李軍德 張高瞻 劉曉娟 宋吉英*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院，青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，青島266109)

黃酮類化合物廣泛存在于植物中，對(duì)哺乳動(dòng)物和其他類型的細(xì)胞具有許多有益的生理效應(yīng)和藥理作用，是多種中草藥的有效成分。蒲公英作為一種藥食同源的中草藥，含有大量的黃酮類物質(zhì)，對(duì)動(dòng)物有抗炎、抑菌、免疫調(diào)節(jié)等作用，其功效已成為近些年研究的熱點(diǎn)[1]。中草藥飼料添加劑是指以中草藥為原料制成的飼料添加劑，其作用主要表現(xiàn)在防病保健、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、改善動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量和改善飼料品質(zhì)等方面，具有來(lái)源天然性、功能多樣性、安全可靠性、經(jīng)濟(jì)環(huán)保性等特點(diǎn)。自2020年起，我國(guó)飼料中全面禁止添加抗生素，發(fā)現(xiàn)并利用能夠有效替代抗生素的藥食同源的中草藥逐漸成為飼料行業(yè)的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，中草藥在替代畜禽飼用抗生素的試驗(yàn)研究中已被證實(shí)具有改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能、提高機(jī)體抗氧化能力、增強(qiáng)免疫功能等良好效果[2-3]。蒲公英作為一種分布廣泛、價(jià)格低廉、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、生物活性良好的中草藥飼料添加劑，可以合理應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐中[4-7]。但蒲公英中黃酮的含量因產(chǎn)地氣候、土壤和生長(zhǎng)期等客觀條件的不同而不同，因此使用時(shí)建議對(duì)黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。蒲公英中黃酮的提取和測(cè)定，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較多[8-13]，目前的文獻(xiàn)對(duì)黃酮的提取多是采用單一的超聲提取或微波提取，測(cè)定方法主要是普通熒光法。用響應(yīng)面優(yōu)化超聲-微波協(xié)同萃取的方法目前尚未見報(bào)道，響應(yīng)面法考慮了試驗(yàn)的隨機(jī)誤差，計(jì)算簡(jiǎn)單，與常用的正交試驗(yàn)相比，其突出優(yōu)勢(shì)是在尋找最佳試驗(yàn)條件的過(guò)程中，可以連續(xù)對(duì)試驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行分析，而正交試驗(yàn)只能對(duì)一個(gè)個(gè)孤立的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析[14-15]。超聲-微波協(xié)同萃取技術(shù)近年來(lái)以其萃取時(shí)間短、萃取效率高、樣品耗量低等突出優(yōu)點(diǎn)，在天然物質(zhì)的提取中得到了廣泛的應(yīng)用[16-19]。同步熒光法具有選擇性好、靈敏度高、干擾少等優(yōu)點(diǎn)，是多組分混合物熒光測(cè)定的一種有效手段。本試驗(yàn)以煙臺(tái)某地區(qū)的蒲公英為試驗(yàn)對(duì)象，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同萃取黃酮的工藝，主要確定提取溶劑乙醇濃度、微波功率、萃取時(shí)間和料液比等提取因素，同時(shí)采用同步熒光法測(cè)定其中黃酮的含量，特別是確定最佳波長(zhǎng)差值(Δλ)，從而得到最佳提取工藝和檢測(cè)方法，為動(dòng)物飼糧中含黃酮類中草藥的添加提供控制依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器：F-2500熒光分光光度計(jì)(Hitachi公司)、GW-2000超聲-微波協(xié)同萃取反應(yīng)儀(上海新拓分析儀器科技有限公司)、PB-10酸度計(jì)(北京賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)、GL-12B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、AR124CN電子天平(常州奧豪斯儀器有限公司)。

蘆丁，純度大于98%，上海麥克林生物化學(xué)有限公司；乙醇，色譜純，德國(guó)Meker公司；其他試劑為優(yōu)級(jí)純分；試驗(yàn)用水為超純水；蒲公英全草購(gòu)于山東省煙臺(tái)市市場(chǎng)，粉碎后備用。

1.2 同步熒光光譜參數(shù)

