劉凡，施文瑜，劉益飛，王國(guó)華

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院 1.腫瘤化療科，2.病理科，江蘇 南通 226001；3.南通大學(xué)特種研究所，江蘇 南通 226001）

三陰性乳腺癌占全部乳腺癌的10%～20%，侵襲性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移率高，且臨床治療機(jī)會(huì)和時(shí)間窗有限，術(shù)后易復(fù)發(fā)，生存率較低[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸且不具編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，但可調(diào)節(jié)mRNA、microRNA的活性和穩(wěn)定性，在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮作用，幾乎參與細(xì)胞的所有生理活動(dòng)，與膀胱癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)病和惡性進(jìn)展有關(guān)[2]。LncRNA-P21是P53依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄靶基因，參與細(xì)胞周期調(diào)控、代謝和重編程，與癌癥進(jìn)展相關(guān)[3]。MicroRNA-17-3p（miR-17-3p）是一種致癌microRNA。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-3p在多發(fā)性骨髓瘤中通過(guò)抑制LMLN基因下調(diào)P21表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞增殖[4]。本研究擬檢測(cè)三陰性乳腺癌組織中LncRNA-P21、miR-17-3p的表達(dá)，分析其與三陰性乳腺癌患者的臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為三陰性乳腺癌的治療和預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年1月—2017年5月南通大學(xué)附屬醫(yī)院收治的106例三陰性乳腺癌患者經(jīng)手術(shù)切除的癌組織和癌旁組織（距離癌組織至少5 cm）標(biāo)本及患者的臨床資料。年齡51～65歲，平均（55.23±7.31）歲；乳腺腫塊直徑0.62～3.56 cm，平均（2.58±0.34）cm；分化程度：低、中度分化65例，高度分化41例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期72例，Ⅲ期34例；腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，絕經(jīng)43例；細(xì)胞增殖指數(shù)Ki-67陽(yáng)性表達(dá)（≥ 30%）71例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理提示免疫組織化學(xué)染色雌激素受體、孕激素受體陰性，熒光原位雜交提示人表皮生長(zhǎng)因子受體2陰性，人表皮生長(zhǎng)因子受體2/Neu基因無(wú)擴(kuò)增；②病理資料完整，接受隨訪；③年齡≥ 18周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受化療、放療、免疫等任何形式的抗腫瘤治療；②術(shù)前已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或此次因復(fù)發(fā)再次住院治療的患者；③Luminal型、Her-2型、basal-like型等其他類(lèi)型乳腺癌。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[通大倫理（2018）20號(hào)]。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)LncRNAP21、miR-17-3p表達(dá)

取手術(shù)切除的癌組織和癌旁組織石蠟標(biāo)本，二甲苯脫蠟，無(wú)水乙醇脫二甲苯，選取100 mg勻漿研磨，離心棄上清液。TRIzol法（美國(guó)Invitrogen公司）提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)（美國(guó)NanoDrop公司）分別在260 nm和280 nm處檢測(cè)吸光度，260/280 nm吸光度比值為1.8～2.0，取該比值區(qū)間的RNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（美國(guó)Epicentre公司）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：15℃ 30 min，45℃ 30 min，85℃ 5 min 滅 活。CFX96實(shí)時(shí)熒光PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)LncRNA-P21、miR-17-3p表達(dá)，反應(yīng)體系： cDNA 1 μL，正反向引物0.4 μL，2×TransTaq?Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye（50×）0.4 μL，最后添加ddH2O至20 μL；反應(yīng)條件：50℃預(yù)變性2 min，97℃變性20 s，60℃退火20 s，70℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)：LncRNA-P21正向5'-CCACATTGCTGTTCATCAC C-3'，反 向5'-TGAGCAAGCTAGTGGAAGCA-3'，引物長(zhǎng)度20 bp；miR-17-3p正向5'-TGCGTTGACGTC ACTCCCG-3'，反 向5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'，引物長(zhǎng)度18 bp；U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCAC A-3'，反向5'-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，引 物長(zhǎng)度19 bp。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪

所有患者接受術(shù)后5年的電話或門(mén)診復(fù)查隨訪，統(tǒng)計(jì)無(wú)病生存期（DFS）、總生存期（OS）及預(yù)后。DFS定義為手術(shù)日至首次出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的時(shí)間，OS定義為手術(shù)日至或因疾病進(jìn)展或其他任何原因引起死亡的時(shí)間。無(wú)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡為預(yù)后良好，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡為預(yù)后不良。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；相關(guān)分析用Pearson法；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log rank χ2檢驗(yàn)；影響因素的分析用單因素或多因素Cox回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織和癌旁組織LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

癌組織與癌旁組織LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），癌組織LncRNA-P21 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織，癌組織miR-17-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織。見(jiàn)表1。

表1 癌組織和癌旁組織LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （n =106，±s）

表1 癌組織和癌旁組織LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （n =106，±s）

組別癌組織癌旁組織t 值P 值LncRNA-P21 mRNA 0.85±0.19 1.86±0.32 27.941 0.000 miR-17-3p mRNA 3.84±0.76 1.75±0.41 24.918 0.000

2.2 不同臨床病理特征三陰性乳腺癌組織LncRNA-P21和miR-17-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

不同臨床分期、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67表達(dá)三陰性乳腺癌組織LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；臨床Ⅲ期、有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67≥ 30%三陰性乳腺癌組織LncRNA-P21 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于臨床Ⅰ、Ⅱ期，無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ki-67＜ 30%；臨床Ⅲ期、有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67≥ 30%三陰性乳腺癌組織miR-17-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量高于臨床Ⅰ、Ⅱ期，無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ki-67＜30%。不同年齡、腫瘤直徑、分化程度、絕經(jīng)狀態(tài)LncRNAP21、miR-17-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同臨床病理特征三陰性乳腺癌組織LncRNA-P21和miR-17-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

表2 不同臨床病理特征三陰性乳腺癌組織LncRNA-P21和miR-17-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

臨床病理特征年齡≤ 60歲＞ 60歲腫瘤直徑≤ 2 cm＞ 2 cm分化程度低、中度高度臨床分期Ⅰ、Ⅱ期Ⅲ期腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無(wú)絕經(jīng)是否Ki-67≥ 30%＜ 30%n 63 43 48 58 65 41 72 34 31 75 43 63 71 35 LncRNA-P21 mRNA 0.84±0.14 0.87±0.13 0.88±0.12 0.83±0.14 0.84±0.13 0.87±0.12 0.91±0.09 0.72±0.06 0.77±0.08 0.88±0.12 0.88±0.11 0.83±0.16 0.79±0.13 0.97±0.07 t 值1.115 1.951 1.191 11.178 4.685 1.781 7.651 P 值0.268 0.054 0.236 0.000 0.000 0.078 0.000 miR-17-3p mRNA 3.81±0.79 3.89±0.62 3.76±0.69 3.91±0.58 3.93±0.52 3.70±0.80 3.67±0.29 4.21±0.33 4.42±0.18 3.60±0.21 3.90±0.70 3.80±0.79 4.12±0.44 3.27±0.18 t 值0.557 1.216 1.795 8.557 19.030 0.670 10.964 P 值0.579 0.227 0.076 0.000 0.000 0.505 0.000

2.3 LncRNA-P21與miR-17-3p的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，三陰性乳腺癌組織的LncRNA-P21表達(dá)與miR-17-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.570，P=0.000）。見(jiàn)圖1。

