王菲菲 孔維怡 段靜丹 岳 康 劉 欣 郭延生

(寧夏大學農(nóng)學院，銀川750021)

目前普遍認為產(chǎn)前3周到產(chǎn)后3周是奶牛的圍產(chǎn)期，其中產(chǎn)前3周稱為圍產(chǎn)前期，產(chǎn)后3周稱為圍產(chǎn)后期，圍產(chǎn)期奶牛健康與其生產(chǎn)性能和繁殖性能密切相關[1]。尤其是圍產(chǎn)后期受分娩、泌乳啟動以及飼糧結構改變等諸多應激因素的影響，奶牛體內(nèi)激素水平、代謝狀態(tài)和免疫機能會發(fā)生巨大擾動，這增加了酮癥、瘤胃酸中毒、乳腺炎、胎盤滯留、真胃變位和子宮炎等代謝性和炎性疾病患病風險[2]。因此，探究奶牛圍產(chǎn)期代謝機能的變化規(guī)律對圍產(chǎn)期的營養(yǎng)調(diào)控和疾病預防具有十分重要的意義。圍繞奶牛圍產(chǎn)期血液代謝物的變化國內(nèi)外學者也做了大量研究。Douglas等[3]利用酶比色法發(fā)現(xiàn)，奶牛分娩后血清中棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸含量明顯上升。Pilotto等[4]利用紅外檢測方法探究了奶牛圍產(chǎn)期血液脂肪酸、β-羥基丁酸酯(BHB)和α-生育酚含量變化之間的關系，發(fā)現(xiàn)脂肪酸含量在奶牛分娩時達到最大值，BHB含量在奶牛分娩時增加了27%、產(chǎn)后30 d繼續(xù)增加20%，α-生育酚含量在產(chǎn)犢時最低。代謝組學是通過研究生物體系受外部刺激所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物含量變化的一門科學[5]。與傳統(tǒng)生理生化檢測方法相比，代謝組學具有靈敏度和重復性高、樣品處理簡單以及可一次性測定體內(nèi)大多數(shù)代謝物的優(yōu)點[6]。Luo等[7]采用代謝組學技術研究了奶牛產(chǎn)前21 d到分娩當天血液代謝物的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)分娩當天與氧化脂質相關的物質亞油酸、花生四烯酸、γ-亞麻酸和磷脂酰膽堿較產(chǎn)前21 d顯著上調(diào)，而與氨基酸代謝相關的代謝物則表現(xiàn)出顯著下調(diào)。不過，目前對于奶牛圍產(chǎn)期血液代謝組動態(tài)變化規(guī)律的相關研究報道較少。因此，本研究采用高靈敏度和分辨率的超高液相色譜-串聯(lián)質譜(UPLC-MS/MS)代謝組學技術研究了奶牛產(chǎn)后0(分娩當天)、7、14和21 d血液代謝物的變化情況，旨在評價奶牛圍產(chǎn)后期體內(nèi)代謝水平的變化規(guī)律，為圍產(chǎn)后期營養(yǎng)調(diào)控和疾病預防提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物的選擇、分組及采樣

在寧夏某集約化奶牛養(yǎng)殖場，選擇7頭體重[(600±20) kg]、胎次(2～3次)和體況評分(3.2～3.5)相近的荷斯坦奶牛，分別在產(chǎn)后0、7、14和21 d于尾靜脈采集血液。在產(chǎn)后21 d內(nèi)每頭奶牛血酮值均小于1.0，采食量和體溫正常，體細胞數(shù)小于20萬個/mL，經(jīng)獸醫(yī)診斷健康狀況良好、無傳染性和炎性等相關疾病。產(chǎn)后0 d血液樣品依次標記為A-1～A-7(A組)，產(chǎn)后7 d血液樣品依次標記為B-1～B-7(B組)，產(chǎn)后14 d血液樣品依次標記為C-1～C-7(C組)，產(chǎn)后21 d血液樣品依次標記為D-1～D-7(D組)；血液樣品制備成血漿在-80 ℃環(huán)境中保存待測。圍產(chǎn)后期采用統(tǒng)一的全混合日糧(TMR)飼喂，TMR組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 奶牛圍產(chǎn)后期TMR組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