狹縫寬度激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)：5 nm，發(fā)射波長(zhǎng)(Em)：5 nm，掃描范圍Ex：400～500 nm，Em：455～555 nm，掃描速度300 nm/min，延遲時(shí)間0 s，電壓400 V。

1.3 樣品前處理方法

稱取一定質(zhì)量的蒲公英全草樣品，加入提取溶劑，設(shè)置微波功率和萃取時(shí)間，進(jìn)行超聲-微波協(xié)同萃取，將提取后的混合物離心，上清液旋蒸(50 ℃)至干，加入10 mL色譜純乙醇溶解旋蒸后的殘留物，用0.45 μm的一次性濾膜過(guò)濾以除去其中的固體顆粒，濾液中加入Al(NO3)3溶液和醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，色譜純乙醇定容至50 mL，待測(cè)。

1.4 蘆丁同步熒光光譜分析條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確移取0.5 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于25 mL容量瓶，以Δλ、Al(NO3)3溶液濃度、醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的pH、反應(yīng)時(shí)間和溫度5個(gè)因素為單因素，每次改變1個(gè)因素分別進(jìn)行同步熒光光譜分析，考察各個(gè)因素對(duì)蘆丁同步熒光強(qiáng)度的影響。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 同步熒光光譜分析條件的因素和水平

1.5 蒲公英中黃酮提取效果的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取2.0 g粉碎的蒲公英全草樣品，以乙醇濃度、微波功率、萃取時(shí)間、料液比4個(gè)因素為單因素，按照1.3的方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，每次改變1個(gè)因素分別對(duì)提取液進(jìn)行同步熒光光譜分析，考察各個(gè)因素對(duì)黃酮提取效果的影響。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 黃酮提取效果的因素和水平

1.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取溶劑乙醇濃度(A)、微波功率(B)、萃取時(shí)間(C)、料液比(D)為自變量，提取液的熒光強(qiáng)度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化蒲公英中黃酮的提取工藝，確定最佳提取條件。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平

1.7 蒲公英中黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取樣品待測(cè)溶液1 mL于25 mL容量瓶，加入一定量的Al(NO3)3溶液，pH=6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液1 mL，乙醇定容，反應(yīng)50 min，同步熒光法測(cè)定其熒光強(qiáng)度。樣品中的黃酮以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作為表述，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求出所測(cè)溶液中蘆丁的含量，按照下列公式求出樣品中黃酮的含量。

w=c×V1×V2×10-3/m。

式中：w為樣品中黃酮的含量(mg/g)；c為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算的所測(cè)溶液的濃度(μg/mL)；V1為所測(cè)溶液的體積(mL)；V2為樣品處理后所得待測(cè)溶液的體積(mL)；m為樣品的質(zhì)量(g)。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

優(yōu)化提取工藝試驗(yàn)采用Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD)，利用數(shù)據(jù)處理軟件Design-Expert 10.0.4、Origin Pro 2018C和Excel 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁同步熒光光譜分析條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1-a可知，不同的Δλ對(duì)蘆丁的同步熒光強(qiáng)度是有影響的，隨著Δλ的增大，同步熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)Δλ=55 nm時(shí)，蘆丁的光譜圖規(guī)范且同步熒光強(qiáng)度最大。由圖1-b可知，當(dāng)Al(NO3)3溶液濃度為0.2%時(shí)，蘆丁的同步熒光強(qiáng)度最大。由圖1-c可知，當(dāng)pH<6.0時(shí)，蘆丁的同步熒光強(qiáng)度基本不變；pH=6.0時(shí)，蘆丁的同步熒光強(qiáng)度最大；pH>6.0時(shí)，蘆丁的同步熒光強(qiáng)度下降。由圖1-d可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，蘆丁的同步熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)50 min時(shí)，同步熒光強(qiáng)度基本保持不變。由圖1-e可知，隨著溫度的升高，蘆丁的同步熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，蘆丁的同步熒光強(qiáng)度最大，因此試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行即可。對(duì)同步熒光光譜分析條件單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，Δλ、Al(NO3)3溶液濃度、pH、反應(yīng)時(shí)間、溫度對(duì)應(yīng)的F值分別為4.08、48.74、1.93、2.19、4.74，顯著性水平α=0.05時(shí)，查得其臨界值分別為2.51、2.39、2.66、3.11和3.48，其P值分別為0.006、<0.001、0.130、0.120和0.020，以上結(jié)果說(shuō)明Δλ和Al(NO3)3溶液濃度對(duì)結(jié)果的影響極其顯著，溫度對(duì)結(jié)果的影響顯著，而pH和反應(yīng)時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響不顯著。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定同步熒光法測(cè)定蘆丁的最佳光譜條件為：Δλ=55 nm，Al(NO3)3溶液濃度為0.2%，加入醋酸-醋酸鈉緩沖液使溶液pH=6，室溫下反應(yīng)50 min。在以上最佳測(cè)定條件下，得到蘆丁的同步熒光光譜圖，如圖2所示。

