張光際，蔡 偉，胡佳偉，崔超越，吳蓮玉，魏旭峰，4

（1.泰州職業(yè)技術學院醫(yī)學院，江蘇泰州 225300；2.江蘇美鳳力醫(yī)療科技有限公司，江蘇泰州 225300；3.江蘇鉑可醫(yī)療科技有限公司，江蘇泰州 225300；4.無錫明慈心血管病醫(yī)院，江蘇無錫 214000）

豬圓環(huán)病毒?。╬orcine circovirus disease，PCVD）是一種廣泛流行的豬傳染性疾病，由豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV-2）感染引起[1-3]。斷奶仔豬對本病最易感，臨床表現(xiàn)為多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multysystemic wasting syndrome，PMWS）、豬皮炎-腎病綜合征、繁殖障礙、肺炎、腸炎、先天性震顫等諸多疾病，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。目前PCV-2感染尚無有效治療措施，且病毒抵抗力強，豬場凈化難度高，因此疫苗接種是當前最有效的防控手段之一[4]。針對不同日齡的仔豬可以選擇滅活疫苗或亞單位疫苗，各種商業(yè)化疫苗己在世界各地養(yǎng)殖場廣泛應用，但目前常用的有針注射方式存在針刺痛感明顯、注射耗時、操作不便等缺點[5-6]。無針注射器與皮膚碰撞后使皮膚外層的角質層發(fā)生振蕩，產(chǎn)生肉眼看不見的小空隙，通過動力源推動活塞作用于藥室，快速形成壓力，使藥物通過噴嘴的速度可達100～200 m/s，藥液以一股極細的射流穿透皮膚，當射流在皮膚內受阻其速度衰減到一定程度時開始呈多向分散，均勻分布在皮下或皮內，整個過程在100 μs內快速完成[7-9]。無針注射用于疫苗接種具有注射效率高、避免交叉感染、抗原分散高和動物疼痛感低等優(yōu)點。但有報道[10]稱，對山羊進行無針免疫保護率維持時間短，免疫效果不確定，其在獸醫(yī)領域應用有待進一步觀察。無針注射臨床人用以治療糖尿病給藥多見，而針對仔豬進行無針免疫的評價則較少[11]。本試驗分別采用有針注射器和無針注射器為仔豬接種PCV-2亞單位疫苗，觀察仔豬注射后的臨床表現(xiàn)并評估免疫效果，以期為采用無針注射器接種疫苗提供相關數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

40頭3～5周齡三元豬（PCV-2抗原/抗體檢測均為陰性，無其他免疫抑制性疾病病原，個體均勻），由泰州泰和生物科技有限公司提供。

1.2 主要試驗材料

PCV-2亞單位疫苗（Ingelvac CircoFLEX，批號3091476B），由勃林格殷翰動物保?。绹┯邢薰咎峁籔CV-2抗體ELISA檢測試劑盒（批號20220507），購自韓國金諾（MEDIAN）診斷試劑株式會社；POK-V-MBX獸用無針注射器，由江蘇鉑可醫(yī)療科技有限公司提供；傳統(tǒng)有針注射器，購自江蘇科倫醫(yī)療器械制造有限公司；MR-96A酶標儀，購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.3 試驗分組及指標

選擇3～5周齡PCV-2抗原/抗體陰性、無其他免疫抑制性疾病病原、個體均勻的三元豬仔豬40頭，隨機分成4組（10頭/組），分別為有針組（耳后肌肉注射1.00 mL，1頭份）、無針免疫低（耳后接種0.25 mL，1/4頭份）、中（耳后接種0.50 mL，1/2頭份）、高（耳后接種1.00 mL，1頭份）劑量組。分別于分組后第1天和第21天分2次免疫對應劑量的PCV-2亞單位疫苗，并于首次接種后7、14、21、28、42 d采血，靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，取上清待檢。

按照PCV-2抗體ELISA試劑盒說明書測定抗體效價，在630 nm處通過酶標儀測定各孔吸光度。S/P≥0.4，判定PCV-2抗體陽性，S/P＜0.4，判定PCV-2抗體陰性。比較不同劑量、方法接種疫苗后抗體產(chǎn)生情況。首次免疫后對所有試驗動物連續(xù)觀察42 d，觀察指標包括：臨床癥狀（精神、采食、飲水、行為）、首次免疫后42 d接種局部的大體觀察、試驗動物始末體質量。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件對計量資料進行統(tǒng)計分析，以單因素方差分析法對各組數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，結果以“平均數(shù)±標準誤（）”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果

2.1 不同免疫方法對動物臨床表現(xiàn)的影響

各組動物經(jīng)不同注射方式免疫后有不同程度的疼痛表現(xiàn)，伴隨免疫后短時的吼叫、自主行為增加。有針注射組注射時掙扎時間較長，痛感明顯；無針免疫低、中、高劑量組動物疼痛表現(xiàn)有一定的劑量依賴性，隨注射次數(shù)增加，注射時吼叫加重，單次接種時疼痛表現(xiàn)較輕，表現(xiàn)為一過性疼痛，注射后表現(xiàn)良好。各組動物經(jīng)不同方式注射后的精神狀態(tài)、進食狀況、飲水狀況、自發(fā)行為、注射部位等均未見異常。

