劉換換，楊立春，張成閣，郝自遠，李火根

（1.南京林業(yè)大學 林學院，江蘇 南京 210037；2.江蘇農林職業(yè)技術學院 風景園林學院，江蘇 句容 212400）

YABBY家族是種子植物特有一類轉錄因子，暫未在苔蘚類、石松類和蕨類植物的轉錄組和基因組中識別到YABBY家族的同源序列，在對植物的早期胚胎發(fā)育、果實發(fā)育、次生代謝物合成、逆境應答、側生器官分化和背腹極性建立等方面均具有重要作用[1-3]。YABBY家族基因編碼的蛋白具有2個保守的結構域：N端的Cys2/Cys2（C2C2）鋅指結構域和C端的helix-loop-helix（bHLH），也稱為YABBY結構域[4-5]。目前已對眾多物種的YABBY家族進行了成員分析和功能預測與驗證。擬南芥Arabidopsis thaliana中共6個YABBY成員：CRABS CLAW（CRC）、YABBY1/FILAMENTOUS FLOWER（FIL）、YABBY2、YABBY3、YABBY5和INNER NO OUTER（INO），共 分 為5個 亞族：FIL/YABBY3、CRC、INO、YABBY2和YABBY5[6]。其中FIL/YABBY3、YABBY2、YABBY5基因不僅在植株地上部分的遠軸區(qū)的特異表達，也在花器官中表達，如萼片、花瓣、雄蕊和心皮等，但在胚珠中不表達，因此，這3類基因被稱為營養(yǎng)生長YABBY基因（Vegetative genes）；CRC在被子植物的心皮、核心雙子葉植物的蜜腺發(fā)育中發(fā)揮重要作用，INO參與植物胚珠的發(fā)育調控，被稱為生殖生長YABBY基因（Reproductive genes）[6-10]。不同物種的YABBY家族成員數量不同，但其功能與模式植物擬南芥仍然相似。如在單子葉植物玉米Zea mays中YABBY家族成員有13個，而小麥Triticum aestivum為21個；在雙子葉植物桃Prunus persica中有6個，葡萄Vitis vinifera為7個、石榴Punica granatum為6個、番茄Solanum Lycopersicon為9個、辣椒Capsicum annuum則有7～8個[11-18]。雙子葉植物的YABBY家族成員數量明顯少于單子葉植物。進化研究表明，現存的開花植物最后的共同祖先至少有5個YABBY成員[19]。

水稻Oryza sativa的8個YABBY成員，分別命名為YABBY1-7和披葉基因DROOPING LEAF（DL），編碼了170～314 aa，均預測定位到細胞核，其外顯子有6～7個。研究發(fā)現，水稻的YABBY家族出現4次片段重復事件，表明水稻基因組可能至少經歷了2次基因組復制[20]。玉米YABBY家族的13個成員ZmYAB1-13同樣具有基因擴張現象，ZmYAB1/12是OsDL的同源基因[12]。小麥YABBY家族中的18個基因編碼了185～297 aa，外顯子數目為5～7個。在TaYABBY啟動子區(qū)檢測到與植物生長發(fā)育、激素誘導和逆境脅迫有關的順式作用元件，基因具有明顯的組織表達特異性[21]。桃有6個YABBY基因，可分為CRC、INO、FIL/YAB3、YAB2和YAB5共5類，成員具4～6個內含子，啟動子含有大量光應答、激素響應等順式作用元件，表明該家族基因的表達可能會受到環(huán)境、激素等的影響[14]。石榴（6個）和葡萄（7個）在進化過程中沒有YABBY家族基因擴張現象[15-16]。石榴YABBY家族成員具有7個外顯子，與擬南芥相似，結構相對保守，將石榴與雙子葉植物：擬南芥、大豆Glycine max、番茄和葡萄，單子葉植物：水稻、菠蘿Ananas comosus和玉米的YABBY家族進行進化分析，發(fā)現YABBY5亞族最小，且是雙子葉植物特有的[22]。

