例。

1.3.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測各組大鼠脂肪組織NF-κB、PPARα蛋白表達(dá)水平 取10%大鼠脂肪組織，裂解后離心留取上清，測定總蛋白濃度后，取50 μg樣品，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗(均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入二抗，DAB顯色，成像，Image軟件分析各條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，獲得蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 代謝綜合征大鼠的建模情況 基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)大鼠(正常組)活動正常，反應(yīng)機敏，皮毛順滑有光澤，體重增加穩(wěn)定；高脂、高鹽、高糖飼料喂養(yǎng)12周后，模型組、實驗組、對照組大鼠反應(yīng)逐漸遲鈍，活動量減少，皮毛漸漸失去光澤，變得暗淡粗糙，飲水量明顯增多。基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)大鼠平均動脈壓為(105.78±5.69)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，TG為(2.13±0.49)mmol/L，血糖為(0.85±0.55)mmol/L；高脂、高鹽、高糖飼料喂養(yǎng)大鼠平均動脈壓為(131.37±6.71)mmHg，TG為(6.78±0.63)mmol/L，血糖為(2.83±0.66)mmol/L，高脂、高鹽、高糖飼料喂養(yǎng)大鼠的平均動脈壓、TG、血糖水平明顯高于基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)大鼠，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組大鼠胰腺組織、肝臟組織病理改變比較 HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞規(guī)則，大小均勻，排列有序，肝細(xì)胞索呈放射狀排列；模型組大鼠肝臟組織損傷明顯，肝細(xì)胞的界限模糊，細(xì)胞出現(xiàn)分布較多的脂肪空泡，肝細(xì)胞索失去正常結(jié)構(gòu)，排列紊亂。實驗組和對照組大鼠的肝臟組織損傷明顯緩解，肝細(xì)胞排列趨于正常，細(xì)胞界限較模型組清晰可辨。詳見圖1。正常組大鼠的胰腺實質(zhì)分葉清晰，胰腺組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞規(guī)整排列，胰島色淺，在胞漿內(nèi)呈球狀，腺泡上皮細(xì)胞呈錐形，核質(zhì)界限清晰，線粒體以及其他細(xì)胞器規(guī)整地分散在胞核周圍，胞漿呈現(xiàn)嗜堿性；模型組大鼠胰腺組織失去正常形狀，腺體內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡變性，結(jié)構(gòu)完整的線粒體數(shù)量減少，核質(zhì)界限不明顯，核質(zhì)固縮嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)容物明顯減少，胰島β細(xì)胞的結(jié)構(gòu)不明，炎性細(xì)胞浸潤明顯；實驗組和對照組大鼠的胰腺組織損傷較模型組明顯減輕，腺體內(nèi)雖有空泡樣變性以及少量的炎性細(xì)胞，但線粒體數(shù)量明顯增多，核膜的結(jié)構(gòu)區(qū)域正常。詳見圖2。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理變化(×400)

圖2 各組大鼠胰腺組織病理變化(×400)

2.3 各組大鼠臟器指數(shù)比較 與正常組比較，模型組大鼠的肝臟系數(shù)明顯升高、胰腺系數(shù)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，實驗組和對照組大鼠肝臟系數(shù)明顯降低、胰腺系數(shù)明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組和對照組肝臟系數(shù)、胰腺系數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖3。

模型組與正常組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

2.4 各組大鼠血清指標(biāo)比較 與正常組比較，模型組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、IL-6、TNF-α水平均明顯升高，HDL-C明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，實驗組和對照組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、IL-6、TNF-α水平均明顯下降，HDL-C明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組和對照組以上指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖4。

與正常組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

2.5 各組大鼠肝臟組織糖、脂代謝基因表達(dá)比較 與正常組比較，模型組大鼠肝臟組織糖代謝基因GS2、脂代謝基因ACC、SREBP、FAS的mRNA表達(dá)明顯升高，糖代謝基因INSIG1、INSIG2的mRNA表達(dá)明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，實驗組和對照組大鼠肝臟組織糖代謝基因GS2、脂代謝基因ACC、SREBP、FAS的mRNA表達(dá)明顯下降，糖代謝基因INSIG1、INSIG2的mRNA表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組和對照組以上指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖5。

2.6 各組大鼠肝臟組織PPARα、NF-κB含量比較 與正常組比較，模型組大鼠肝臟組織中PPARα陽性細(xì)胞比例明顯下降、NF-κB陽性細(xì)胞比例明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，實驗組和對照組大鼠肝臟組織中PPARα陽性細(xì)胞比例明顯升高、NF-κB陽性細(xì)胞比例明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組和對照組以上指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖6、圖7。

模型組與正常組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

模型組與正常組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

圖7 各組大鼠肝臟組織PPARα、NF-κB含量免疫組化圖(×400 )