續(xù)表1項目 Items含量 Content營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)泌乳凈能 NEL/(MJ/kg)7.45粗蛋白質 CP19.10中性洗滌纖維 NDF26.20淀粉 Starch22.80鈣 Ca1.27磷 P0.62

1.2 血液樣品預處理

血液樣品解凍后渦旋混勻，取50 μL于EP管中，加300 μL純甲醇內(nèi)標提取液；渦旋混勻，4 ℃ 12 396 ×g離心10 min，吸取200 μL上清液到新的EP管中，于-20 ℃靜置30 min后以12 396 ×g再離心3 min，取150 μL上清液進行UPLC-MS/MS分析。

1.3 UPLC-MS/MS檢測

超高液相色譜(UPLC)條件：色譜柱采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相為0.1%甲酸超純水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)；梯度洗脫0～10 min、95% A，10～11 min、10% A，11～14 min、95% A；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

串聯(lián)質譜(MS/MS)條件：電噴霧離子源(ESI)設為溫度500 ℃，質譜電壓為5 500和-4 500 V，離子源氣體Ⅰ為55 psi、氣體Ⅱ為60 psi，氣簾氣為25 psi。碰撞誘導電離設置為高，根據(jù)去簇電壓和碰撞能掃描檢測每個離子對。

質控過程：按一定比例混合血樣提取液，制備質控(QC)樣本，每10個檢測分析樣本中插入1個質控樣本，監(jiān)測分析樣本在相同處理方法下的重復性；并通過對不同QC樣本質譜檢測分析的總離子流圖進行重疊展示分析，判斷代謝物提取和檢測的重復性。

1.4 血液代謝組學分析

獲得的原始數(shù)據(jù)導入Excel 2019，生成包含樣品編號、代謝物名稱和代謝物峰值的數(shù)據(jù)矩陣。將上述處理過的數(shù)據(jù)轉換為csv格式導入MetaboAnalyst 5.0軟件(https://www.metaboanalyst.ca/)，進行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，PCA用于觀察組內(nèi)變異情況和組間分離趨勢，OPLS-DA用于篩選確定組間差異代謝物。采用Simca 14.1軟件進行模型驗證，將原始分類的Y矩陣、模擬200次不同排列的Y矩陣與R2Y、Q2Y進行線性回歸，得到的回歸直線與y軸的截距值分別為R2和Q2，用來衡量模型是否過擬合。根據(jù)OPLS-DA模型中變量重要性投影(variable importance in projection,VIP)值，選取VIP≥1的代謝物，同時結合單變量分析的差異倍數(shù)(fold change,FC)值，進一步篩選FC≥2或FC≤0.5且P<0.05的代謝物，視為最終的血液差異代謝物。將最終篩選出的血液差異代謝物聚類分析，繪制熱圖，考察差異代謝的可靠性。結合京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫、人類代謝數(shù)據(jù)庫(HMDB)構建差異代謝物相關通路。

2 結 果

2.1 奶牛圍產(chǎn)后期血液代謝輪廓變化規(guī)律

從奶牛血液中共鑒定出532種代謝物，其中包含脂質168種，氨基酸及其代謝物98種，有機酸及其衍生物78種，核苷酸及其代謝物39種，碳水化合物及其代謝物32種，苯及其衍生物23種，雜環(huán)化合物21種，醇、胺類17種，膽汁酸17種，輔酶和維生素14種，激素及激素相關物質9種和其他16種。QC樣本質譜檢測顯示，代謝物檢測總離子流的曲線重疊性高，表明質譜對同一樣品不同時間檢測時，信號穩(wěn)定性較好，結果可靠。