圖1 LncRNA-P21與miR-17-3p相關(guān)性的散點(diǎn)圖

2.4 不同LncRNA-P21、miR-17-3p表達(dá)三陰性乳腺癌患者的生存分析

隨訪期間，106例患者復(fù)發(fā)11例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移14例，死亡17例。以三陰性乳腺癌組織LncRNA-P21 mRNA相對(duì)表達(dá)量的均值0.85為臨界值，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組；LncRNA-P21低表達(dá)組的5年DFS、OS生存率低于LncRNA-P21高表達(dá)組（χ2=4.952和3.900，P=0.014和0.029）。以三陰性乳腺癌組織miR-17-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量的均值3.84為臨界值，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組；miR-17-3p高表達(dá)組的5年DFS、OS生存率低于miR-17-3p低表達(dá)組（χ2=4.782和3.873，P=0.019和0.031）。見(jiàn)圖2。

圖2 不同LncRNA-P21、miR-17-3p表達(dá)三陰性乳腺癌患者的生存曲線

2.5 影響三陰性乳腺癌患者預(yù)后的因素分析

以三陰性乳腺癌患者預(yù)后為因變量（0 =預(yù)后良好，1 =預(yù)后不良），以年齡（0 = ≤ 60歲，1 = ＞60歲）、腫瘤直徑（0 = ≤ 2 cm，1 = ＞ 2 cm）、分化程度（0 =高度分化，1 =低、中度分化）、臨床分期（0 =Ⅰ、Ⅱ期，1 =Ⅲ期）、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（0 =無(wú)，1 =有）、絕經(jīng)（0 =否，1=是）、Ki-67（實(shí)測(cè)值）、LncRNA-P21（實(shí)測(cè)值）、miR-17-3p（實(shí)測(cè)值）為自變量，納入單因素Cox回歸模型，結(jié)果顯示，分化程度、臨床分期、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LncRNAP21、miR-17-3p是三陰性乳腺癌患者預(yù)后的影響因素（P＜0.05）（見(jiàn)表3）。將分化程度、臨床分期、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LncRNA-P21、miR-17-3p納入多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型，α入=0.05、α出=0.10，結(jié)果顯示，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-17-3p為三陰性乳腺癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），LncRNA-P21為保護(hù)因素（P＜0.05）（見(jiàn)表4）。

表3 影響三陰性乳腺癌患者預(yù)后的單因素Cox回歸模型參數(shù)

表4 影響三陰性乳腺癌患者預(yù)后的多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型參數(shù)

3 討論

三陰性乳腺癌是一種高度侵襲性的乳腺癌亞型，與其他病理類(lèi)型的乳腺癌相比，三陰性乳腺癌往往發(fā)病年齡更小，組織學(xué)分級(jí)更高，腫瘤體積更大，復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移傾向更大，預(yù)后更差[5-6]。目前盡管分子靶向、免疫在乳腺癌治療中取得了較大的進(jìn)展，但是對(duì)三陰性乳腺癌患者來(lái)講，上述治療方案并未能顯著提高患者的生存率，即便是早期三陰性乳腺癌患者化療后緩解，但仍可能復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而發(fā)生轉(zhuǎn)移性病變患者的總生存期僅13～18個(gè)月[7]。非編碼RNA約占人類(lèi)DNA的98%，在表觀遺傳調(diào)控，染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄和翻譯等發(fā)揮關(guān)鍵作用，與癌癥發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。非編碼RNA主要包括LncRNA和miRNA。其中，miRNA是22 nt長(zhǎng)的非編碼RNA，主要通過(guò)與靶標(biāo)mRNA的3'非翻譯區(qū)的靶位點(diǎn)結(jié)合誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄。LncRNA是miRNA的前體，通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)調(diào)控RNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑等[8]。有研究發(fā)現(xiàn)LncRNA和miRNA失調(diào)均與乳腺癌發(fā)生及預(yù)后有關(guān)[9]。