2.7 各組大鼠脂肪組織PPARα、NF-κB蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，模型組大鼠脂肪組織中PPARα蛋白表達(dá)明顯下降、NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，實驗組和對照組大鼠脂肪組織中PPARα蛋白表達(dá)明顯升高、NF-κB蛋白表達(dá)明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組和對照組以上指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖8、圖9。

圖8 各組大鼠脂肪組織PPARα、NF-κB蛋白表達(dá)條帶圖

模型組與正常組比較，＊P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

3 討 論

隨著人們生活方式與飲食習(xí)慣的改變，代謝綜合征受多種心血管疾病合并癥如高血壓、高血脂等的危險因素的影響，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢[11]。目前，針對該病的臨床干預(yù)往往傾向于疾病前狀態(tài)，而忽略病人早期代謝異常的狀態(tài)，以致難以全面干預(yù)疾病的發(fā)展，嚴(yán)重制約療效以及影響病人的遠(yuǎn)期預(yù)后。

匹伐他汀是臨床上廣泛應(yīng)用的強效降脂藥物。藥理學(xué)研究顯示，匹伐他汀不僅具有較好的抗炎、穩(wěn)定斑塊的作用，還能阻斷細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成，調(diào)節(jié)機體內(nèi)的血脂水平[12]。馮翔等[13]研究證實，在冠狀動脈旁路移植術(shù)后使用匹伐他汀對病人進(jìn)行強化降脂治療，可明顯降低LDL-C水平，且并未增加病人的肝、腎負(fù)擔(dān)，是圍術(shù)期降脂的理想藥物。王麗娟等[14]臨床研究表明，在治療非酒精性脂肪性肝病中，匹伐他汀可降脂、抗炎及改善病人出現(xiàn)的胰島素抵抗現(xiàn)象，并且對肝功能的影響較低。韓瑞芳[15]研究表明，在冠心病合并血脂升高的病人中長期服用匹伐他汀，能明顯降低病人的血脂水平，但并不增加病人發(fā)生糖尿病的風(fēng)險。Carmena等[16]研究顯示，降血脂藥物瑞舒伐他汀的副作用主要表現(xiàn)為對胃腸道的刺激癥狀、肌肉酸痛無力，可能導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)，而將匹伐他汀應(yīng)用到早發(fā)冠心病的治療中，不存在上述副作用。司曉鳳等[17]研究表明，在急性心肌梗死病人中應(yīng)用匹伐他汀，能夠全面改善病人的血脂水平，升高其脂聯(lián)素水平，調(diào)控血糖水平。本研究在成功構(gòu)建代謝綜合征大鼠后，模型組大鼠出現(xiàn)類似人類的代謝綜合征臨床癥狀，采用匹伐他汀進(jìn)行干預(yù)，實驗組動物肝臟、胰腺組織損傷明顯緩解，血清中血糖、血脂、炎性因子指標(biāo)明顯改善，肝臟組織中血糖、血脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)趨于正常，證實了匹伐他汀對代謝綜合征的治療作用。

NF-κB是炎性應(yīng)激的調(diào)控樞紐，炎性因子經(jīng)NF-κB轉(zhuǎn)錄激活后表達(dá)，慢性炎性應(yīng)激與脂肪在內(nèi)臟中異常堆積是代謝綜合征的基本病理改變[18]。研究表明，在高脂、高糖、高鹽的誘導(dǎo)下，NF-κB激活TNF-α、IL-6等炎性因子的表達(dá)，而TNF-α、IL-6作為脂肪細(xì)胞因子，不僅干擾胰島素受體的功能，使機體出現(xiàn)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，還能將炎性信號級聯(lián)放大，誘發(fā)更劇烈的炎癥性反應(yīng)，使病人出現(xiàn)代謝綜合征[19]。PPAR-α是一種核受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子，主要在肝臟、心、腎以及脂肪組織中表達(dá)。PPAR-α在機體內(nèi)主要參與調(diào)控糖脂代謝和抑制炎性應(yīng)激[20]。華慧英等[21]研究表明，在代謝綜合征小鼠模型中，PPAR-α不僅能激活多種糖、脂基因的表達(dá)，還能降低血脂、升高HDL-C，并且能夠抑制炎癥性反應(yīng)的發(fā)展，改善小鼠的胰島素抵抗。本研究中，實驗組大鼠肝臟與脂肪組織中PPARα蛋白表達(dá)升高，NF-κB蛋白表達(dá)下降，推斷匹伐他汀可能是通過調(diào)節(jié)PPAR-α/NF-κB信號來調(diào)控代謝綜合征大鼠的糖、脂代謝。

綜上所述，匹伐他汀能夠調(diào)節(jié)代謝綜合征大鼠的糖、脂代謝，可能與PPAR-α/ NF-κB信號有關(guān)。但是將匹伐他汀用于臨床治療代謝綜合征時仍需進(jìn)一步考察其遠(yuǎn)期療效。