采用PCA法考察奶牛產(chǎn)后0、7、14和21 d血液代謝輪廓的變化。首先，對0 d與7 d、7 d與14 d、14 d與21 d血液代謝輪廓分別進行了比較，結果顯示產(chǎn)后0 d與7 d血液代謝輪廓存在明顯差異(圖1-a)；7 d與14 d血液代謝輪廓雖有一定差異，但大部分已重合(圖1-b)；14 d與21 d血液代謝輪廓已完全重合(圖1-c)。其次，對0、7、14和21 d血液代謝輪廓一起進行比較，也得到了相似的變化趨勢(圖1-d)。這說明奶牛在產(chǎn)后0～7 d代謝狀態(tài)和代謝物水平發(fā)生了顯著變化，之后基本趨于穩(wěn)定。

圖1 奶牛圍產(chǎn)后期血液代謝物PCA 2D散點圖

2.2 奶牛圍產(chǎn)后期血液差異代謝物的篩選及通路分析

采用OPLS-DA考察導致產(chǎn)后0 d與7 d血液代謝輪廓差異的相關代謝物。由圖2-a可見，構建OPLS-DA模型能夠將產(chǎn)后0 d與7 d血液樣本明顯區(qū)分開。OPLS-DA模型驗證圖(圖2-b)顯示，隨著相關系數(shù)降低(置換保留度降低)，Q2和R2逐漸降低，Q2回歸曲線與縱坐標軸相交于0點以下且R2≤1，說明構建的模型置換檢驗過關，不存在過擬合現(xiàn)象，可用于差異代謝物的篩選。從該模型中選取VIP≥1的代謝物，通過單變量方差分析的P值(P<0.05)和FC值(FC≥2或FC≤0.5)篩選出了72個差異代謝物，19個差異代謝物在產(chǎn)后7 d顯著升高(VIP≥1，P<0.05，F(xiàn)C≥2)，見表2和圖3；53個差異代謝物在產(chǎn)后7 d顯著降低(VIP≥1，P<0.05，F(xiàn)C≤0.5)，見表3和圖3。

圖2 奶牛產(chǎn)后0 d與7 d血液代謝物OPLS-DA得分圖(a)和驗證圖(b)

圖中每一個點表示一種代謝物，藍點代表下調(diào)的差異代謝物(P<0.05)，紅點代表上調(diào)的差異代謝物(P<0.05)，灰色的點則代表差異不顯著的代謝物(P>0.05)。

表2 奶牛產(chǎn)后7 d表達上調(diào)的血液代謝物及其相關參數(shù)

表3 奶牛產(chǎn)后7 d表達下調(diào)的血液代謝物及其相關參數(shù)

續(xù)表3差異代謝物Differential metabolites平均峰值Average peak value7 d0 d差異倍數(shù)FC變量重要性投影VIPP值P-value差異代謝物Differential metabolites平均峰值Average peak value7 d0 d差異倍數(shù)FC變量重要性投影VIPP值P-value檸檬酸 Citric acid3.77×1061.17×1070.241.132.97×10-2腎上腺素 Epinephrine8.27×1041.21×1050.501.705.95×10-6己六醇 Dulcitol1.00×1041.77×1040.421.303.96×10-3皮質醇 Cortisol3.20×1043.32×1050.071.696.88×10-6D-山梨糖醇 D-sorbitol5.56×1031.58×1040.271.611.37×10-42-甲基鳥苷 2-methylguanosine1.23×1061.98×1060.481.531.52×10-3D-葡萄糖 D-glucose1.27×1053.52×1050.261.751.31×10-67-甲基鳥苷 7-methylguanosine1.23×1061.98×1060.481.531.52×10-3蘇糖醇 Threitol7.94×1032.63×1040.221.759.31×10-7磷酸肌酸鈉 Creatine phosphate1.21×1061.93×1060.461.794.92×10-8sn-甘油-3-磷酸膽堿sn-glycero-3-phosphocholine1.07×1052.52×1050.281.209.60×10-35-甲基尿苷 5-methyluridine1.36×1052.30×1050.431.324.43×10-3黃嘌呤核苷 Xanthosine3.43×1041.28×1050.171.277.55×10-35-L-谷氨酰-L-丙氨酸 5-L-glutamyl-L-alanine2.25×1043.50×1040.501.123.51×10-2N-乙酰神經(jīng)氨酸 N-acetylneuraminic acid4.62×1047.30×1040.471.348.88×10-3N-乳?；奖彼?N-lactoyl-phenylalanine2.85×1049.10×1040.231.703.03×10-6N-乙?；拾彼?N-acetylglycine3.84×1075.80×1070.471.495.40×10-4L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸 L-Phe-L-Phe6.91×1032.82×1040.181.269.99×10-3蛋氨酸亞砜 Methionine sulfoxide1.03×1061.75×1060.431.785.74×10-8高精氨酸 Homoarginine6.98×1042.97×1050.171.671.25×10-5半胱氨酰甘氨酸 Cys-Gly3.44×1047.97×1040.321.281.30×10-2還原型谷胱甘肽 Reduced glutathione2.20×1045.25×1040.301.613.07×10-5L-半胱氨酸 L-cysteine1.21×1043.51×1040.261.301.13×10-211-順視黃醇 11-cis-retinol2.78×1045.14×1040.401.407.86×10-4D-甘露醇 D-mannitol3.10×1044.06×1050.051.431.01×10-3

