呂 夢(mèng)，紀(jì)曉迪，劉珂珂，婁利霞，聶 波，趙久麗，吳愛明

心肌梗死后繼發(fā)的快速型室性心律失?？蓪?dǎo)致心源性猝死的發(fā)生[1]。縫隙連接可作為心肌梗死后心律失常的有效治療靶點(diǎn)。在心臟中，縫隙連接介導(dǎo)心肌細(xì)胞間的電偶聯(lián)，是維持正常心律、調(diào)節(jié)血管張力和細(xì)胞間代謝交換的基礎(chǔ)[2]?？p隙連接蛋白43(CX43)主要在心房和心室肌細(xì)胞中表達(dá)，是心臟中最豐富的CX亞型[3]。自噬是細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)降解的保守過(guò)程，心肌細(xì)胞可以通過(guò)自噬降解錯(cuò)誤折疊或老化的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器，為心肌細(xì)胞提供能量供應(yīng)從而維持正常的心肌功能，而在心肌梗死病理?xiàng)l件下過(guò)度激活的自噬則可引起大量細(xì)胞死亡，加重病情進(jìn)展[4]。研究表明，誘導(dǎo)自噬的條件對(duì)連接蛋白的表達(dá)水平有直接影響[5-6]。

穩(wěn)心顆粒由黃精、三七、黨參、琥珀、甘松5味藥配伍而成，對(duì)于多種原因引起的心律失常有顯著療效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)心顆?？赏ㄟ^(guò)調(diào)控CX43的表達(dá)分布，從而改善心律失常[7]；而在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面，已發(fā)現(xiàn)穩(wěn)心顆?？烧{(diào)節(jié)肥大心肌細(xì)胞自噬水平[8]。基于以上線索，本研究通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，建立心肌梗死大鼠模型，初步探討心肌梗死后心律失常病理?xiàng)l件下，穩(wěn)心顆粒對(duì)CX43的表達(dá)以及心肌自噬水平變化的影響，以此進(jìn)一步揭示心肌梗死后心律失常的發(fā)病機(jī)制并闡明穩(wěn)心顆粒新的干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。通過(guò)醫(yī)學(xué)倫理審批后，于中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室屏障環(huán)境動(dòng)物室中飼養(yǎng)。

1.2 藥物及試劑 穩(wěn)心顆粒，每袋5 g(山東步長(zhǎng)制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10950026)。酒石酸美托洛爾片，每片25 mg(阿斯利康制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)H32025391)。自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白/輕鏈3(LC3)、酵母自噬相關(guān)基因6哺乳動(dòng)物同原體(Beclin1) 、P62、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(Proteintech抗體公司，貨號(hào)分別為14600-1-AP、11306-1-AP、18420-1-AP、10494-1-AP)，CX43抗體(Abcam公司，貨號(hào)ab11370)。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(蘭博利德公司，貨號(hào)S0101)，免疫組化通用SP試劑盒、3，3-N-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸(DAB)顯色試劑盒(中杉金橋公司，貨號(hào)分別為SP-9000、ZLI-9018)，超敏增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒(新賽美公司，貨號(hào)P10100)。

1.3 儀器 超高分辨率小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)(加拿大VisualSonics公司，型號(hào)：Vevo 2100)，泰盟BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，徠卡石蠟切片機(jī)(型號(hào)：RM2235)，電泳儀(北京龍方科技有限公司，型號(hào)：LF-2000)，水平式脫色搖床(北京龍方科技有限公司，型號(hào)：LF-TS03)，光學(xué)顯微鏡(德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)，型號(hào)：DMC5400)，ECL化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司，型號(hào)：Tanon-4600)。

1.4 方法

1.4.1 模型制備[9]選取32只大鼠，在大鼠左胸前區(qū)第3、4肋間逐層剪開皮膚、肌肉層，鈍性分離肋骨層，撕開心包膜后，充分暴露手術(shù)視野，采用心臟左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法建立心肌梗死大鼠模型，肉眼可見結(jié)扎線下左室前壁缺血變白，術(shù)后即刻心電圖可見ST段明顯抬高，術(shù)后24 h心電圖可見病理性Q波形成。

