蔣樹云，馬德壽，馬志軍

（1.青海大學(xué)研究生院，青海 西寧 810016； 2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤外科，青海 西寧 810001）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居我國女性惡性腫瘤首位[1]。探究乳腺癌發(fā)病的分子機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。R-spondins也稱為特異性頂部盤狀底板反應(yīng)蛋白（RSPO），是近期發(fā)現(xiàn)的一種分泌蛋白質(zhì)家族，存在于所有脊椎動物中，在機(jī)體的發(fā)育、血管形成等方面扮演重要角色[2]，近期研究表明，該蛋白家族在包括乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-5]。因此，本文深入研究RSPO在乳腺癌中發(fā)揮的功能及相關(guān)發(fā)病機(jī)制，為乳腺癌的精準(zhǔn)治療、預(yù)后評估等提供新的方向。

1 RSPO的結(jié)構(gòu)和功能

RSPO是由凝血酶刺激的血小板中分離出的一種新型分泌蛋白質(zhì)家族，由4種蛋白成員（RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4）組成，相互之間有40%～60%的氨基酸相似性，共有4個主要的功能區(qū)：N端為一段富含疏水氨基酸的分泌信號肽，其次為兩段富含半胱氨酸的Furin樣蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，緊跟一段血栓反應(yīng)蛋白1型重復(fù)結(jié)構(gòu)域（thrombo spondin1 repeats, TSR1），C端為一段可變長度的富含堿性氨基酸的結(jié)構(gòu)域（basic amino acidrich, BR）。其中Furin樣1結(jié)構(gòu)域和Furin樣2結(jié)構(gòu)域分別與鋅環(huán)指蛋白3/E3泛素連接酶-環(huán)指蛋白43（zinc and ring finger 3/ring finger protein 43, ZNRF3/RNF43）和富含亮氨酸的G蛋白偶聯(lián)受體（leucine-rich repeat G protein-coupled receptors4-6,LGR4-6）相結(jié)合，RSPO-LGR（LGR4-6）構(gòu)成了一個配體-受體系統(tǒng)，與ZNRF3/RNF43結(jié)合形成穩(wěn)定三元復(fù)合物進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，避免卷曲跨膜受體（Frizzled, FZD）的降解從而激活Wnt通路[6-8]。Furin樣結(jié)構(gòu)域是RSPO激活Wnt/β-catenin信號通路充分且必要的條件，并決定著RSPO的活性強(qiáng)度[8-9]。

前期研究[10]表明，激素受體陽性的乳腺管腔細(xì)胞分泌的RSPO1在核因子κB受體協(xié)同作用下，通過活化Wnt通路而促進(jìn)小鼠乳腺的發(fā)育；而在雌激素受體陰性的管腔細(xì)胞分泌的雙調(diào)蛋白可通過誘導(dǎo)RSPO1的表達(dá)，形成雌激素-雙調(diào)蛋白-RSPO1的調(diào)節(jié)軸，為乳腺的發(fā)育提供了特殊的調(diào)控模式[11]。此外，卵巢激素可通過調(diào)節(jié)RSPO1和Wnt4的協(xié)同作用促進(jìn)乳腺上皮干細(xì)胞（mammary stem cell, MaSC）的自我更新和再生能力，這為體外培養(yǎng)擴(kuò)增MaSC并保持其特性提供了一種可能[12]。在性腺分化階段，RSPO1的缺失會導(dǎo)致部分性反轉(zhuǎn)表型從而出現(xiàn)性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象，因此RSPO1的存在對調(diào)控性別差異是十分必要的[7]。而RSPO3通過調(diào)控Wnt通路、促進(jìn)血管母細(xì)胞的分化等途徑調(diào)節(jié)造血細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞分化之間的平衡，在血管生成和胚胎發(fā)育方面發(fā)揮重要功能[7，13]。此外，正常乳腺間質(zhì)和小鼠乳腺的基底干細(xì)胞富集區(qū)均發(fā)現(xiàn)了RSPO3的表達(dá)，提示其可能參與正常乳腺的發(fā)育，抑制乳腺腔室的分化[14]。RSPO2和RSPO4在正常乳腺中的研究尚未見報道，有報道[7]稱RSPO2可通過Wnt通路促進(jìn)胚胎肌肉、呼吸道及毛囊的發(fā)育，而RSPO4被認(rèn)為在指甲形態(tài)的發(fā)育中扮演重要角色。