將72個差異代謝物進行了聚類分析，結果顯示這些差異代謝物能明顯將產(chǎn)后0 d與7 d血液樣品進行區(qū)分(圖4)，說明篩選出的差異代謝物能真實反映產(chǎn)后0 d與7 d血液代謝輪廓情況。通路分析結果顯示，差異代謝物主要涉及能量代謝、脂代謝、膽汁酸代謝、激素代謝和氧化應激等通路(圖5)。與能量代謝相關代謝物為丙酮酸、L-乳酸、D-葡萄糖和甜菜堿，與脂代謝相關代謝物有肉堿C11∶DC、肉堿C12∶1、肉堿C13∶0等和氧化三甲胺(TMAO)，與氧化應激相關的代謝物有還原型谷胱甘肽和L-半胱氨酸，激素類物質包括腎上腺素和皮質醇，與膽汁酸代謝相關代謝物有甘氨膽酸、甘氨脫氧膽酸、23-脫甲脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸。相關代謝物在產(chǎn)后0、7、14和21 d血液相對濃度變化趨勢見圖6。

圖4 奶牛產(chǎn)后0 d與7 d血液中72個差異代謝物聚類熱圖

Enteral：腸內(nèi)；TMAO：氧化三甲胺 trimethylamine oxide；POPC：磷脂酰膽堿 phosphatidylcholine；Choline：膽堿；Bacteria：細菌；TMA：三甲胺 trimethylamine；L-carnitine：L-肉堿；Betaine：甜菜堿；CA：檸檬酸 citric acid；DCA：脫氧膽酸 deoxycholic acid；Blood：血液；COR：皮質醇 cortisol；AD：腎上腺素 epinephrine；Hepatocytes：肝細胞；FMOs：黃素單氧酶 flavin monoxygenases；AMPK：腺苷酸活化蛋白激酶 adenosine monophosphate activated protein kinase；ME：甲基 methyl；PR：蛋白質 protein；GSH：谷胱甘肽 glutathione；GS：谷胱甘肽合成酶 glutathione synthetase；GCL：谷氨酸半胱氨酸連接酶 glutamate-cysteine ligase；L-cysteine：L-半胱氨酸；Glu：葡萄糖 glucose；G6P：葡萄糖-6-磷酸 glucose-6-phosphate；F6P：果糖-6-磷酸 fructose-6-phosphate；TP：磷酸丙糖 triose phosphate；PEP：磷酸烯醇式丙酮酸 phosphoenolpyruvic acid；Pyr：丙酮酸 pyruvic acid；Acetyl-CoA：乙酰輔酶A acetyl coenzyme A；TC：總膽固醇 total cholesterol；CYP8B1：甾醇12α-羥化酶 sterol 12α-hydroxylase；CYP7A1：膽固醇7α-羥化酶 cholesterol 7α-hydroxylase；CYP7B1：25-羥基膽固醇7α-羥化酶 25-hydroxycholesterol 7α-hydroxylase；CYP27A1：甾醇27α-羥化酶 sterol 27α-hydroxylase；Gly：甘氨酸 glycine；CDCA：鵝脫氧膽酸 chenodesoxycholic acid；GC：甘氨膽酸 glycocholic acid；GCDCA：甘氨鵝脫氧膽酸 glycochenodeoxycholic acid；GDCA：甘氨脫氧膽酸 glycine deoxycholic acid；OAA：草酰乙酸 oxaloacetic acid；TCA：三羧酸循環(huán) tricarboxylic acid cycle；HL：乳酸 lactic acid；TG：甘油三酯 triglyceride；GI：甘油 glycerin；LCFA：長鏈脂肪酸 long-chain fatty acid；CoA：輔酶A coenzyme A；Lcco As：長鏈脂酰輔酶A long-chain fatty acyl CoA；Mcco As：中鏈脂酰輔酶A mid-chain fatty acyl CoA；Scco As：短鏈脂酰輔酶A short-chain fatty acyl CoA；CPT1：肉堿棕櫚酰轉移酶1 carnitine palmitoyl transferase 1；CPT2：肉堿棕櫚酰轉移酶2 carnitine palmitoyl transferase 2；CACT：肉毒堿/?；舛緣A轉移酶 carnitine/acylcarnitine transferase；L-chain acyl carnitine：長鏈酰基肉堿 long-chain acyl carnitine；M-chain acyl carnitine：中鏈酰基肉堿 mid-chain acyl carnitine；Carnitine acyltransferase：肉堿酰基轉移酶；Mitochondria：線粒體。