1.4.2 分組及給藥 以術(shù)后24 h前壁V3～V6導(dǎo)聯(lián)、側(cè)壁Ⅰ導(dǎo)聯(lián)、aVL導(dǎo)聯(lián)，同時(shí)兼有前間壁V1導(dǎo)聯(lián)或V2導(dǎo)聯(lián)可見病理性Q波為建模成功標(biāo)準(zhǔn)[10]。隨機(jī)分為模型組、美托洛爾組、穩(wěn)心顆粒低劑量組、穩(wěn)心顆粒高劑量組，每組8只，另取8只大鼠為正常組。穩(wěn)心顆粒低劑量組(1.35 g/kg)和美托洛爾組(2.25×10-3g/kg)的給藥劑量參考文獻(xiàn)[11]的等效劑量換算方法進(jìn)行折算，穩(wěn)心顆粒高劑量組(2.7 g/kg)的給藥劑量為低劑量組的2倍。術(shù)后24 h開始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)治療4周。正常組及模型組均給予等量生理鹽水。

1.4.3 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 給藥4周后，使用小動(dòng)物心臟超聲心動(dòng)圖測(cè)量評(píng)價(jià)大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能。麻醉大鼠后，測(cè)量并記錄左室短軸收縮末期前壁厚度(LVAWs)、左室舒張末期前壁厚度(LVAWd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)以及左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。所有原始測(cè)量值選取至少3個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期，取平均值。

1.4.4 心室顫動(dòng)閾值測(cè)定 在體心臟電刺激誘發(fā)心室顫動(dòng)。給藥4周后，腹腔注射麻醉大鼠，行氣管插管，連接呼吸機(jī)輔助呼吸，連接BL-420生物機(jī)能系統(tǒng)，啟動(dòng)系統(tǒng)軟件，選擇菜單“輸入信號(hào)/通路1/心電”后，出現(xiàn)心電圖波形。沿四五肋間開胸并暴露心臟，刺激電極的正極鉤在心尖，負(fù)極鉤在靠近心底方向與正極相距3 mm，設(shè)置電刺激條件(粗電壓，串刺激，串長(zhǎng)10個(gè)刺激波，起始強(qiáng)度1 V)，圖形穩(wěn)定后，開始電刺激，紀(jì)錄第1次誘發(fā)心室顫動(dòng)的電壓值，作為心室顫動(dòng)閾值。

1.4.5 心臟組織病理學(xué)改變 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心臟組織病理學(xué)改變。

1.4.6 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 給藥4周后，麻醉大鼠并取心臟，心臟組織經(jīng)過(guò)固定、脫水、透明、石蠟包埋后制成石蠟切片，并行免疫組織化學(xué)染色。參照試劑盒說(shuō)明書，烤片1 h，脫蠟水化后，進(jìn)行抗原修復(fù)，阻斷劑室溫孵育10 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗后加入山羊血清封閉，之后加入一抗，一抗稀釋比例分別為L(zhǎng)C3(1∶800)、Beclin1(1∶200)、CX43(1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜。DAB顯色，陽(yáng)性表達(dá)呈棕色，采用Image J軟件分析LC3、Beclin1、CX43蛋白表達(dá)的平均光密度值(average optical density，AOD)。

1.4.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 每組選取6只大鼠，取出各組大鼠心室梗死邊緣區(qū)組織20 mg，按照1∶10的比例加入RIPA裂解液200 μL，充分超聲勻漿，靜置20 min后，低溫離心移取上清，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將各組蛋白調(diào)整至4 μg/μL，置于-20 ℃凍存，在半月內(nèi)檢測(cè)完畢。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳的上樣體積為每組10 μL，200 mA恒流將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫封閉1 h， 緩沖液洗膜后加入稀釋好的一抗，4 ℃過(guò)夜孵育。一抗稀釋比例GAPDH、CX43、LC3、P62、Beclin1分別為1∶20 000，1∶8 000，1∶1 500，1∶5 000，1∶5 000。二抗室溫孵育1 h，洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。使用Image J進(jìn)行分析蛋白條帶，計(jì)算出CX43、LC3、P62、Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較 與正常組比較，模型組大鼠LVAWs、LVAWd、LVEF降低，LVIDs、LVIDd升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，穩(wěn)心顆粒低劑量組、穩(wěn)心顆粒高劑量組、美托洛爾組LVAWs、LVAWd、LVEF升高，LVIDs、LVIDd降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較(±s)