2 RSPO受體LGR4-6的結(jié)構(gòu)及功能

作為RSPO高親和力的細(xì)胞膜受體，LGR4-6屬于LGR家族中的B型受體，由長達(dá)17個富含亮氨酸基序列的結(jié)構(gòu)域，以及氮端的富含亮氨酸基序列和碳端的富含亮氨酸基序列構(gòu)成[15]。LGR4-6因在促進(jìn)胚胎發(fā)育、維持成人組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要功能而受到關(guān)注[16]。近期研究[17]表明，LGR4-6也參與乳腺的生長發(fā)育，LGR4缺失的小鼠表現(xiàn)為乳腺發(fā)育遲緩、乳腺導(dǎo)管分支減少及MaSC增殖能力降低的特點(diǎn)。利用3D成像等技術(shù)觀察到LGR5在管腔細(xì)胞和基底細(xì)胞中可促進(jìn)乳腺腺泡的形成，其在乳腺移植后的機(jī)體內(nèi)能有效地重建乳房[18-19]。而在妊娠狀態(tài)下，LGR6與其配體結(jié)合后通過增強(qiáng)腺泡細(xì)胞的增殖能力從而促進(jìn)乳腺腺泡發(fā)育[20]?？傊?，上述研究表明，LGR4-6通過與其配體RSPO結(jié)合后在乳腺發(fā)育的不同階段發(fā)揮特殊的動態(tài)調(diào)控功能。

3 RSPO在乳腺癌中的表達(dá)

目前研究提示，RSPO在乳腺癌組織中的表達(dá)特征不盡一致。有研究[21]結(jié)果表明，RSPO1在孕激素受體陽性的乳腺癌組織中表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步分析提示其水平與患者無病生存期顯著相關(guān)，可作為浸潤性導(dǎo)管癌獨(dú)立的預(yù)后因子。COUSSY等[4]在446例乳腺癌包括三陰性乳腺癌（triplenegative breast cancer, TNBC）和化生性乳腺癌（metaplastic breast cancer, MBC）中檢測RSPO的結(jié)果表明，與癌周組織比較，RSPO2和RSPO4在癌組織中的表達(dá)明顯升高，尤其在TNBC和MBC中表達(dá)更加顯著，而RSPO1和RSPO3的表達(dá)卻無明顯差別；此外，其相關(guān)受體LGR4-6也呈高表達(dá)狀態(tài)，且主要以LGR4為主；CONBOY等[22]研究也提示，RSPO2在乳腺癌中呈高表達(dá)，進(jìn)一步分析表明，其在基底細(xì)胞樣型和HER-2過表達(dá)型中表達(dá)更為顯著；而TOCCI等[14]研究結(jié)果卻表明，RSPO3及其相關(guān)受體LGR4-6、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在基底細(xì)胞樣亞型的乳腺癌中呈顯著高表達(dá)，且3者的水平呈明顯的正相關(guān)；此外，筆者也運(yùn)用癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas, TCGA）數(shù)據(jù)庫檢索了RSPO在乳腺癌組織中的表達(dá)特征，與癌旁組織相比，RSPO2和RSPO4在乳腺癌中呈高表達(dá)，而RSPO1和RSPO3卻呈低表達(dá)（見圖1）。進(jìn)一步分析RSPO在乳腺癌各分子亞型中的表達(dá)特征顯示：RSPO2和RSPO4在基底細(xì)胞樣型中的表達(dá)顯著升高，而RSPO1和RSPO3在各分子亞型中的水平較癌旁組織明顯降低，尤其在基底細(xì)胞樣型中更為顯著，推測其在乳腺癌中可能作為一種潛在的抑癌基因（見圖2）。然而該數(shù)據(jù)庫部分結(jié)果與上述研究結(jié)果不盡一致，如RSPO1雖在孕激素受體陽性的乳腺癌中升高，但TCGA數(shù)據(jù)庫卻顯示其在乳腺癌中呈低表達(dá)，分析其原因可能與以下幾點(diǎn)相關(guān)：①鑒于腫瘤的時間、空間異質(zhì)性，使所取組織可能由于分子水平層面的不同，導(dǎo)致檢測結(jié)果的差異性；②RSPO與相關(guān)受體結(jié)合后的檢測不能反映其真實的表達(dá)水平[23]；③研究中使用的檢測方法、儀器設(shè)備、試劑等差異也可能導(dǎo)致RSPO檢測結(jié)果不一致。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中RSPO在乳腺癌中的表達(dá)特征 （±s）