a：丙酮酸 pyruvic acid；b：L-乳酸 L-lactic acid；c：D-葡萄糖 D-glucose；d：甜菜堿 betaine；e：肉堿C11∶DC carnitine C11∶DC；f：肉堿C12∶1 carnitine C12∶1；g：肉堿C17∶1∶DC carnitine C17∶1∶DC；h：肉堿C14-OH carnitine C14-OH；i：肉堿C14∶1 carnitine C14∶1；j：肉堿C13∶1 carnitine C13∶1；k：肉堿C13∶0 carnitine C13∶1；l：還原型谷胱甘肽 reduced glutathione；m：氧化三甲胺 TMAO；n：L-半胱氨酸 L-cysteine；o：腎上腺素 epinephrine；p：皮質醇 cortisol；q：甘氨膽酸 glycocholic acid；r：甘氨脫氧膽酸 glycine deoxycholic acid；s：23-脫甲脫氧膽酸 23-deoxydeoxycholic acid；t：甘氨鵝脫氧膽酸 glycochenodeoxycholic acid。

3 討 論

3.1 奶牛圍產(chǎn)后期能量代謝動態(tài)變化規(guī)律

大部分奶牛(尤其是高產(chǎn)奶牛)無法短期內(nèi)攝入足量干物質以滿足分娩過程和產(chǎn)后泌乳啟動對能量的需求[8]，使其處于能量代謝負平衡(NEB)的應激狀態(tài)[9]。葡萄糖是主要供能物質，奶牛泌乳時機體內(nèi)需要動員大量的葡萄糖合成乳糖[10]。葡萄糖首先被氧化為丙酮酸，后者不僅可以通過有氧氧化途徑進入三羧酸(TCA)循環(huán)產(chǎn)生檸檬酸，還可以通過無氧糖酵解途徑產(chǎn)生乳酸。Zhang等[11]報道，血清中乳酸的主要來源是糖酵解，其特征是丙酮酸通過乳酸脫氫酶轉化為乳酸。另有研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿是一種內(nèi)源性的腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激活劑，通過肝激酶B1(LKB1，AMPK上游主要的激酶)去磷酸化激活AMPK，在細胞能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起到關鍵作用，是脂代謝和糖代謝的主要調(diào)控因子，能夠促進ATP的積累[12]。本試驗結果顯示，奶牛產(chǎn)后7 d血漿葡萄糖、丙酮酸、檸檬酸、乳酸和甜菜堿含量較產(chǎn)后0 d顯著下調(diào)，而產(chǎn)后7、14和21 d之間，上述代謝物含量無顯著差異。這表明奶牛在圍產(chǎn)后期受泌乳啟動的影響，能量需要激增，機體處于較分娩時更嚴重的NEB應激狀態(tài)。