鵝掌楸屬Liriodendron隸屬木蘭科Magnoliaceae，主要包括2個自然種，即鵝掌楸L.chinense和北美鵝掌楸L.tulipifera。鵝掌楸屬植物為基部被子植物，在植物系統(tǒng)發(fā)生中處于關鍵位置，因此其進化關系、花器官特征、花發(fā)育調控一直是研究的熱點[23-30]。YABBY家族對花早期發(fā)育、心皮、雄蕊、蜜腺等花器官發(fā)育調控均發(fā)揮重要作用，因此對鵝掌楸屬植物YABBY基因進行分析研究是非常必要的。而且相比其他物種，目前在鵝掌楸屬植物中關于YABBY基因家族的鑒定與功能研究很少?；诖?，本研究基于鵝掌楸基因組和北美鵝掌楸轉錄組數據，擬開展北美鵝掌楸YABBY家族的生物信息學分析，并對其中的差異表達基因進行克隆和表達分析，以期為進一步闡明北美鵝掌楸YABBY的功能打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究所用植物材料為北美鵝掌楸（種源為佐治亞），來自于江蘇省句容市南京林業(yè)大學下蜀實習林場的鵝掌楸屬種源試驗林，地理位置119°14′E，31°59′N。試驗林營建于1993年，試驗林內樹木均已成年。采集北美鵝掌楸根、莖、葉、花瓣、萼片、雄蕊和雌蕊組織，做好標記，迅速置于液氮中，帶回實驗室于超低溫冰箱中-80℃下保存。亞細胞定位材料為本實驗室保存的本氏煙草Nicotiana benthamiana，pBI121-eGFP表達載體和P19輔助載體為本實驗室保存的載體。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成

總RNA提取、完整性和濃度檢測參考天根生化科技有限公司離心柱型多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的說明書進行。按照PrimeScript RT Master Mix (Perfect real time)反轉錄試劑盒（寶日醫(yī)生物科技有限公司）的步驟獲得cDNA。

以反轉錄獲得cDNA作為克隆目的基因中間片段的模板，根據北美鵝掌楸RNA-seq數據中LtYABBY1,5序列，使用Oligo7軟件設計引物，引物序列見表1。配制50 μL反應體系：2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix (10 mmol/L each)1 μL，cDNA模板2 μL，引物F/R各2 μL，Phanta Max Super-Fridelity DNA Polymerase 1 μL，ddH2O補足至50 μL，冰上操作，反應程序為：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸60 s/kb，35個循環(huán)；72℃徹底延伸5 min。目的片段的切膠回收和連接轉化參照EasyPure Quick Gel Extraction Kit試劑盒和pEASY-Blunt Cloning Kit克隆載體試劑盒的說明書進行。挑選片段大小正確的克隆送至上海杰李生物技術有限公司測序，使用BioXM 2.6軟件和NCBI網站比對分析測序結果。

表1 擴增PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR reactions

1.2.2 北美鵝掌楸LtYABBY1/5基因全長擴增

3′RACE和5′RACE PCR擴增分別按照3′-Full RACE Core Set with PrimeScrip RTase Kit和SMARTer RACE5′/3′ Kit試劑盒進行，采用巢式PCR反應法，引物見表1。將3′RACE和5′RACE Inner PCR擴增產物進行凝膠電泳，并切膠回收PCR產物，連接、轉化、克隆檢測、測序及序列比對分析與1.2.1相同。

隨后，將中間片段、3′RACE和5′RACE擴增得到的序列通過BioXM 2.6軟件進行序列拼接，最終得到LtYABBY1/5基因的全長。將全長序列于NCBI數據庫中的ORF Finder網站進行在線預測開放閱讀框（Open reading frame, ORF），根據預測的ORF設計引物，驗證完整性，引物見表1。其中，LtYABBY5在中間片段擴增時已經獲得完整ORF，且測序正確，因此不需再進行ORF驗證試驗。將驗證后的ORF于NCBI數據庫中的BLAST Protein進行蛋白序列比對，結合比對結果、其他物種的序列以及保守結構域，對目的基因進行命名。

