莫丹，陳喜裕，何婕，李新寧

（廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院 乳腺科，廣西 南寧 530000）

乳腺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，也是女性因腫瘤死亡的第二大原因，新輔助化療是局部進展期乳腺癌治療的主要手段，盡管化療藥物不斷改進，但化療耐藥依然是臨床面臨的一個重要挑戰(zhàn)，嚴重影響患者預(yù)后[1]?；熌退帣C制復(fù)雜，目前研究[2]報道m(xù)icroRNA在調(diào)節(jié)腫瘤細胞對藥物的耐藥性和敏感性方面發(fā)揮重要作用。有研究[3]顯示，microRNA-186-5p（miR-186-5p）可靶向胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)因子抑制非小細胞肺癌細胞對順鉑耐藥，并抑制耐藥性癌細胞增殖、遷移及侵襲。MicroRNA-328-5p（miR-328-5p）可轉(zhuǎn)錄調(diào)控賴氨酰氧化酶樣蛋白-2表達，有助于結(jié)直腸癌細胞對5-氟尿嘧啶治療的抵抗[4]。miR-186-5p、miR-328-5p表達與乳腺癌患者化療耐藥是否有關(guān)尚不清楚。本研究通過檢測乳腺癌患者血清miR-186-5p、miR-328-5p表達，分析其與乳腺癌患者臨床病理特征和化療耐藥的關(guān)系，以期為臨床乳腺癌治療提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年2月—2022年2月廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院乳腺癌患者105例作為乳腺癌組，另隨機選取該院與乳腺癌患者年齡相匹配的57例健康體檢女性作為對照組。乳腺癌組年齡47～62歲，平均（55.12±7.09）歲；絕經(jīng)62例；T分期：T236例，T341例，T428例；N分期：N063例，N125例，N217例；病理類型：浸潤性導(dǎo)管癌92例，其他13例；雌激素受體（estrogen receptor, ER）陽性51例，孕激素受體（progesterone receptor, PR）陽性50例，人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2,HER2）陽性46例。對照組年齡45～64歲，平均（55.91±7.38）歲；絕經(jīng)32例。兩組年齡、絕經(jīng)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。納入標準：①經(jīng)活檢穿刺組織病理學(xué)證實為乳腺癌；②擬行新輔助化療；③單側(cè)乳腺癌；④術(shù)前未接受放化療。排除標準：①合并嚴重肝、肺、腎功能障礙；②合并其他部位惡性腫瘤；③發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，接受保守治療者；④合并神經(jīng)系統(tǒng)或精神疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患者及其家屬簽署同意書。

1.2 化療方案

乳腺癌患者均接受新輔助化療，按照《中國臨床腫瘤學(xué)會乳腺癌診療指南（2017.V1）》[5]的治療方案進行。HER-2陰性患者接受8個周期的ACT方案化療：第1天環(huán)磷酰胺（注冊證號：JX20100188，規(guī)格：0.2 g/支，美國百特國際有限公司）600 mg/m2+吡柔比星（國藥準字：H20045983，規(guī)格：10 mg/瓶，浙江瀚暉制藥有限公司）60 mg/m2靜脈滴注，21 d為1個周期，共化療4個周期。4周期后第1天給予多西他賽（國藥準字：H20193016，規(guī)格：20 mg/支，四川匯宇制藥股份有限公司）100 mg/m2靜脈滴注，21 d為1個周期，共化療4個周期。HER-2陽性患者接受8個周期的ACTH方案化療：第1天環(huán)磷酰胺600 mg/m2+吡柔比星60 mg/m2靜脈滴注，21 d為1個周期，共化療4個周期。4周期后第1天給予多西他賽100 mg/m2+曲妥珠單抗（注冊證號：BS20020036，規(guī)格：440 mg，瑞士羅氏公司）8 mg/kg靜脈滴注，21 d為1個周期，共化療4個周期。治療結(jié)束后參考實體瘤療效評價標準RECIST（1.1版）[6]評價療效：以客觀緩解（病灶完全消失，任何病理性淋巴結(jié)的短軸值必須＜10 mm），部分緩解（所有可測量目標病灶的直徑總和低于基線≥30%），疾病穩(wěn)定（以目標病灶半徑的總和最小值為參照，既達不到客觀緩解、部分緩解標準、也達不到疾病進展標準）為敏感，以疾病進展（病灶增大＞ 25%或出現(xiàn)新病灶）為耐藥，根據(jù)化療反應(yīng)分為耐藥組30例，敏感組75例。

