靳榮理，薛鵬翔，范慶花，馬曉云，唐 輝，張 勤，王文文

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部非糧飼料資源高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（部省共建），山東泰安 271000）

仔豬腹瀉嚴(yán)重影響豬養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。調(diào)查[1]表明，近40%的仔豬死亡是由腹瀉導(dǎo)致的，即使是存活的仔豬，在其后期的生長育肥過程中也會受到腹瀉的嚴(yán)重影響。仔豬腹瀉根據(jù)發(fā)生的原因可分為生理性腹瀉和感染性腹瀉，其中生理性腹瀉主要是由仔豬飼料配比不當(dāng)、消化功能異常和環(huán)境應(yīng)激等因素造成的，而感染性腹瀉主要是由病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染引起的[2]。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）是造成新生和斷奶仔豬腹瀉的一個(gè)重要原因。ETEC是一種革蘭氏陰性菌，其主要毒力因子有菌毛黏附素和腸毒素。ETEC有O、H、K、F 4種抗原類型[3]，其中F為菌毛抗原，也稱黏附素抗原，它與大腸桿菌的粘附有關(guān)，也是研究最多的一種抗原。ETEC有F4、F5、F18等多種亞型的菌毛，其中以F4最為常見且危害性最大。由ETEC F4引發(fā)的腹瀉導(dǎo)致全世界11.5%～29.5%的仔豬死亡，被認(rèn)為是導(dǎo)致養(yǎng)豬場經(jīng)濟(jì)損失的重要原因之一[4]。F4菌毛又有3種血清型——F4ab、F4ac和F4ad，其中F4ac的感染效應(yīng)最為強(qiáng)烈。目前對ETEC的研究主要集中在致病因子表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、毒力因子特異性抗體制備和抗性基因篩選等方面，而要研究細(xì)菌致病機(jī)理不可避免地要涉及細(xì)菌與宿主之間的相互作用過程。ETEC通過日糧或者環(huán)境到達(dá)仔豬小腸，利用其菌毛與宿主小腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，將菌體粘附到細(xì)胞上[2]。研究[5-6]表明，ETEC感染會促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的凋亡，損害腸上皮的完整性；ETEC感染IPEC-J2細(xì)胞后導(dǎo)致的促炎因子過度產(chǎn)生是促進(jìn)腸道屏障破壞的主要因素[7]。由于大腸桿菌在顯微鏡下顯示無色[8]，這對直接觀察細(xì)菌-宿主的粘附造成了困難。因此，本研究利用攜帶綠色熒光蛋白基因的原核表達(dá)載體pTurboGFP-B轉(zhuǎn)化ETEC F4ac，使ETEC F4ac表達(dá)綠色熒光，從而可直觀觀察病原菌與宿主細(xì)胞的粘附狀態(tài)，并對轉(zhuǎn)化菌株的粘附能力、生長繁殖速度、遺傳穩(wěn)定性和對宿主細(xì)胞的毒力進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究ETEC F4ac的致病機(jī)理及細(xì)菌與宿主之間的相互作用過程提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞 質(zhì)粒pTurboGFP-B，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)商營利教授實(shí)驗(yàn)室惠贈；ETEC標(biāo)準(zhǔn)菌株（C83907、O149:K91、K88ac）和豬小腸上皮IPEC-J2細(xì)胞系，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 氨芐青霉素，購自北京索萊寶公司；DMEM/F12、胎牛血清，購自Gibco公司；LB培養(yǎng)基，購自青島生工生物科技有限公司；甘油，購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；曲拉通-X100，購自北京索萊寶科技有限公司；TRNzol Universal Reagent，購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒），購自上海碧云天生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 主要儀器設(shè)備

冷凍離心機(jī)，美國Eppendorf公司產(chǎn)品；熒光倒置顯微鏡，意大利Optika公司產(chǎn)品；電擊穿孔儀，美國BTX公司產(chǎn)品；藍(lán)光儀，廣州光儀生物科技有限公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱（HealForce），力新儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀、核酸蛋白測定儀、酶標(biāo)儀，均為美國Thermo公司產(chǎn)品；熒光定量 PCR 擴(kuò)增儀，瑞士Roche公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 ETEC基因型檢測 為防止菌株與實(shí)驗(yàn)室保存的ETEC F18菌株混淆，采用PCR方法，用ETEC F4ac特異性表達(dá)的FaeG基因引物，只在F4ac血清型中表達(dá)的毒力因子Sta基因特異性引物、F18血清型菌毛特異性表達(dá)的FaeA基因引物（表1），檢測ETEC F4ac菌株是否被污染。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃總延伸5min，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 PCR引物