1.2.3 基因生物信息學分析

基因家族的生物信息學分析主要參考付鴻博等[31]所用的方法和軟件。通過ExPASy ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）、ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/） 和SignalP-5.0 Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）在線分析蛋白化學性質、疏水性和信號肽；通過TMpred（http://sbcb.bioch.ox.ac.uk/TM_noj/TM_noj.html） 和TMHMM（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）在線分析蛋白跨膜區(qū)；通過SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html） 和SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/）在線預測分析蛋白的二級結構和三級結構；蛋白亞細胞定位通 過TargetP1.1 Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TargetP-1.1） 和WOLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）在線軟件預測；通過Motif Scan（https://myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan）在線分析蛋白的結構域；通過DNAMAN軟件進行蛋白同源性比對分析，使用MEGA 10軟件構建進化樹。

1.2.4 實時熒光定量PCR

以北美鵝掌楸的根、莖、葉、花芽、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊共8個組織的cDNA為模板，檢測YABBY1,5基因的組織特異性表達。首先，使用20 μL體系驗證引物的特異性擴增：2×Taq Master Mix 10 μL，引物F/R各1 μL，cDNA模板50 ng，ddH2O補足至20 μL。熱循環(huán)程序：94℃，5 min；94℃，30 s，60℃，30 s，72℃，30 s，35個循環(huán)；72℃，7 min。RT-qPCR試驗參照TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)試劑盒操作，配制10 μL反應體系，每個樣品設置3個重復，使用ABI Step one plus 熱循環(huán)儀，設置熱循環(huán)程序：95℃，1 min；95℃，5 s，60℃，34 s，40個循環(huán)；溶解曲線為95℃，15 s，60℃，1 min，95℃，15 s。以LcActin97作為內參基因，使用相對定量表達法2-ΔΔCT計算基因的相對表達量，并用ORIGIN軟件進行數據分析和繪圖。該部分試驗步驟、分析方法參考文獻[32]。

1.2.5 亞細胞定位表達載體質粒構建

通用引物檢測pBI121-eGFP載體（表1），隨后，按照高純質粒DNA提取試劑盒說明書進行提取質粒。載體的酶切位點分別為XbaI、BamHI，體系為50 μL：10×QuickCut Buffer 5 μL，質 粒DNA 1 μg，XbaI/BamHI各1 μL，ddH2O補足至50 μL，37℃下反應30 min，80℃下酶失活20 min。

使用CE Design軟件分別設計LtYABBY1,5基因的雙酶切引物（表1），進行PCR擴增，獲得酶切產物。將pBI121-eGFP載體質粒酶切產物與目的片段酶切DNA重組，配制20 μL反應體系：線性化載體長度×0.02 ng，插入片段片段長度×0.04 ng，ExnaseⅡ 2 μL，5×CEⅡ Buffer 4 μL，ddH2O補足至20 μL，37℃ PCR反應30 min。取10 μL重組產物轉化、菌落檢測，將測序正確、無變異位點的質粒于-20℃下存放備用。

1.2.6 瞬時轉化煙草及亞細胞定位觀察

取5 μL重組質粒加入100 μL剛融化的農桿菌感受態(tài)細胞GV3101，輕彈混勻，置于冰中20 min，液氮中速凍1 min，37℃下熱激5 min，冰上冰浴5 min，加入250 μL LB培養(yǎng)基，28℃，200 rpm孵育4 h，涂于含Kan抗生素的LB平板28℃下培養(yǎng)48 h。

選擇單克隆菌落進行PCR檢測，陽性克隆即為構建完成的瞬時表達載體。將瞬時表達載體、陽性對照空載體及輔助載體P19分別于雙抗（Kan和利福平抗生素）LB培養(yǎng)基中，28℃，200 rpm培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，4℃，5 000 rpm離心5 min，收集菌體，加入相同體積的緩沖液重懸，將瞬時表達載體與輔助載體P19按體積1∶1混合，暗培養(yǎng)2～3 h。用注射器將浸染液注射至本氏煙草葉片背面，暗培養(yǎng)8 h，光照培養(yǎng)2～3 d。剪下約0.3 cm×0.3 cm左右大小的葉盤，加入DAPI核染料進行核染色，約10～15 min，放于載玻片上，葉片背面向上，滴入超純水，蓋上載玻片。于激光共聚焦顯微鏡（LSM710）下觀察蛋白亞細胞定位結果。