1.3 qRT-PCR檢測血清miR-186-5p、miR-328-5p表達

所有患者均于新輔助化療前采集靜脈血3 mL，對照組于體檢當(dāng)日采集。采集后的靜脈血注入干燥試管，待凝固后取上層液離心（3 000 r/min，5 min，半徑10 cm）分離血清，上機檢測。TRIzol法提取細胞總RNA，用紫外分光光度計分別在260 nm和280 nm處檢測吸光度，260/280 nm吸光度比值為1.8～2.0，取該比值區(qū)間的RNA進行后續(xù)實驗，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：15℃ 30 min，45℃ 30 min，85℃ 5 min 滅活。qRTPCR檢測miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相對表達量，反應(yīng)體系：cDNA 1μL，正反向引物各0.4 μL，2×TransTaq?Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye（50×）0.4 μL，最后添加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：50℃預(yù)變性2 min，97℃變性20 s，60℃退火20 s，70℃延伸15 s，共40個循環(huán)。引物序列由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計。miR-186-5p正向：5'-AAGAATTCTCCTTTTGGGCT-3'，反向：5'-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3'；miR-328-5p正向： 5'-AACGAGACGACGACAGAC-3'，反向： 5'- GGGGGG GCAGGAGGGGCTCAGGG-3'。U6正向： 5'-CTCGCTT CGGCAGCACA-3'，反向：5'-ACGCTTCACGAATTTGC GT-3'。以U6為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt計算miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；繪制受試者工作特征（ROC）曲線；影響因素的分析采用多因素Logistic逐步回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組和對照組血清miR-186-5p、miR-328-5p表達的比較

乳腺癌組和對照組血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），乳腺癌組血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相對表達量低于對照組。見表1。

表1 兩組血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相對表達量比較 （±s）

表1 兩組血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相對表達量比較 （±s）

組別乳腺癌組對照組t 值P 值n 105 57 miR-186-5p mRNA 2.03±0.49 4.84±1.37 18.943 0.000 miR-328-5p mRNA 1.85±0.36 4.02±1.16 17.701 0.000

2.2 不同臨床病理特征乳腺癌患者血清miR-186-5p、miR-328-5p表達的比較

不同T、N分期及HER-2的乳腺癌患者血清miR-186-5p、miR-328-5pmRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），T3、T4期、N1～3期、HER-2陽性乳腺癌患者血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相對表達量低于T2期、N0期、HER-2陰性乳腺癌患者。不同年齡、是否絕經(jīng)、病理類型、ER、PR狀態(tài)乳腺癌患者血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征乳腺癌患者血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相對表達量比較 （±s）

表2 不同臨床病理特征乳腺癌患者血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相對表達量比較 （±s）

注 ： 年齡根據(jù)中位數(shù)界定。

臨床病理特征年齡≥ 55歲＜ 55歲絕經(jīng)是否病理類型浸潤性導(dǎo)管癌其他類型T分期T2期T3、T4期N分期N0期N1～3期ER陰性陽性PR陰性陽性HER-2陰性陽性n 59 46 62 43 92 13 36 69 63 42 54 51 55 50 59 46 miR-186-5p mRNA 2.01±0.50 2.06±0.43 2.02±0.48 2.04±0.50 2.02±0.47 1.95±0.41 2.24±0.14 1.92±0.23 2.15±0.17 1.85±0.19 2.02±0.48 2.04±0.46 2.04±0.50 2.02±0.46 2.14±0.21 1.89±0.20 t 值0.540 0.206 0.510 7.632 8.500 0.218 0.213 6.179 P 值0.590 0.837 0.611 0.000 0.000 0.828 0.832 0.000 miR-328-5p mRNA 1.83±0.39 1.88±0.36 1.84±0.33 1.86±0.35 1.84±0.35 1.92±0.36 1.93±0.10 1.81±0.13 1.90±0.16 1.77±0.10 1.86±0.36 1.84±0.34 1.82±0.35 1.88±0.36 1.89±0.13 1.80±0.15 t 值0.674 0.298 0.769 4.838 4.687 0.292 0.865 3.290 P 值0.502 0.766 0.444 0.000 0.000 0.771 0.389 0.001