3.2 奶牛圍產(chǎn)后期?；鈮A(ACC)變化規(guī)律

目前關于ACC與動物生產(chǎn)性能和健康需求之間的關系還需深入研究[13]。奶牛從妊娠過度到哺乳期時，將脂肪酸完全氧化為二氧化碳(CO2)的能力降低，而不完全氧化為酸溶性代謝物的能力升高[14]。動物體內(nèi)肉堿分為游離肉堿和ACC，主要分布在對能量需求較高的組織中，是參與細胞內(nèi)能量代謝的關鍵物質[15]。游離肉堿又稱左旋肉堿，是長鏈脂肪酸進入線粒體所必須的載體，β-氧化的關鍵步驟是形成ACC，在脂肪酸氧化代謝中起重要作用[16]。大多數(shù)高產(chǎn)奶牛在圍產(chǎn)期都會經(jīng)歷NEB過程，會導致不同組織出現(xiàn)代謝紊亂，尤其是脂肪組織。位于細胞質的長鏈?；o酶A合成酶(ACSL)將脂肪酸轉化為長鏈脂?；o酶A，然后在肉堿棕櫚酰轉移酶-1a(CPT-1a)的催化作用下，長鏈脂?；o酶A與游離肉堿發(fā)生酯交換反應生成ACC[17]。ACC先后通過線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道(VDAC)和線粒體內(nèi)膜的肉毒堿/?；舛緣A轉移酶(CACT)進入線粒體基質，參與脂肪酸的β-氧化[18]。ACC的積累不僅反映了脂肪酸氧化能力的降低，也反映了脂肪酸向甘油三酯合成和胰島素拮抗的脂質介質的分配[19]。ACC代謝也與非酒精性脂肪肝(FLD)發(fā)展有關，F(xiàn)LD患者肝酰基肉堿含量升高。有研究認為，肝臟ACC的積累可通過有機陽離子/肉堿轉運蛋白-2機制促進其在循環(huán)中的積累[20]。如Rico等[21]發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)后動員更多脂肪酸的奶牛血漿肉堿C14∶0、肉堿C16∶0、肉堿C18∶0和肉堿C20∶0含量升高，同時血漿總ACC水平與循環(huán)總FA濃度以及神經(jīng)酰胺呈正相關[13]。未被氧化的肝臟FA可以作為甘油三酯酯化反應的底物或用于合成神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺能拮抗胰島素刺激的葡萄糖的攝取[21]。本研究結果顯示，奶牛產(chǎn)后7～21 d血漿ACC(包括中鏈和長鏈酰基肉堿)含量較產(chǎn)后0 d顯著下降，說明奶牛產(chǎn)后脂肪酸氧化能力較分娩前有一定程度的恢復。

3.3 奶牛圍產(chǎn)后期TMAO變化規(guī)律

TMAO是一種腸源性菌群代謝產(chǎn)物，由肝臟中的黃素單氧酶(FMOs)氧化三甲胺(TMA)生成。腸道中部分菌群將直接攝入或間接產(chǎn)生的膽堿、磷脂酰膽堿、甜菜堿和游離肉堿分別通過膽堿-TMA裂解酶(CutC)、甘氨酸甜菜堿還原酶(GrdH)和肉堿加氧酶(CntA)轉化為TMA，后者經(jīng)肝門靜脈轉運至肝臟氧化生成TMAO[22]。Makrecka-Kuka等[23]報道，TMAO可減少心臟線粒體中丙酮酸和脂肪酸氧化，通過減少丙酮酸脫氫酶(PDH)底物通量，并抑制β-氧化，從而導致心臟細胞能量產(chǎn)生不足。也有學者發(fā)現(xiàn)，TMAO還與脂肪肝的形成有關，TMAO通過改變膽汁酸的合成和運輸或阻斷肝臟胰島素信號通路，從而影響脂代謝、肝臟甘油三酯含量和葡萄糖穩(wěn)態(tài)，進而促進脂肪肝的形成[24]。本試驗結果顯示，奶牛產(chǎn)后7 d血清TMAO含量較產(chǎn)后0 d顯著上調(diào)，而與TMAO生成相關的代謝物，除了酰基肉堿外，還有甜菜堿和磷酸膽堿的含量也顯著下調(diào)，而產(chǎn)后7、14和21 d之間上述代謝物含量無顯著差異。這提示血清TMAO極可能是奶牛圍產(chǎn)期后期NEB發(fā)展和脂肪肝形成的潛在生物標志物，但還需進一步試驗驗證。