2 結果與分析

2.1 北美鵝掌楸YABB Y家族分析

在北美鵝掌楸的花蜜腺轉錄組中共發(fā)現YABBY家族成員6個，經過蛋白家族數據庫（Protein family, PFAM）（Pfam: PF04690）、保守結構域數據庫（Conserved domain database,CDD）和基序序列預測（Multiple Em for Motif Elicitation, MEME）網站的分析，發(fā)現其中一個序列（Lchi07520）的結構域不完整，故將其刪除，對剩余5個YABBY家族成員進行后續(xù)分析。5個基因編碼的蛋白序列長度為164～212 aa，外顯子數量為6～7個。Lchi28144僅有6個外顯子，其編碼的氨基酸長度僅為164個，比其他成員短（表2），因此推測該基因編碼區(qū)部分缺失。根據Nr數據庫預測結果，他們可能屬于YABBY1/FIL、YABBY2和YABBY5亞族。

表2 北美鵝掌楸YABBY家族基因概況Table 2 Identification of the YABBY family genes based on the RNA-seq and genome data of L.tulipifera

獲得北美鵝掌楸YABBY家族成員的氨基酸序列后，對其進行序列比對。并在Plant TFDB數據庫（Plant transcription factors database）下載擬南芥YABBY家族成員的氨基酸序列，構建系統(tǒng)進化樹，為北美鵝掌楸YABBY家族成員命名及分類提供依據。由序列比對結果可知，Lchi28144基因在5′端序列缺失22 aa，這也解釋了該基因外顯子個數比其他成員少1個，說明北美鵝掌楸YABBY家族成員的外顯子數量和長度是比較保守的，外顯子均為7個（圖1A）。擬南芥的YABBY家族共6個成員，根據系統(tǒng)進化樹結果表明，Lchi01041和Lchi01043屬 于YABBY5亞 族，Lchi28144屬于YABBY2亞 族，Lchi23476和Lchi24373屬 于YABBY1/FIL亞族（圖1B）。

圖1 北美鵝掌楸YABBY家族氨基酸序列比對（A）及系統(tǒng)進化樹構建（B）Fig.1 Alignment of the CDS sequences (A) and the phylogenetic tree of YABBY proteins of L.tulipifera and A.thaliana (B)

北美鵝掌楸YABBY家族的保守結構域和Motif分析是在CDD和MEME網站進行，將結果文件導出后使用TB tools進行后續(xù)分析和繪圖。保守結構域預測結果顯示，5個成員均屬于YABBY家族（圖2A—B）。Motif分析結果顯示5個成員均含有Motif1和Motif3，Lchi28144的5′端無Motif2，推測由于序列不全導致。同一亞族的基因結構相似，如Lchi23476和Lchi24373結構相似，但與其他亞族基因結構不同。Motif2代表C2C2鋅指結構域的主要序列，Motif1代表YABBY結構域的主要序列（圖2C）。

圖2 北美鵝掌楸YABBY家族進化樹（A）及結構域和基序分析（B, C）Fig.2 Phylogenetic trees (A), distribution of conserved domains and motifs (B, C) of YABBY proteins in L.tulipifera

2.2 北美鵝掌楸YABBY1,5基因全長克隆

根據北美鵝掌楸轉錄組數據中的表達量，選擇2個差異表達顯著的YABBY家族基因進行 克 隆：Lchi23476（LtYABBY1）和Lchi01041（LtYABBY5），獲得全長并分析蛋白的理化性質。在擴增LtYABBY5基因的中間片段時，已獲得完整ORF序列且序列正確，因此無須再進ORF驗證試驗（圖1）。

LtYABBY1和LtYABBY5基因全長為1 255和1 078 bp，ORF分 別 為633和558 bp，分 別 編碼了210和185 aa。2個蛋白均為親水性蛋白，LtYABBY1蛋白總分子式為C1031H1613N295O307S9，分子量為23 341.48 Da，理論等電點為7.14，疏水性平均值為-0.312。LtYABBY5蛋白總分子式為C913H1439N261O273S14，分子量為20 888.89 Da，理論等電點為8.13，疏水性平均值為-0.295。