2.2 各組大鼠心室顫動(dòng)閾值比較 模型組大鼠心室顫動(dòng)閾值明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，穩(wěn)心顆粒低劑量組、穩(wěn)心顆粒高劑量組、美托洛爾組心室顫動(dòng)閾值增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 各組大鼠心室顫動(dòng)閾值比較(±s) 單位：V

2.3 各組大鼠心臟組織病理學(xué)改變比較 HE染色顯示，正常組大鼠心肌纖維呈長(zhǎng)條狀排列整齊有序，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞質(zhì)均勻紅染，細(xì)胞核形態(tài)正常。模型組大鼠心肌纖維呈波浪狀或斷裂溶解，心肌細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)模糊不清，細(xì)胞核固縮，形態(tài)異常；與模型組比較，穩(wěn)心顆粒低劑量組、穩(wěn)心顆粒高劑量組、美托洛爾組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯改善，病理改變明顯減輕。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理改變HE染色圖( ×400)

2.4 各組大鼠心肌LC3、Beclin1、CX43蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，模型組LC3、Beclin1蛋白AOD明顯增加，CX43蛋白AOD明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，穩(wěn)心顆粒高劑量組、美托洛爾組自噬正相關(guān)蛋白LC3、Beclinn1 AOD均明顯降低，CX43蛋白AOD增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。正常組CX43陽(yáng)性表達(dá)主要分布在心肌細(xì)胞間閏盤處，呈線狀排列整齊；模型組CX43表達(dá)明顯減少，呈點(diǎn)狀分布紊亂。詳見表3、圖2。

表3 穩(wěn)心顆粒對(duì)大鼠心肌LC3、Beclin1、CX43蛋白表達(dá)的AOD比較(±s)

圖2 各組自噬相關(guān)蛋白及CX43表達(dá)及分布情況(免疫組織化學(xué)染色，×400)

2.5 各組大鼠心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及縫隙連接蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，模型組自噬正相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表達(dá)增加，自噬負(fù)相關(guān)蛋白P62及CX43蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，穩(wěn)心顆粒低劑量組Beclin1蛋白表達(dá)明顯減少，P62蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，穩(wěn)心顆粒高劑量組及美托洛爾組LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)明顯降低，P62及CX43蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3、圖4。

圖3 Western Blot法檢測(cè)各組大鼠自噬相關(guān)蛋白及CX43蛋白表達(dá)條帶圖

模型組與正常組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

3 討 論

冠心病在心血管疾病的臨床死亡原因中居首位，而心肌梗死又是冠心病中的一種嚴(yán)重疾病類型，由于心肌血液供應(yīng)減少，心肌細(xì)胞缺血缺氧壞死，心肌功能受損，心肌正常收縮及舒張功能喪失，心搏出量降低，誘發(fā)心源性猝死[12]。心臟中CX43半衰期較短，一般為1～3 h，主要位于心肌細(xì)胞閏盤處，CX43的磷酸化、數(shù)量和分布的病理性改變可使心臟電傳導(dǎo)障礙，最終發(fā)生心律失常[13]。

基礎(chǔ)水平的自噬在缺血性心肌病、心力衰竭和心肌肥厚期間可明顯上調(diào)，保護(hù)心臟，然而過(guò)度激活的自噬則可導(dǎo)致大量細(xì)胞器的降解和細(xì)胞死亡[14]。臨床觀察到在心肌梗死病人的壞死心肌組織中，自噬正相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表達(dá)有所增加，表明在心肌梗死的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，自噬可能被激活[15]。自噬參與縫隙連接蛋白的降解，一方面可以為心肌細(xì)胞內(nèi)縫隙連接蛋白的更新提供基礎(chǔ)，另一方面則成為心血管疾病的內(nèi)在發(fā)病機(jī)制[16]。超微結(jié)構(gòu)在自噬體內(nèi)部觀察到球狀縫隙鏈接體，自噬相關(guān)基因(如LC3、P62、Atg6)的遺傳沉默導(dǎo)致環(huán)狀縫隙鏈接的積累和LC3與CX43的共定位減少[17]。因此，推測(cè)心肌梗死后心律失常病理?xiàng)l件下，縫隙連接蛋白表達(dá)的變化與心肌細(xì)胞自噬水平相關(guān)。