1.3.2 ETEC F4ac熒光標(biāo)記 采用電擊轉(zhuǎn)化法進(jìn)行熒光標(biāo)記。挑取ETEC F4ac單克隆菌落搖菌過夜，次日按1:100的比例接種于200 mL的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2.5 h；將菌液4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，棄上清液，收集菌體，分別用依次遞減的50、20和10 mL冰冷的無菌蒸餾水洗滌沉淀3次，去除培養(yǎng)基中的各種離子，最后將菌體用1 mL 10%的無菌甘油重懸，即為制備的用于電轉(zhuǎn)的感受態(tài)細(xì)胞；取感受態(tài)細(xì)胞100 μL加入500 ng pTurboGFP-B質(zhì)粒，將混合物在冰上孵育15 min并放入電轉(zhuǎn)杯，然后放入電轉(zhuǎn)儀中，設(shè)置參數(shù)為電壓2.5 kV、固定電容25 mF、電阻200 Ω；電轉(zhuǎn)后立即將電轉(zhuǎn)杯中的液體轉(zhuǎn)移到LB培養(yǎng)基的離心管中，在37 ℃搖床上200 r/min 培養(yǎng)1 h；然后將其涂在含有氨芐的培養(yǎng)板上篩選含有pTurboGFP-B質(zhì)粒的克隆，得到表達(dá)綠色熒光的菌株ETEC F4ac-GFP。

1.3.3 轉(zhuǎn)化子基因型檢測 采用PCR方法，用ETEC F4ac特異性表達(dá)的基因FaeG引物、綠色熒光蛋白基因GFP特異性引物（表1），擴(kuò)增陽性轉(zhuǎn)化子菌液，檢測陽性轉(zhuǎn)化子是否為被標(biāo)記綠色熒光蛋白基因的ETEC。PCR反應(yīng)條件與上述相同。

1.3.4 轉(zhuǎn)化菌株與未轉(zhuǎn)化菌株細(xì)胞粘附能力比較 將IPEC-J2細(xì)胞系在六孔板中培養(yǎng)，直到細(xì)胞融合度達(dá)到80%；用無菌PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，然后每孔加入1 mL無血清、無雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化菌株ETEC-F4ac-GFP組與未轉(zhuǎn)化菌株ETEC-F4ac組每孔加入200 μL濃度為1×109CFU/mL的菌液，每組3個(gè)重復(fù)；將細(xì)胞和細(xì)菌在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育4 h；用無菌PBS緩沖液洗滌4次，洗去未粘附的細(xì)菌；將6孔板置于熒光倒置顯微鏡下觀察，然后用無菌PBS將98%的曲拉通-X100稀釋至0.5%，每孔加入200 μL 0.5%的細(xì)胞裂解液，室溫裂解25 min；反復(fù)吹打，將細(xì)胞裂解液用生理鹽水以1:10的體積比連續(xù)稀釋3次并均勻的涂布在LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h后計(jì)數(shù)粘附細(xì)菌數(shù)。

1.3.5 轉(zhuǎn)化菌株與未轉(zhuǎn)化菌株生長曲線對比 為研究pTurboGFP-B質(zhì)粒對F4ac菌株的生長是否有影響，將菌株以1:100的接種量接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、200 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔1 h測1次OD600，繪制兩種菌株的生長曲線。

1.3.6 轉(zhuǎn)化菌株與未轉(zhuǎn)化菌株毒力檢測 為進(jìn)一步研究pTurboGFP-B質(zhì)粒是否會改變ETEC F4ac菌株的毒力，將攻菌后的IPEC-J2細(xì)胞進(jìn)行CCK-8細(xì)胞活性檢測和炎癥因子以及凋亡基因檢測。將IPEC-J2細(xì)胞系在96孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，將轉(zhuǎn)化菌株ETEC-F4ac-GFP組與未轉(zhuǎn)化菌株ETEC-F4ac組每孔加入30 μL濃度為1×109CFU/mL的菌液，以無血清、無雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基為對照組，每組3個(gè)重復(fù)；將細(xì)胞和細(xì)菌在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育4 h；用無菌PBS緩沖液洗滌4次，洗去未粘附的細(xì)菌，更換無血清、無雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8溶液放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1h，然后使用酶標(biāo)儀在450 nm的波長下檢測吸光度；將IPEC-J2細(xì)胞系在六孔板中培養(yǎng)，直到細(xì)胞融合度達(dá)到80%。細(xì)胞攻菌條件與細(xì)胞粘附試驗(yàn)一致，攻菌結(jié)束后提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后通過qRT-PCR檢測不同組間炎癥因子TNF、IL1A、IL6、CCL1、CXCL2和凋亡基因GADD45B、PUMA的表達(dá)量。引物見表2。