2.3 北美鵝掌楸YABBY1,5基因生物信息學分析

采用ProtScale在線軟件分析北美鵝掌楸YABBY蛋白疏水性，結果顯示LtYABBY1、LtYABBY5均為親水蛋白（圖2A）。分別通過ExPASy TMpred和TMHMM在線分析2個蛋白的跨膜區(qū)、跨膜方向，ExPASy TMpred結果表明，預測LtYABBY1、LtYABBY5均具有1個跨膜區(qū)，但TMHMM預測結果顯示，2個YABBY蛋白無跨膜區(qū)域。結合二者結果，北美鵝掌楸LtYABBY1、LtYABBY5為非跨膜蛋白（圖2B—C）。

登錄SOPMA和SWISS-MODEL網站在線預測YABBY蛋白質的二級和三級結構。YABBY1蛋白的α螺旋占22.86%，延伸鏈占11.90%，β轉角占4.29%，無規(guī)則卷曲占60.95%。YABBY5蛋白的α螺旋占24.32%，延伸鏈占17.30%，β轉角占5.41%，無規(guī)則卷曲占52.97%。

采用在線軟件SignalP-4.0 Server預測蛋白的信號肽，發(fā)現北美鵝掌楸的2個YABBY蛋白均不含信號肽及切割位點。蛋白亞細胞定位通過TargetP1.1 Server和WOLF PSORT在線軟件預測，預測LtYABBY1亞細胞定位結果為細胞核，LtYABBY5則是在細胞核、胞溶酶體等細胞器中均有定位，需要結合亞細胞定位試驗來驗證預測的結果（表3～4）。

表3 北美鵝掌楸YABBY蛋白亞細胞定位預測分析（TargetP1.1 Serve）Table 3 Prediction of the subcellular localization of YABBY proteins by the TargetP1.1 Serve online software %

表4 北美鵝掌楸YABBY蛋白亞細胞定位預測分析（WOLF PSORT）Table 4 Prediction of YABBY protein subcellular localization by WOLF PSORT online software

共下載14個與LtYABBY1同源性較高的蛋白序列，分別為麻雀花ArCRC（Aristolochia ringens，QKK36214.1）、沉水樟CmYABBY4（RWR87502.1）、蠟梅CpFIL（Chimonanthus praecox，AYO86708.1）、蓮NnYABBY4（XP_010264212.1）、橡膠樹HbYABBY1、HbYABBY4（XP_021635450.1、XP_021666324.1）、 葡 萄VvYABBY4（XP_002266233.1）、 木 薯MeYABBY1（XP_021622938.1）、可可樹TcYABBY1（Theobroma cacao，XP_007039924.1）、河岸葡萄VrYABBY1（XP_034702735.1）、黃麻CcYABBY（Corchorus capsularis，OMP02209.1）、博落回McYABBY（OVA06720.1）、開 心 果PvYABBY1（Pistacia vera，XP_031267772.1）、雷蒙德氏棉GrYABBY1（XP_012439507.1），他們之間的同源性高達88.21%。15個與LtYABBY5同源性較高的蛋白序列，分別為葡萄VvYABBY5（XP_002285328.1）、蠟梅CpYABBY5-1（AYO86711.1）、蓮NnYABBY 5（XP_010254434.1、XP_010250140.1、XP_010250138.1、XP_010250139.1）、 木 薯MeYABBY5（XP_021634503.1）、 沉水樟CmYABBY5（RWR77395.1）、哥倫比亞錦葵HuYABBY5（XP_021275879.1）、黃麻CcYABBY（OMO81141.1）、可可樹TcYABBY（EOY31098.1、XP_007013479.2）、 榴 蓮DzYABBY5（Durio zibethinus，XP_022730873.1）、麻風樹JcYABBY5（XP_012078813.1）、橡膠樹HbYABBY5（XP_021650878.1），他們的同源性達81.34%。LtYABBY1和LtYABBY5蛋白均具有完整的C2C2鋅指結構域（C-X2-C-X20-C-X1-H-C）和YABBY結構域（圖3A—B）。

圖3 北美鵝掌楸YABBY蛋白的氨基酸序列比對Fig.3 Multiple alignment of the amino acid sequences of LtYABBY with other YABBY proteins

將北美鵝掌楸YABBY1,5蛋白與同源性較高的蛋白、擬南芥6個成員進行進化樹構建，共31個蛋白序列（圖4）。結果顯示，LtYABBY1與麻雀花、蠟梅、沉水樟親緣關系較近，LtYABBY5與蓮、蠟梅、沉水樟的YABBY5蛋白親緣關系較近。