2.3 耐藥組和敏感組血清miR-186-5p、miR-328-5p表達的比較

耐藥組和敏感組血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），耐藥組血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相對表達量低于敏感組。見表3。

表3 耐藥組和敏感組血清miR-186-5p、miR-328-5p表達的比較 （±s）

表3 耐藥組和敏感組血清miR-186-5p、miR-328-5p表達的比較 （±s）

組別耐藥組敏感組t 值P 值n 30 75 miR-186-5p mRNA 1.95±0.11 2.06±0.21 2.718 0.008 miR-328-5p mRNA 1.79±0.10 1.87±0.16 2.543 0.013

2.4 影響乳腺癌患者新輔助化療療效的多因素Logistic逐步回歸分析

以影響乳腺癌患者新輔助化療療效為因變量（敏感= 0，耐藥= 1），以單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標[miR-186-5p（原始數(shù)值）、miR-328-5p（原始數(shù)值）、T分期（T2期= 0，T3、T4期= 1）、N分期（N0期= 0，N1～3期= 1）]為自變量，進行多因素Logistic逐步回歸分析，α入=0.05，α出=0.10，結(jié)果顯示：N分期[=3.497（95% CI：1.737，7.041）]、miR-186-5p [=1.680（95% CI：1.169，2.415）]、miR-328-5p [=1.519（95% CI：1.134，2.034）]是影響乳腺癌患者新輔助化療效果的危險因素（P＜0.05）。見表4。

表4 影響乳腺癌患者新輔助化療效果的多因素Logistic逐步回歸分析參數(shù)

2.5 miR-186-5p、miR-328-5p預(yù)測乳腺癌患者新輔助化療效果的價值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-186-5p、miR-328-5p及兩者聯(lián)合預(yù)測乳腺癌患者新輔助化療效果的敏感性分別為76.67%（95% CI：0.553，0.856）、70.00%（95% CI：0.510，0.808）、90.00%（95% CI：0.768，0.977），特異性分別為74.67%（95% CI：0.528，0.831）、76.00%（95% CI：0.544，0.840）、90.67%（95% CI：0.776，0.984）。見表5和圖1。

圖1 miR-186-5p、miR-328-5p預(yù)測乳腺癌患者新輔助化療效果的ROC曲線

表5 miR-186-5p、miR-328-5p預(yù)測乳腺癌患者新輔助化療效果的效能分析

3 討論

新輔助化療可最大程度縮小腫瘤體積，實現(xiàn)降期保乳或手術(shù)轉(zhuǎn)化的可能，可改善局部進展期乳腺癌預(yù)后，延長生存期，提高生活質(zhì)量，但是化療耐藥的發(fā)生極大程度限制其治療效果，最終可能導(dǎo)致治療失敗，縮短患者生存期[7]。最近研究[8]表明，腫瘤細胞可分泌外泌體，外泌體通過與質(zhì)膜融合分泌到細胞外空間，與鄰近或遠處細胞進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)癌細胞對治療的抵抗性。外泌體中含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及大量miRNA，miRNA是小的非編碼RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平控制多個靶基因表達，外泌體中miRNA表達穩(wěn)定，并通過轉(zhuǎn)移miRNA促使多種類型腫瘤細胞產(chǎn)生化學(xué)抗性。