3.4 奶牛圍產(chǎn)后期氧化應激相關代謝物變化規(guī)律

飽和脂肪酸使線粒體超負荷工作導致氧化還原反應穩(wěn)態(tài)失衡，導致大量活性氧(ROS)自由基生成，最終引起氧化應激。ROS的持續(xù)產(chǎn)生會激活絲氨酸/蘇氨酸激酶信號級聯(lián)反應，抑制胰島素誘導的受體底物的感應[25]。據(jù)報道，氧化應激與非反芻動物胰島素抵抗和FLD發(fā)展存在一定聯(lián)系，胰島素抵抗可以增加肝臟內(nèi)脂質含量，并促進單純性脂肪變性。氧化應激也可促進Kupffer細胞活化，激活氧化還原敏感轉錄因子，包括核因子-κB，并上調(diào)促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，進一步降低抗氧化能力并促進肝細胞損傷[13]。Videla等[26]研究發(fā)現(xiàn)，大量ROS可引起肝臟脂肪酸去飽和作用降低和過氧化增強，使n-3長鏈多不飽和脂肪酸耗竭。多不飽和脂肪酸氧化形成具有多種炎癥功能的氧化脂質。如由n-6花生四烯酸和亞油酸衍生的氧化脂質羥基十八烷二烯酸和羥基二十烷四烯酸具有促炎作用。圍產(chǎn)期奶牛大多數(shù)經(jīng)歷氧化應激狀態(tài)，氧化應激又會增強脂解作用，生成的不飽和脂肪酸既可以氧化為過氧化氫和異前列腺素[27]，又可生成β-羥基丁酸鹽，這可引起ROS介導的p38絲裂原活化蛋白激酶活化，促進肝細胞凋亡[28]。另外，脂肪酸可能通過ROS依賴的炎癥機制誘導產(chǎn)生內(nèi)核因子-κB，參與了FLD的病理變化。大量研究還表明，ROS或氧化脂質的積累可能會影響牛的免疫反應[13]。還原性谷胱甘肽(GSH)是體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除物，不僅參與緩解機體氧化應激，還能夠促進膽汁酸代謝和腸道消化吸收，增強肝臟脂肪代謝[29]。半胱氨酸是GSH的前體物，半胱氨酸在谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCL)作用下先轉變成γ-谷氨酰胺半胱氨酸，然后在谷胱甘肽合成酶(GS)作用下轉化為GSH，參與緩解奶牛圍產(chǎn)期氧化應激[30]。Li等[30]報道，甜菜堿除了能調(diào)節(jié)糖脂代謝外，還通過調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生，保護牛乳腺上皮細胞免受熱暴露誘導的氧化應激和凋亡，可用于緩解奶牛熱應激和提高產(chǎn)奶量。本試驗結果顯示，奶牛產(chǎn)后7 d較0 d血漿GSH、L-半胱氨酸和甜菜堿的含量顯著下降，而產(chǎn)后7、14和21 d這些代謝物含量均無顯著差異，這提示健康奶牛圍產(chǎn)后期抗氧化能力較產(chǎn)前下降。