圖4 北美鵝掌楸YABBY蛋白的進化樹構建Fig.4 Construction of the phylogenetic tree of LtYABBY with other YABBY proteins

2.4 組織表達特異性分析

對北美鵝掌楸LtYABBY1,5基因進行半定量PCR分析，其中，LtYABBY1基因在葉片、花芽、萼片和雌蕊中均有較亮條帶，而LtYABBY5基因僅在根和莖中無條帶，在其他6個組織中均有表達（圖5A）。實時熒光定量PCR結果表明，LtYABBY1基因整體表達水平較高，尤其在花芽和雌蕊中大量表達，葉片和萼片中表達水平也較高，與半定量PCR結果一致，在花瓣中也有一定表達，莖次之；LtYABBY5基因整體表達水平較低，在葉片、花芽、雌蕊和萼片中均有少量表達（圖5B）。

圖5 北美鵝掌楸YABBY-like基因在不同組織中的表達量Fig.5 Detection of the expression of YABBY-like genes of L.tulipifera in different tissues

2.5 LtYABBY1,5亞細胞定位分析

亞細胞定位采用注射本氏煙草葉片的瞬時轉化表達法，取注射后的葉片于載玻片上，葉背面朝上，置于激光共聚焦顯微鏡下拍攝。根據北美鵝掌楸YABBY蛋白的亞細胞定位預測結果，推測LtYABBY1,5蛋白為核定位，因此對注射后的煙草葉片進行DAPI染色，觀察時共使用5個通道，分別為DAPI、GFP自發(fā)熒光、明場Bright field、葉綠素熒光Chlorophyll和疊加場Merged。pBI121-eGFP為空載陽性對照，在細胞膜、細胞核、葉綠體等細胞器均可看到其熒光。LtYABBY1,5蛋白僅在細胞核上檢測到熒光信號，二者為核定位蛋白（圖6）。

圖6 北美鵝掌楸YABBY1,5蛋白的亞細胞定位Fig.6 The subcellular localization of LtYABBY1 and LtYABBY5 proteins

3 討 論

北美鵝掌楸中共鑒定到6個YABBY成員，屬于YABBY1/FILAMENTOUS FLOWER (FIL)、YABBY2、YABBY5共3個亞族，說明本物種中YABBY家族沒有發(fā)生基因擴張。LtYABBYs基因編碼了164～212個氨基酸，與前人研究發(fā)現YABBY蛋白較小的結果一致。預測亞細胞定位于細胞核，符合轉錄因子的特性。外顯子數量為7個，與已有研究的物種相似，說明YABBY家族的結構較為保守，推測功能也相對保守。

與擬南芥的5個亞族相比，北美鵝掌楸缺失CRC、INO亞族，二者均為花特異性YABBY基因，主要參與植物胚珠、心皮的發(fā)育調控[9-10]。CRC是在擬南芥中識別的首個與蜜腺發(fā)育密切相關的關鍵基因，crc突變體的蜜腺缺失，心皮不融合，果莢變粗變短[4,9]。水稻OsDL基因是AtCRC的同系物，其功能得到了深入研究，參與水稻花器官、葉片和芒的發(fā)育，dl突變體會導致心皮發(fā)育成雄蕊，葉片不能形成中脈[33]。毛茛目花菱草Eschscholtzia californica CRC同源基因在花發(fā)育的整個過程中表達，但在花開放期，僅在雌蕊中表達[34]?；勘蛔又参餆o油樟Amborella trichopoda的雌花中CRC同源基因的表達模式與其他被子植物中的表達模式相似，在雄花花絲中也鑒定出了AmbCRC轉錄本[35]。大多數木蘭類植物的CRC位于單子葉植物和雙子葉植物分支的基部，推測在單子葉植物和真雙子葉植物最近的共同祖先中可能發(fā)生重復事件，木蘭類植物與被子植物分離后CRC亞族發(fā)生了亞功能化和新功能化[36]。CRC亞族在心皮發(fā)育調控中的功能可能是被子植物中較原始的功能，其在蜜腺中的作用可能是進化而來[2]。本研究在北美鵝掌楸轉錄組和鵝掌楸的基因組數據中沒有識別到CRC亞族基因，推測可能與植物的進化過程相關。