miR-186-5p屬于miR-186家族，miR-186位于染色體1q31.1，基因轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生pre-miR-186，其在Dicer作用下裂解為miR-186-5p和miR-186-3p。自從發(fā)現(xiàn)胰腺癌中miR-186-5p表達失調(diào)以來，已有研究[9]證實miR-186-5p在非小細胞肺癌、口腔鱗狀細胞癌、肝細胞癌等多種類型惡性腫瘤中表達失調(diào)，并參與細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲，以及新生血管和淋巴管生成過程?，F(xiàn)有報道[10-11]顯示，miR-186-5p在骨肉瘤組織和細胞系中表達下調(diào)，miR-186-5p過表達可通過靶向FOXK1 3'-UTR并負調(diào)控其表達，抑制癌細胞增殖、遷移及侵襲，miR-186-5p還可靶向胰島素樣生長因子1抑制宮頸癌細胞增殖、遷移及凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-186-5p在乳腺癌患者血清中表達下調(diào)，miR-186-5p低表達與T、N分期，HER-2表達均有關(guān)，表明miR-186-5p在乳腺癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用。miR-186-5p可能通過靶向鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒-1，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和乳腺癌細胞的遷移、侵襲[12]，miR-186-5p還可能通過靶向抑制CXC趨化因子受體4釋放，抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲[13]。進一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-186-5p是乳腺癌患者新輔助化療耐藥的保護因素，miR-186-5p表達缺失與乳腺癌化療耐藥有關(guān)，分析原因：首先，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白尤其是由ABC亞家族B成員1編碼的多藥耐藥相關(guān)蛋白1可賦予癌細胞對細胞毒性和靶向化療的抵抗力，導(dǎo)致化療耐藥[14]，miR-186-5p可靶向抑制多藥耐藥相關(guān)蛋白1表達，增加乳腺癌細胞對多柔比星的敏感性[15]。其次，線粒體轉(zhuǎn)錄因子A可驅(qū)動mtDNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制、線粒體基因的維持和修復(fù)，在維持線粒體呼吸鏈的功能完整性方面發(fā)揮重要作用，并通過誘導(dǎo)線粒體啟動免疫反應(yīng)對化療產(chǎn)生抗性[16]，miR-186-5p通過靶向抑制線粒體轉(zhuǎn)錄因子A增強乳腺癌細胞對5-氟尿嘧啶的化療敏感性[17]。

miR-328-5p是一種腫瘤相關(guān)基因，位于人類染色體16q22.1，參與肝細胞癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤發(fā)生和進展。有報道[18-19]顯示，miR-328-5p過表達可增加Snail和波形蛋白的表達，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程增強肝細胞癌惡性行為，促使肝細胞癌生長，但miR-328-5p在結(jié)直腸癌中表達下調(diào)，上調(diào)miR-328-5p表達可靶向轉(zhuǎn)錄因子E2F1抑制細胞周期素E表達，抑制結(jié)直腸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移。本研究顯示，乳腺癌患者血清miR-328-5p表達明顯下調(diào)，且miR-328-5p低表達與乳腺癌惡性生物學(xué)行為有關(guān)，miR-328-5p可通過直接靶向糖基化終產(chǎn)物調(diào)控細胞周期，抑制乳腺癌細胞增殖，發(fā)揮抑癌基因作用[20]，miR-328-5p還可靶向mimic+整合素α5下調(diào)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路，抑制乳腺癌細胞增殖，促使其凋亡[21]。本研究耐藥組血清miR-328-5p表達低于敏感組，miR-328-5p是乳腺癌患者新輔助化療耐藥的保護因素，表明miR-328-5p表達缺失與乳腺癌患者術(shù)后化療耐藥有關(guān)。分析miR-328-5p參與乳腺癌化療耐藥的機制：自噬參與乳腺癌對化療耐藥的機制。有研究[22]顯示，自噬關(guān)鍵介質(zhì)Beclin1的過表達可抑制雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致ER陽性乳腺癌對他莫昔芬耐藥，抑制Atg5、Atg7、Beclin1等自噬基因?qū)?dǎo)致對他莫昔芬耐藥的乳腺癌細胞重新獲得敏感。整合素家族中整合素α5可激活局部黏著斑激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路誘導(dǎo)細胞自噬[23]，miR-328-5p可通過抑制整合素家族中整合素α5表達抑制細胞自噬，增強乳腺癌細胞對化療的敏感性[24]。

綜上所述，乳腺癌患者血清miR-186-5p、miR-328-5p表達下調(diào)，miR-186-5p、miR-328-5p低表達與乳腺癌患者T、N分期及化療耐藥有關(guān)，miR-186-5p、miR-328-5p可作為乳腺癌患者病理分型及新輔助化療效果參考的生物學(xué)標志物，為臨床病情評估和治療提供指導(dǎo)。