表2 qPCR引物

2 結(jié)果

2.1 ETEC F4ac黏附素及毒力因子鑒定

經(jīng)PCR擴(kuò)增的STa基因長度為244 bp，F(xiàn)4FaeG基因長度為499 bp，而F18FaeA基因沒有擴(kuò)增出產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1），說明菌株血清型為F4ac且沒有被其他菌株污染。

圖1 ETEC F4ac基因型鑒定結(jié)果

2.2 綠色熒光蛋白在ETEC F4ac中的表達(dá)

電擊轉(zhuǎn)化后在Amp抗性培養(yǎng)基生長的單克隆菌落，用肉眼直接觀察呈現(xiàn)綠色。在藍(lán)光儀下觀察則發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光（圖2），說明綠色熒光蛋白基因可以在菌株內(nèi)正常表達(dá)，且多次傳代后仍能保持強(qiáng)烈的熒光強(qiáng)度。

圖2 藍(lán)光儀下未轉(zhuǎn)化菌株與轉(zhuǎn)化菌株的熒光比較結(jié)果

2.3 轉(zhuǎn)化子ETEC基因型鑒定

經(jīng)PCR擴(kuò)增的FaeG基因長度為499 bp，GFP基因?yàn)?82 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖3），說明pTurboGFP-B質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入ETEC F4ac菌株且綠色熒光蛋白基因在菌株內(nèi)正常表達(dá)，成功獲得了標(biāo)記綠色熒光蛋白的ETEC菌株ETEC F4ac-GFP。

圖3 綠色熒光蛋白基因標(biāo)記的ETEC F4ac-GFP PCR檢測結(jié)果

2.4 轉(zhuǎn)化菌株ETEC F4ac-GFP對IPEC-J2細(xì)胞的粘附能力

明場觀察ETEC F4ac-GFP與IPEC-J2細(xì)胞的粘附，可以觀察到有細(xì)菌粘附在細(xì)胞周圍，但由于細(xì)胞和細(xì)菌都是無色半透明狀的，所以粘附現(xiàn)象并不是很好觀察（圖4-A）。熒光激發(fā)下可觀察到粘附在細(xì)胞周圍的ETEC F4ac表達(dá)綠色熒光（圖4-B），可以清楚觀察細(xì)菌對細(xì)胞的粘附狀態(tài)，且ETEC F4ac導(dǎo)入熒光質(zhì)粒后不改變其對宿主細(xì)胞的胞粘附能力（圖5）。

圖4 顯微鏡下兩種菌株與IPEC-J2粘附視野

圖5 熒光質(zhì)粒對細(xì)菌粘附力的影響

2.5 轉(zhuǎn)化菌株與未轉(zhuǎn)化菌株的生長曲線對比

以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制的轉(zhuǎn)化菌株ETEC F4ac-GFP和未轉(zhuǎn)化菌株ETEC F4ac的生長曲線如圖6所示。從圖中可以看出，兩種菌株的生長狀況基本一致，1～5 h處于生長對數(shù)期，5 h后進(jìn)入生長穩(wěn)定期。由此可知，pTurboGFP-B質(zhì)粒不會對ETEC F4ac的生長繁殖造成影響。

圖6 兩種菌株的生長曲線

2.6 轉(zhuǎn)化菌株與未轉(zhuǎn)化菌株毒力檢測

CCK-8結(jié)果（圖7-A）顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)化菌株ETEC-F4ac-GFP組與未轉(zhuǎn)化菌株ETECF4ac組細(xì)胞活性顯著下調(diào)（P＜0.05），且兩組差異不顯著。qRT-PCR結(jié)果（圖7-B）顯示，與對照組相比，ETEC-F4ac-GFP組與ETEC-F4ac組炎癥因子和凋亡基因顯著上調(diào)（P＜0.05），且兩組差異不顯著。綜上所述，ETEC-F4ac-GFP會引起細(xì)胞免疫反應(yīng)且導(dǎo)入熒光質(zhì)粒不改變其對宿主細(xì)胞的毒力。

圖7 兩種菌株對IPEC-J2細(xì)胞的毒力比較（數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3，差異顯著性P＜0.05）