圖1 各因素對(duì)蘆丁同步熒光強(qiáng)度的影響

圖2 蘆丁的同步熒光光譜圖

2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性方程

用作圖法繪制蘆丁工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性方程為F=15.14c+13.54，線性相關(guān)系數(shù)(R2)=0.991 8，c為蘆丁的濃度(μg/mL)，F(xiàn)為同步熒光強(qiáng)度。

2.3 蒲公英中黃酮提取效果的單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖3-a可知，低濃度范圍內(nèi)提取液的熒光強(qiáng)度隨乙醇濃度的增加而增大，當(dāng)乙醇濃度超過(guò)50%時(shí)，熒光強(qiáng)度開始降低。由圖3-b可知，提取液的熒光強(qiáng)度隨著微波功率的增加而增大，當(dāng)微波功率超過(guò)300 W時(shí)，熒光強(qiáng)度開始下降。由圖3-c可知，提取液的熒光強(qiáng)度隨著萃取時(shí)間的增加而增大，當(dāng)萃取時(shí)間超過(guò)30 min時(shí)，熒光強(qiáng)度開始下降。由圖3-d可知，萃取劑量少時(shí)熒光強(qiáng)度隨著料液比的增加而增大，當(dāng)料液比超過(guò)1∶30(g∶mL)時(shí)，熒光強(qiáng)度基本趨于穩(wěn)定。對(duì)蒲公英中黃酮提取效果的單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，乙醇濃度、微波功率、萃取時(shí)間和料液比4個(gè)因素對(duì)應(yīng)的F值分別為13.53、4.22、1.70和4.59，顯著性水平α=0.05時(shí)，查得其臨界值分別為3.11、3.48、3.48、3.48，其P值分別為<0.001、0.029、0.226、0.023，說(shuō)明乙醇濃度對(duì)提取效果的影響極顯著，微波功率和料液比對(duì)提取效果的影響顯著，而萃取時(shí)間對(duì)提取效果的影響不顯著。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定超聲-微波協(xié)同萃取蒲公英中黃酮的最佳提取條件為：50%乙醇水溶液作為提取溶劑，微波功率300W，萃取時(shí)間30min，料液比1∶30 (g∶mL)。

圖3 各因素對(duì)黃酮提取效果的影響

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同萃取條件

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蛿?shù)據(jù)

響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ驮O(shè)計(jì)以提取溶劑乙醇濃度(A)、微波功率(B)、萃取時(shí)間(C)、料液比(D)為自變量，提取液的熒光強(qiáng)度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，共29組，所得數(shù)據(jù)如表4所示。

表4 響應(yīng)面法Box-Behnken設(shè)計(jì)和結(jié)果

續(xù)表4試驗(yàn)號(hào) Test numberABCD熒光強(qiáng)度 Fluorescence intensity1901-1094.0020110088.2821100186.17220000109.0023001192.48240000110.1125-1-10080.03260-10188.32270000116.4728100-180.0329010198.55

2.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)回歸分析，得出以熒光強(qiáng)度為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸方程：F=112.78+2.61A+2.21B-0.53C+2.15D+0.25AB+1.32AC+0.25AD+1.03BC+1.23BD+1.13CD-19.21A2-9.21B2-10.29C2-11.65D2。