中藥穩(wěn)心顆粒由黃精、三七、黨參、琥珀、甘松5味中藥組成，循證研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)心顆粒對(duì)于多種病因引起的心律失常均有明顯的治療效果，能快速緩解癥狀，改善病人生活質(zhì)量[18]。穩(wěn)心顆?？烧{(diào)控CX43的表達(dá)分布，改善心律失常[7]。探索穩(wěn)心顆粒改善縫隙連接蛋白表達(dá)與自噬水平的變化，有助于為心肌梗死后心律失常的治療提供新的方向。

本研究結(jié)果顯示，建立模型4周后，模型組大鼠左心室前壁變薄，室內(nèi)徑增大，左室射血分?jǐn)?shù)明顯降低，心臟結(jié)構(gòu)和功能改變，心肌細(xì)胞形態(tài)紊亂，以上病理改變?yōu)樾募」Ｋ篮笮穆墒С５陌l(fā)生提供了條件；此外，本研究還觀察到心肌組織CX43表達(dá)及分布的異常，與心肌梗死后大鼠發(fā)生心律失常的結(jié)局直接相關(guān)。已有研究證實(shí)，心肌梗死后心肌細(xì)胞CX43分布以及表達(dá)量的異常，使得由縫隙連接蛋白構(gòu)成的縫隙連接通道關(guān)閉，導(dǎo)致心肌電傳導(dǎo)障礙從而誘發(fā)心律失常[19]，這與本研究中模型組大鼠心室顫動(dòng)閾值明顯降低、心律失常易感性明顯增加的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

本研究進(jìn)一步深入觀察發(fā)現(xiàn)，心肌梗死病理?xiàng)l件下，LC3、Beclin1明顯增加，P62明顯減少；LC3是自噬標(biāo)志蛋白，其C端被半胱氨酸蛋白酶ATG4B切割后形成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合形成LC3Ⅱ，參與自噬體膜的延伸，因此，LC3Ⅱ表達(dá)量增加時(shí)，表明自噬被激活；Beclin1作為自噬特異性蛋白，可調(diào)節(jié)自噬體形成，Beclin1基因活性的明顯上調(diào)表明自噬激活；P62是一種具有多種結(jié)構(gòu)域的自噬底物蛋白，通過(guò)其C端的LC3互相作用區(qū)(LIR)與LC3結(jié)合，聚集待降解的蛋白，在蛋白積累過(guò)程中，P62表達(dá)增加，隨著自噬溶酶體酶解反應(yīng)的開始，P62表達(dá)降低[20-22]。以上結(jié)果表明心肌梗死后4周模型組大鼠心臟自噬水平過(guò)度激活。而自噬參與了縫隙連接蛋白的降解過(guò)程[23]。因此，本研究推測(cè)心肌梗死后自噬的過(guò)度激活介導(dǎo)了CX43經(jīng)自噬途徑降解的增加，這是導(dǎo)致心肌梗死后心律失常不容忽視的潛在機(jī)制。而穩(wěn)心顆粒治療4周后，與模型組比較，心臟結(jié)構(gòu)和功能得到明顯改善，心律失常易感性降低，心肌過(guò)度自噬得以減輕，CX43表達(dá)在一定程度上恢復(fù)，這是穩(wěn)心顆粒防治心肌梗死后心律失常的新機(jī)制。

綜上所述，穩(wěn)心顆粒可以調(diào)節(jié)梗死心肌細(xì)胞過(guò)度激活的自噬水平，保護(hù)CX43表達(dá)，預(yù)防心肌梗死后心律失常的發(fā)生，為臨床應(yīng)用穩(wěn)心顆粒防治心肌梗死后心律失常提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。