3 討論

ETEC是導(dǎo)致新生仔豬和斷奶后仔豬腹瀉的重要病原菌。該細(xì)菌進(jìn)入仔豬腸道后，利用其菌毛（也稱黏附素）和宿主小腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合以避免腸道蠕動(dòng)和腸液沖刷，從而定植在仔豬腸道內(nèi)，接著產(chǎn)生耐熱性腸毒素STa、STb和不耐熱性腸毒素LT，從而導(dǎo)致仔豬腹瀉[9]。ETEC與仔豬小腸上皮細(xì)胞的結(jié)合是引起仔豬腹瀉的關(guān)鍵因素，因此需要有效的方式觀察其與宿主細(xì)胞的粘附狀態(tài)。ETEC F4主要定植在空腸與回腸[10]。而IPEC-J2是從新生仔豬空腸中分離的上皮細(xì)胞，所以是研究ETEC致病機(jī)理的良好體外模型[11-12]。

近年來，基因標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為研究病原體和宿主互作提供了強(qiáng)有力的工具。熒光蛋白標(biāo)記是分子標(biāo)記的一種重要方法，它不需要其他輔助生物發(fā)光標(biāo)記系統(tǒng)即可發(fā)出強(qiáng)烈熒光，具有操作簡單、檢測方便等特點(diǎn)，因此被廣泛利用于生物學(xué)的研究中[13-15]。研究[16-17]表明，將GFP轉(zhuǎn)入ETEC并不會影響菌株的生長特性，且質(zhì)粒會隨大腸桿菌穩(wěn)定傳代，不易丟失。

本研究利用電擊轉(zhuǎn)化法將帶有綠色熒光蛋白的原核表達(dá)載體pTurboGFP-B轉(zhuǎn)化ETEC，并感染IPEC-J2細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞和細(xì)菌的結(jié)合情況。在明場光照射下，可以看見細(xì)胞形態(tài)，但由于細(xì)菌的半透明性質(zhì)，在明場下不易進(jìn)行觀察。而在藍(lán)色激發(fā)光的照射下，觀察到了綠色熒光蛋白的表達(dá)，可以清晰地看見絕大多數(shù)ETEC菌株都粘附在細(xì)胞周圍，且并不改變對IPEC-J2細(xì)胞的粘附能力。而且與未轉(zhuǎn)化菌株比較，GFP的導(dǎo)入不會改變菌株的生長繁殖速度。

CCK-8是一種通過吸光值檢測細(xì)胞活性的方法。通過CCK-8試驗(yàn)得出，未轉(zhuǎn)化菌株、轉(zhuǎn)化菌株與對照組相比都顯著降低了IPEC-J2細(xì)胞的活性，且兩種菌株之間差異不顯著。兩種菌株感染IPEC-J2細(xì)胞后，炎癥因子基因IL1A、TNF、CXCL2和凋亡基因PUMA、GADD45B的表達(dá)量與對照組相比顯著上調(diào)，但兩種菌株之間差異不顯著，說明GFP轉(zhuǎn)入ETEC F4ac并不會影響菌株毒力。以上結(jié)果表明：本研究成功將pTurboGFP-B質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ETEC F4ac菌株中；轉(zhuǎn)化菌株與未轉(zhuǎn)化菌株在繁殖速度以及對IPEC-J2細(xì)胞的粘附能力和毒力上無明顯差異，說明pTurboGFP-B質(zhì)粒的導(dǎo)入并未改變該菌株原有的生理代謝和生物學(xué)功能，而且質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳性較好。這與GFP導(dǎo)入其他菌株的結(jié)果一致[18-19]。

4 結(jié)論

本研究使用綠色熒光蛋白標(biāo)記ETEC，便于更直觀形象地研究病原菌與宿主細(xì)胞相互作用的動(dòng)態(tài)進(jìn)程，為研究病原菌感染細(xì)胞的分子機(jī)制提供了技術(shù)支持；通過建立的病原菌感染豬小腸細(xì)胞模型，采用普通熒光顯微鏡即可直觀觀測ETEC與宿主細(xì)胞的粘附情況；建立的熒光標(biāo)記ETEC熒光表達(dá)可靠性強(qiáng)，遺傳表達(dá)穩(wěn)定性高，而且不影響其生長繁殖速度和毒力，為研究病原菌-宿主細(xì)胞的相互作用提供了工具菌株，并為進(jìn)一步闡明ETEC致病機(jī)理及尋找其小腸上皮細(xì)胞特異性受體奠定了研究基礎(chǔ)。