式中：F為提取液中黃酮的熒光強(qiáng)度；A、B、C、D分別為乙醇濃度、微波功率、萃取時(shí)間和料液比。

響應(yīng)面法數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果如表5所示，由分析結(jié)果可知，模型的P值<0.000 1，說(shuō)明回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)數(shù)值表明其差異不顯著；因素的顯著性分析結(jié)果顯示，單因素萃取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著，其他各項(xiàng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響均達(dá)到顯著水平；同時(shí)可以看出，乙醇濃度對(duì)提取效果的影響最大，其次是微波功率和料液比，萃取時(shí)間對(duì)提取效果的影響較小，這和單因素試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

表5 響應(yīng)面法數(shù)據(jù)方差分析

續(xù)表5方差來(lái)源Sources of variation平方和Sum of squares自由度df均方Mean squareF值F-valueP值P-value顯著性Significant殘差 Residual121.94148.71純誤差Lack of ft48.59104.860.270.959 7NS純誤差Pure error73.34418.34所有項(xiàng) Cor total3 459.8428

表6 黃酮提取的二次多項(xiàng)式擬合分析

2.4.3 各因素交互作用響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖，曲線走勢(shì)越陡，影響越顯著，曲線走勢(shì)平滑，則影響較小；等高線橢圓形狀能反映出交互作用的強(qiáng)弱，等高線呈橢圓形說(shuō)明交互作用顯著，呈圓形則反之[20-21]。

從圖4可以看出，在交互項(xiàng)的相互影響中，乙醇濃度與微波功率、萃取時(shí)間、料液比之間的交互作用顯著，而其他因素之間的交互作用不顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。根據(jù)建立的模型，得到蒲公英中黃酮的最佳提取條件：乙醇濃度51.64%，微波功率251.4 9 W，萃取時(shí)間29.03 min，料液比1∶32.08 (g∶mL)。結(jié)合試驗(yàn)情況，確定最佳提取條件為：乙醇濃度50%，微波功率250 W，萃取時(shí)間30 min，料液比1∶30 (g∶mL)，這也與單因素試驗(yàn)結(jié)果基本一致。在此最佳提取條件下，所得蒲公英中黃酮的含量為3.52 mg/g。

圖4 各因素交互作用響應(yīng)面圖

3 討 論

3.1 測(cè)定條件對(duì)蘆丁同步熒光強(qiáng)度的影響

同步熒光法近幾年在黃酮的分析測(cè)定中得到了一定的應(yīng)用[22-24]。在恒波長(zhǎng)同步熒光法中，Δλ的選擇十分重要，這將直接影響到同步熒光光譜的形狀、帶寬和信號(hào)強(qiáng)度[25-27]，它是同步熒光檢測(cè)方法中最重要的檢測(cè)參數(shù)，本試驗(yàn)從Δλ=10 nm開始，每隔5～10 nm進(jìn)行設(shè)置，討論Δλ對(duì)蘆丁同步熒光強(qiáng)度的影響，當(dāng)熒光強(qiáng)度有明顯增強(qiáng)時(shí)，細(xì)化Δλ的數(shù)值，每隔5 nm進(jìn)行討論，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Δλ=55 nm時(shí)，蘆丁的光譜圖規(guī)范且同步熒光強(qiáng)度最大。相關(guān)文獻(xiàn)[22-24]對(duì)Δλ的數(shù)值討論基本是間隔10 nm，數(shù)值相對(duì)粗略。黃酮類化合物能與Al3+反應(yīng)形成熒光絡(luò)合物[28-30]，從而使化合物的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，當(dāng)蘆丁的熒光強(qiáng)度最大時(shí)，說(shuō)明絡(luò)合反應(yīng)達(dá)到飽和，因此可以確定溶液中Al(NO3)3的適宜濃度為0.2%；本試驗(yàn)采用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液調(diào)整溶液為弱酸性，發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境對(duì)熒光強(qiáng)度的影響一般，pH=7.0時(shí)同步熒光強(qiáng)度開始有下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)辄S酮類化合物在偏中性環(huán)境中與鈉鹽生成了螯合物[11]，從而造成熒光強(qiáng)度減弱；蘆丁與Al3+的絡(luò)合反應(yīng)需要一定的時(shí)間，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)50 min時(shí)，熒光強(qiáng)度基本保持不變，說(shuō)明Al3+與蘆丁已反應(yīng)充分；絡(luò)合反應(yīng)與溫度有直接的關(guān)系，隨著溫度的升高，蘆丁的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，熒光絡(luò)合物的解離反應(yīng)趨勢(shì)增大[23]，本試驗(yàn)顯示在室溫條件蘆丁的熒光強(qiáng)度最大，相關(guān)文獻(xiàn)幾乎沒有對(duì)溫度這一影響因素進(jìn)行討論。