3.5 奶牛圍產(chǎn)后期皮質醇和腎上腺素的變化規(guī)律

已有研究證實，奶牛分娩時皮質醇、腎上腺素、去甲腎上腺素、催產(chǎn)素、加壓素和內(nèi)啡肽等激素的分泌水平會發(fā)生不同程度改變[31-32]。本研究采用UPLC-MS/MS代謝組學方法僅檢測到了血漿中含有皮質醇和腎上腺素2種激素，結果顯示奶牛產(chǎn)后0 d血漿皮質醇和腎上腺素含量顯著高于產(chǎn)后7、14和21 d，而兩者在7、14和21 d之間差異不顯著。皮質醇主要功能是通過增強氨基酸糖異生的方式提高血糖濃度，尤其支持對葡萄糖需求高的生理活動例如生產(chǎn)和泌乳早期[33]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，皮質醇還是與子宮炎、低鈣血癥和乳腺炎相關的應激和疼痛的一個既定的指標[34]。Sgorlon等[34]報道，當機體出現(xiàn)嚴重應激時血液中皮質醇含量顯著增加。Vannucchi等[35]報道，奶牛在分娩后出現(xiàn)高血糖且與血液皮質醇含量呈正相關。由于劇烈疼痛以及胎兒和母體之間的相互作用，引起奶牛分娩時血漿中腎上腺素含量上升[36]。也有學者發(fā)現(xiàn)圍產(chǎn)期奶牛NEB程度與哺乳早期腦垂體活動和腎上腺皮質反應性之間存在關聯(lián)[37]。因此，奶牛產(chǎn)后0 d高血漿皮質醇和腎上腺素含量可能是圍產(chǎn)前期代謝應激、分娩應激和疼痛的綜合作用結果。

3.6 奶牛圍產(chǎn)后期膽汁酸代謝變化規(guī)律

膽汁酸在肝臟中產(chǎn)生，其在膽汁酸穩(wěn)態(tài)、營養(yǎng)吸收和膽固醇穩(wěn)態(tài)等代謝過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[38]。肝臟中生成的膽汁酸，首先進入腸道參與消化吸收，后經(jīng)腸道重吸收，大約95%的膽汁酸經(jīng)門靜脈返回肝臟，僅有少部分進入血液循環(huán)[39]。另外，膽汁酸還可以通過激活法尼醇X受體(FXR)和G蛋白偶聯(lián)的膽汁酸受體1(GPBAR1/TGR5)來充當信號分子。初級膽汁酸通過經(jīng)典(中性)和替代(酸性)2種途徑合成[40]。其中，經(jīng)典途徑占膽汁酸總合成的75%，肝臟中膽固醇在膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)作用下轉化為7α-羥膽固醇，隨后被甾醇12α-羥化酶(CYP8B1)氧化裂解為膽酸[41]。在替代途徑中膽固醇在甾醇27α-羥化酶(CYP27A1)的催化下生成27α-羥基膽固醇，隨后在25-羥基膽固醇7α-羥化酶(CYP7B1)作用下生成鵝脫氧膽酸[42]。游離膽汁酸包括膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和石膽酸4種，這些結合膽汁酸可進一步與甘氨酸和?；撬峤Y合生成次級膽汁酸包括甘氨膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸和?；悄懰岬取i等[43]研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸在控制腸肝系統(tǒng)中葡萄糖和脂質的代謝以及外周組織的能量消耗方面也起著關鍵調(diào)節(jié)作用。Mazalli等[46]報道，奶牛泌乳啟動后，肝臟中與膽汁酸合成相關基因的mRNA表達量升高。本試驗采用UPLC-MS/MS代謝組學技術也發(fā)現(xiàn)了相似的結果，即奶牛產(chǎn)后7 d血漿中與膽汁酸代謝相關的物質甘氨膽酸、甘氨脫氧膽酸、23-脫甲脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸含量顯著高于產(chǎn)后0 d，而產(chǎn)后7、14和21 d之間這些代謝物含量無顯著差異，推測這可能與奶牛分娩后泌乳啟動、采食量和消化吸收逐漸恢復有關。

4 結 論

本試驗采用UPLC-MS/MS代謝組學技術研究了奶牛產(chǎn)后0、7、14和21 d血液代謝物的動態(tài)變化規(guī)律，結果表明產(chǎn)后7 d內(nèi)代謝輪廓發(fā)生了明顯改變，圍產(chǎn)后期奶牛處于代謝應激和氧化應激狀態(tài)。