北美鵝掌楸LtYABBY1在花芽和雌蕊中表達量極高，與水稻的YABBYs基因表達模式相似，說明北美鵝掌楸的YABBY1基因可能具有參與雌蕊形成和花器官發(fā)育的功能。綠竹Bambusa oldhamiiBoYAB1基因編碼167 aa，與水稻OsYABBY1的同源性為88.76%，異源表達分析和原位雜交結果表明，該基因可能參與了葉片發(fā)育和開花時間的調控[37]。玉米YABBY家族的ZmYAB1/12是水稻OsDL的同源基因，其表達具有明顯的組織特異性，除了ZmYAB1不在雌穗表達外，其余成員在生殖器官中的表達量均明顯高于營養(yǎng)器官。ZmYAB5/7/9/13基因整體表達水平比較高，而ZmYAB3/4/8基因則幾乎不表達[12]。北美鵝掌楸LtYABBY1基因整體表達水平較高，尤其是在繁殖器官花芽、雌蕊中大量表達。而LtYABBY5基因整體表達水平較低，與玉米的表達模式不同，具有物種特異性，不同植物間表達模式明顯不同，但在繁殖器官表達量是高于營養(yǎng)器官的。通過研究木蘭類植物的YABBY家族發(fā)現YABBY5不是雙子葉植物所特有的，在7個木蘭類植物中鑒別到22個YABBY5基因，說明YABBY5基因存在于基部被子植物、木蘭類植物和真雙子葉植物中，YABBY基因可能是來源于早期被子植物的YABBY5基因[36]。番茄SlYABBY5基因編碼182 aa，預測定位于細胞核，結果初步證實SlYABBY5參與番茄的生長發(fā)育和響應非生物逆境脅迫[38]。小麥的YABBY家族成員在根中表達量偏低或不表達，在穗部和籽粒中的表達量高于其余組織，TaYAB1/2/6在穗部的表達量隨時間推移逐漸上升，TaYAB3/4/5在穗部的表達量隨時間推移呈下降趨勢[21]。小麥與北美鵝掌楸的YABBY基因表達模式有相似的地方，在營養(yǎng)器官中低表達。水稻的YABBY7主要在雌蕊中特異性表達，這表明YABBY7可能參與調控雌蕊的形成，YABBY1/2/6主要在花、葉鞘和胚乳中表達，YABBY3/4/5也主要在花器官和胚胎中表達[20]。以上研究結果表明，被子植物中YABBY家族成員的結構和功能比較保守，但在進化過程中基因也表現出了結構和功能的多樣性。

本研究中北美鵝掌楸共鑒定到6個YABBY成員，僅克隆和分析了其中2個基因，其他成員未進行進一步分析。經過分析發(fā)現LtYABBY1在花芽中特異表達，推測該基因可能參與了北美鵝掌楸花芽的早期分生組織的發(fā)育調控，但是后續(xù)功能驗證試驗尚未開展。北美鵝掌楸為蜜源植物，花蜜量豐富，目前已鑒定到YABBY家族的CRC基因對蜜腺發(fā)育極其重要，但卻未在北美鵝掌楸轉錄組中發(fā)現該成員，原因仍需要進一步分析。下一步研究工作將繼續(xù)對YABBY家族成員進行分析、鑒定和功能分析，以期為北美鵝掌楸發(fā)育調控提供理論支持。

4 結 論

北美鵝掌楸YABBY家族共6個成員，編碼了164～212 aa，外顯子7個，屬于YABBY1/FILAMENTOUS FLOWER (FIL)、YABBY2、YABBY5共3個亞類?？寺tYABBY1,5基因的全長1 255、1 078 bp，分別編碼了210、188 aa，均為親水蛋白與非跨膜蛋白。LtYABBY1和LtYABBY5為核定位蛋白。LtYABBY1在北美鵝掌楸的花芽和雌蕊高表達，LtYABBY5整體表達水平較低，據此推測LtYABBY1可能參與了北美鵝掌楸花芽的早期分生組織的發(fā)育調控。