3.2 不同因素對(duì)蒲公英中黃酮提取效果的影響

蒲公英中黃酮的提取采用超聲-微波協(xié)同萃取法，影響提取效果的主要因素有乙醇濃度、微波功率、萃取時(shí)間和料液比。不同濃度的乙醇溶液對(duì)黃酮的提取效果不同，低濃度范圍內(nèi)提取液的熒光強(qiáng)度隨乙醇濃度的增加而增大，當(dāng)乙醇濃度超過(guò)50%時(shí)熒光強(qiáng)度開始降低，這可能是因?yàn)橐掖紳舛冗^(guò)高時(shí)，蒲公英中的脂溶性物質(zhì)的析出量也會(huì)增加，從而抑制了黃酮的進(jìn)一步溶解，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降。微波功率對(duì)提取效果也有影響，隨著微波功率的增加，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，說(shuō)明黃酮類化合物溶出量增多，當(dāng)微波功率超過(guò)300 W時(shí)，熒光強(qiáng)度開始下降，這是因?yàn)槲⒉üβ蔬^(guò)大，提取液的溫度會(huì)有明顯的提升，溫度過(guò)高會(huì)造成部分黃酮類化合物的分解[31-32]，從而導(dǎo)致黃酮含量降低，熒光強(qiáng)度下降。熒光強(qiáng)度隨著萃取時(shí)間的增加而增大，說(shuō)明蒲公英中的黃酮隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)溶出量增多，但超過(guò)30 min時(shí)熒光強(qiáng)度開始下降，這可能是因?yàn)槌暡ǖ臒嵝?yīng)能使黃酮類化合物分子的溶出加劇，但是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，微波的高能作用和超聲波振動(dòng)的空化作用加劇，使得提取液產(chǎn)生的熱量過(guò)多，溫度升高；同時(shí)，超聲波的機(jī)械作用可能也會(huì)使部分黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，甚至加劇其分解，從而造成溶液中黃酮含量的減少。熒光強(qiáng)度隨著料液比的增加而增大，這是因?yàn)榱弦罕容^小時(shí)，黃酮類化合物分子與溶劑的接觸不充分，溶出速度慢而且溶出不徹底，所以黃酮的溶出量少；隨著料液比的逐漸增加，提取溶劑的量增多，蒲公英樣品與溶劑充分接觸，溶解效果增強(qiáng)，當(dāng)料液比達(dá)到一定數(shù)值時(shí)熒光強(qiáng)度基本趨于穩(wěn)定，說(shuō)明黃酮的溶出量已達(dá)到飽和；料液比過(guò)高，樣品處理過(guò)程中旋蒸濃縮耗時(shí)多，試驗(yàn)成本也會(huì)增加。

4 結(jié) 論

① 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同萃取技術(shù)提取蒲公英中的黃酮，其最佳提取條件為乙醇濃度50%，微波功率250 W，萃取時(shí)間30 min，料液比1∶30 (g∶mL)。

② 同步熒光法測(cè)定黃酮具有選擇性好、靈敏度高、干擾少、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，最佳測(cè)定條件為Δλ=55 nm，Al(NO3)3濃度0.2%，加入pH=6的醋酸-醋酸鈉緩沖液1 mL，室溫條件下反應(yīng)50 min。