LncRNA-P21是一種新的細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)因子，位于17號(hào)染色體，作為P53的直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，LncRNA-P21可通過(guò)直接與E3泛素蛋白連接酶結(jié)合，導(dǎo)致P53從E3泛素蛋白連接酶中釋放并與P300結(jié)合繼而增強(qiáng)P53的活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和介導(dǎo)P53依賴(lài)性細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖[10-11]。研究顯示，LncRNA-P21在食管癌、膀胱癌、直腸癌等多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因作用，LncRNA-P21通過(guò)上調(diào)P21表達(dá)或通過(guò)P53非依賴(lài)性途徑抑制細(xì)胞周期蛋白Cyclin D的表達(dá)，誘導(dǎo)G1期阻滯，促使食管癌細(xì)胞凋亡[12]。LncRNAP21還可通過(guò)抑制谷氨酰胺酶和谷氨酰胺分解代謝抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)[13]。LncRNA-P21高表達(dá)可提高直腸癌對(duì)術(shù)后放療的敏感性，延長(zhǎng)患者的總生存期[14]。本研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-P21在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，LncRNA-P21低表達(dá)與Ki-67≥30%、臨床Ⅲ期、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以及更低的5年DFS和OS生存率有關(guān)，提示LncRNA-P21低表達(dá)可能促使乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，與三陰性乳腺癌預(yù)后不良有關(guān)。LncRNA-P21在三陰性乳腺癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能為L(zhǎng)ncRNA-P21低表達(dá)介導(dǎo)癌基因MDM2引發(fā)蛋白酶體依賴(lài)性降解P53，激活核因子-κB和轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和激活子3通路，促使巨噬細(xì)胞向促炎性M1表型轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境改變，繼而促使乳腺癌進(jìn)展[15]。

miR-17-3p由前體miR-17的3'臂加工而成，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞死亡，在細(xì)胞增殖分化、凋亡和遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16-17]。miR-17-3p在結(jié)腸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)靶向抑制Par4表達(dá)促使結(jié)腸癌細(xì)胞存活和增殖[18]，還可通過(guò)靶向金屬蛋白酶組織抑制劑3誘導(dǎo)前列腺腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲[19]。本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，三陰性乳腺癌組織miR-17-3p表達(dá)上調(diào)，且miR-17-3p高表達(dá)與Ki-67≥ 30%、臨床Ⅲ期、有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明miR-17-3p過(guò)表達(dá)可能促使乳腺癌細(xì)胞惡性增殖，miR-17-3p在三陰性乳腺癌中可能為致癌基因。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-17-3p高表達(dá)與5年DFS和OS低生存率有關(guān)，miR-17-3p是乳腺癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，提示其與三陰性乳腺癌預(yù)后不良有關(guān)，可作為乳腺癌預(yù)后評(píng)估的參考指標(biāo)。miR-17-3p參與三陰性乳腺癌的機(jī)制可能為：miR-17-3p過(guò)表達(dá)可能下調(diào)E-上皮鈣黏附素表達(dá)，上調(diào)波形蛋白表達(dá)，促使乳腺癌細(xì)胞增殖，增加集落形成數(shù)量，增強(qiáng)侵襲和遷移能力[20]，進(jìn)而促使三陰性乳腺癌病情進(jìn)展。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，LncRNA-P21表達(dá)與miR-17-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明在三陰性乳腺癌發(fā)病機(jī)制中LncRNA-P21和miR-17-3p可能存在相互調(diào)控作用機(jī)制。敖翔等[20]也指出LncRNA-P21可負(fù)性調(diào)控miR-17-3p，LncRNA-P21表達(dá)缺失可促使miR-17-3p過(guò)表達(dá)，進(jìn)而促使乳腺癌細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，導(dǎo)致癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

綜上所述，三陰性乳腺癌組織LncRNA-P21表達(dá)下調(diào)，miR-17-3p表達(dá)上調(diào)；LncRNA-P21低表達(dá)、miR-17-3p高表達(dá)可能與乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性行為有關(guān)，是三陰性乳腺癌預(yù)后的影響因素；LncRNA-P21可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控miR-17-3p表達(dá)促使三陰性乳腺癌進(jìn)展。