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中RSPO在各乳腺癌分子亞型中的表達(dá) （±s）

4 RSPO在乳腺癌中的功能

RSPO作為一種新型分泌蛋白質(zhì)家族，其成員不僅在維持乳腺的生長發(fā)育中發(fā)揮重要的生理功能，而且其表達(dá)失調(diào)時還與乳腺癌的發(fā)展演進(jìn)相關(guān)。KLAUZINSKA等[24]在小鼠乳腺腫瘤病毒（mouse mammary tumor virus, MMTV）誘導(dǎo)的小鼠乳腺腫瘤中發(fā)現(xiàn)RSPO2可作為一個MMTV新的共同整合位點(diǎn)，在HC11細(xì)胞中RSPO2過表達(dá)或與Wnt1共表達(dá)都會產(chǎn)生紡錘形的惡性細(xì)胞漩渦繼而在小鼠體內(nèi)形成腫瘤，當(dāng)RSPO2和Wnt1共表達(dá)時則顯著增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力，并表現(xiàn)出強(qiáng)烈的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）樣特征并易轉(zhuǎn)移到肺和脾臟。此外，在乳腺癌細(xì)胞中RSPO2-LGR4通過調(diào)控Dickkopf-1相關(guān)蛋白的分泌而建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移前的微環(huán)境，繼而促進(jìn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的進(jìn)程[25]；而COUSSY等[4]報道進(jìn)一步表明，RSPO2的表達(dá)量與乳腺癌患者的無轉(zhuǎn)移生存期呈負(fù)相關(guān)，提示其也許可作為一種潛在的預(yù)后指標(biāo)；THEODOROU等[26]研究顯示，RSPO3在P53缺失的乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)升高且有明顯的致癌作用；TOCCI等[14]在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)RSPO3可誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell, CSC）和EMT相關(guān)基因如波形蛋白和纖維鏈接蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移；TER等[27]研究也表明，高表達(dá)RSPO3的乳腺癌組織分化程度更低、侵襲能力更強(qiáng)。上述部分研究提示RSPO3在乳腺癌組織中呈高表達(dá)并發(fā)揮促癌作用，這與上述生物信息學(xué)提示的其可能作為潛在抑癌基因的結(jié)論相反，因此推測RSPO在腫瘤中發(fā)揮的功能可能具有組織和細(xì)胞特異性，如miR-155在肺癌中被認(rèn)為是促癌基因[28]，而在胃癌中卻發(fā)揮抑癌功能[29]；COUSSY等[4]研究進(jìn)一步表明，RSPO4與乳腺癌的病理組織分級、雌激素受體狀態(tài)和TNBC亞型密切相關(guān)，過表達(dá)RSPO4可通過增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞中β-catenin、軸抑制蛋白2的表達(dá)而激活Wnt通路，繼而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展演進(jìn)。針對上述具有促癌特征的RSPO，通過研發(fā)相應(yīng)的靶向藥物抑制其表達(dá)，可為乳腺癌的精準(zhǔn)治療提供參考。

5 RSPO在乳腺癌中的調(diào)控機(jī)制

5.1 RSPO與Wnt通路

Wnt/β-catenin通路的過度活化是腫瘤發(fā)生發(fā)展的經(jīng)典機(jī)制之一，Wnt配體通過結(jié)合FZD和低密度脂蛋白相關(guān)蛋白5或6（lipoprotein-related protein5/6, LRP5/6）而誘導(dǎo)胞質(zhì)、多蛋白破壞復(fù)合物釋放出β-catenin蛋白來激活Wnt通路[30]。前期研究表明，β-catenin蛋白在乳腺癌細(xì)胞中的累積導(dǎo)致Wnt信號頻繁被激活可能是乳腺癌發(fā)生的機(jī)制之一[31]。但最近的研究結(jié)果卻表明乳腺癌中Wnt通路的異常激活不一定依賴β-catenin蛋白的累積[30]，分析可能存在激活Wnt通路的其他途徑。

TOCCI等[30]研究表明，RSPO結(jié)合受體LGR4-6并誘導(dǎo)結(jié)合ZNRF3/RNF43的自泛素化和膜清除，促使細(xì)胞膜表面的FZD累積，繼而激活經(jīng)典的Wnt信號通路（圖3-①），而在一些LGR（LGR4-6）低表達(dá)或不表達(dá)的細(xì)胞中，RSPO可通過TSR結(jié)構(gòu)域或BR結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞膜外的硫酸肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans, HSPG）的相互作用（圖3-②），為ZNRF3/RNF43提供一條不依賴于LGR的通路，分析HSPG很可能是RSPO的共受體，在促進(jìn)LGR低表達(dá)或不表達(dá)的乳腺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要功能[6，32]。其次，在清除了ZNRF3/RNF43的情況下，RSPO-LGR復(fù)合體還可通過招募GTP酶激活蛋白1（IQGAP1）（圖3-③），在清除了ZNRF3/RNF43的機(jī)制中增強(qiáng)Wnt通路活性[30，32]，從而使RSPO激活Wnt通路的作用形式更加豐富。綜上，在不依賴β-catenin蛋白累積的情況下，RSPO通過結(jié)合不同的受體或受體組合激活Wnt通路，繼而發(fā)揮促癌功能。然而RSPO在特定的環(huán)境下是如何選擇不同受體或受體組合激活Wnt通路的具體機(jī)制目前尚不明確，有必要開展進(jìn)一步的研究。

圖3 RSPO激活Wnt通路的新途徑 （圖片由Medpeer網(wǎng)站繪制）

5.2 RSPO受體LGR與乳腺癌

如前所述，LGR4-6參與調(diào)控不同階段乳腺的生長發(fā)育。而在乳腺癌中，YUE等[33]發(fā)現(xiàn)LGR4在癌組織中表達(dá)上調(diào)，其通過調(diào)節(jié)性別決定基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)維持乳腺癌CSC的功能，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和更新；而在細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制中，局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）與腫瘤細(xì)胞的黏附、擴(kuò)散密切相關(guān)，LGR4則通過FAK-類固醇受體輔助活化因子途徑協(xié)調(diào)肌動蛋白動力學(xué)調(diào)控機(jī)制從而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲、遷移；乳腺癌中高表達(dá)的LGR5主要通過蛋白激酶A激活β-catenin的活性，繼而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移并增加順鉑的耐藥性[34]。上述研究表明在乳腺癌組織中，異常表達(dá)的LGR可通過RSPO-LGR系統(tǒng)發(fā)揮促癌功能，還可通過單獨(dú)調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)參與腫瘤的進(jìn)展。如靶向抑制LGR的水平，也許在臨床上可發(fā)揮雙重抑制腫瘤的效果。

5.3 RSPO及其受體LGR介導(dǎo)EMT特征

EMT是上皮來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的關(guān)鍵步驟。有研究報道在高表達(dá)RSPO2的乳腺癌組織中檢測到間充質(zhì)蛋白標(biāo)志物，如波形蛋白、纖維連接蛋白、N-鈣黏蛋白等，而未發(fā)現(xiàn)上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白、細(xì)胞骨架角蛋白的表達(dá)，表現(xiàn)出與EMT一致的基因表達(dá)譜，使得腫瘤更易向周圍組織侵襲轉(zhuǎn)移[24]。體外實驗也表明，與rRSPO3共培養(yǎng)的乳腺細(xì)胞中，間充質(zhì)標(biāo)志物纖維連接蛋白和波形蛋白的表達(dá)顯著增加，而E-鈣黏蛋白減少，提示其可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT而發(fā)揮促癌作用[14]。此外，在MDA-MB-231細(xì)胞中，抑制LGR4的表達(dá)后EMT間充質(zhì)蛋白標(biāo)志物水平明顯減少，進(jìn)一步分析表明其通過誘導(dǎo)Wnt/β-catenin通路介導(dǎo)EMT發(fā)生[34]。鑒于EMT被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵病理過程，因此積極探索靶向調(diào)控誘導(dǎo)EMT發(fā)生的關(guān)鍵分子對乳腺癌的治療具有重大的意義。

6 結(jié)語與展望

乳腺癌的放化療由于嚴(yán)重的毒副反應(yīng)在臨床實踐中存在諸多限制。目前，個體化的精準(zhǔn)靶向治療已成為新型的腫瘤治療模式。作為一種新型的分泌蛋白質(zhì)家族，在生理狀態(tài)下RSPO不僅參與血管形成、促進(jìn)胚胎、乳腺等器官的發(fā)育；而在乳腺癌組織中，其表達(dá)出現(xiàn)顯著的失調(diào)，異常表達(dá)的RSPO與乳腺癌的分子亞型、預(yù)后等顯著相關(guān)；RSPO還與其受體LGR4-6在促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移、EMT發(fā)生、誘導(dǎo)CSCs的活性方面發(fā)揮重要的功能；此外，作為一種新型的Wnt通路激活因子，其可在不依賴β-catenin蛋白累積的條件下活化Wnt通路而發(fā)揮促癌功能。因此，針對RSPO及其受體在乳腺癌中的表達(dá)特征及發(fā)揮功能的機(jī)制，研制特定的靶向藥物或許能為乳腺癌的預(yù)后評估及精準(zhǔn)個體化治療提供新的策略。然而，目前關(guān)于RSPO在乳腺癌中研究結(jié)論還缺乏深入的臨床驗證，因此后續(xù)開展更多深層次的臨床研究是十分必要的。