2.2 不同免疫方法對動物體質量的影響

試驗開始前各組動物體質量均勻，組間體質量未見差異（P＞0.05），分組具有可比性。試驗結束后各組動物體質量未見差異（P＞0.05）。與有針注射組動物比較，無針免疫低劑量組試驗動物在試驗周期內增加的體質量和平均日增重顯著增加（P＜0.05），其余各組動物體質量未見差異（P＞0.05）。結果表明小劑量無針免疫的方式可以促進仔豬生長，免疫次數(shù)增加則增重效果消失。具體結果見表1。

表1 試驗周期內各組動物體質量變化（，n=10）

表1 試驗周期內各組動物體質量變化（，n=10）

注：*表示與有針注射組比較，差異顯著（P＜0.05）。

2.3 不同免疫方法對動物抗體陽性率的影響

各組動物免疫后PCV-2抗體均有不同程度表達。首次免疫后各組動物體內抗體均可在第2周達到100%陽性。有針注射1頭份亞單位疫苗免疫后第3周陽性率有所下降，為80%，經(jīng)過第2次免疫，可有效升至100%，保護效果較佳。無針免疫1/4頭份亞單位疫苗組動物體內抗體第1周即可達到80%陽性率，隨后升至100%，二次免疫后可有效維持100%抗體陽性率。無針免疫1/2頭份亞單位疫苗組動物體內抗體第1周即可達到90%陽性率，隨后維持100%陽性。無針免疫1頭份亞單位疫苗組動物體內抗體第1周陽性率50%，第2周其可迅速提高陽性率至100%，并維持到試驗結束。具體結果見圖1。

圖1 不同免疫方法對動物抗體陽性率的影響

2.4 不同免疫方法對動物體內抗體水平的影響

以不同方式進行PCV-2亞單位疫苗免疫后，各組動物體內抗體水平均呈現(xiàn)不同程度的升高，二次免疫后抗體升高更顯著。與有針注射組動物比較，無針免疫組1頭份亞單位疫苗單次免疫1周后抗體水平較低（P＜0.05），第2周抗體水平顯著升高，二次免疫后抗體水平顯著高于有針注射組（P＜0.05），隨后極顯著高于有針注射組（P＜0.01）；無針免疫低、中劑量組動物體內抗體水平未見差異（P＞0.05），免疫后各階段抗體水平與有針注射組相當（P＞0.05）。與無針免疫低劑量組動物比較，中劑量組動物免疫后體內抗體水平未見差異（P＞0.05），高劑量組動物二次免疫后體內抗體水平較高（P＜0.05，P＜0.01）。與無針免疫中劑量組動物比較，高劑量組動物二次免疫后體內抗體水平均較高（P＜0.05，P＜0.01）。具體結果見表2。

表2 不同免疫方法對動物體內抗體水平S/P的影響（，n=10）

表2 不同免疫方法對動物體內抗體水平S/P的影響（，n=10）

注：與有針注射組比較，*表示差異顯著（P＜0.05），** 表示差異極顯著（P＜0.01）；與無針免疫低劑量組比較，#表示差異顯著（P＜0.05），##表示差異極顯著（P＜0.01）；與無針免疫中劑量組比較，&表示差異顯著（P＜0.05），&&表示差異極顯著（P＜0.01）。

3 討論

動物疫病免疫是指使動物淋巴細胞通過對疫苗的識別、活化、增殖、分化，最后產(chǎn)生免疫效應分子（抗體和細胞因子）及免疫效應細胞，從而使動物機體獲得對特定病原微生物的特異抵抗能力。該特異抵抗能力可以增強動物抗病力，從而達到預防某種動物疫病的目的。目前動物疫病免疫的主要方法有滴眼、滴鼻、注射及口服免疫等方式。其中，注射免疫具有應用廣、可靠性高、經(jīng)濟有效等優(yōu)點，是動物疫病預防的重要手段[12]。注射免疫過程中需要注意注射器械的滅菌與注射部位的消毒，根據(jù)疫苗接種需要，合理選擇不同規(guī)格的針頭。針頭不能太短，避免因針頭短導致疫苗注射在皮下，也不能太長，針頭太長在接種完疫苗抽出時容易造成疫苗溢出，特別是皮下注射[13-14]。因此現(xiàn)行的注射免疫方法存在一定短板。

無針接種疫苗具有可簡化給藥過程、提高接種人員的職業(yè)安全性、消除注射位點疼痛、減少接種成本以及獲得更好的免疫原性等優(yōu)勢。無針注射可以在100 μs內將疫苗快速、均勻接種到皮下或皮內[15]。皮膚由表皮、真皮和皮下組織（脂肪層）組成，是外傷和感染的第一道物理和免疫屏障，比肌肉具有更強的免疫原性。真皮層內有高濃度的樹突狀細胞（dendritic cell，DC），通過捕獲和呈遞抗原來誘導和調節(jié)天然免疫反應。此外，真皮層還有豐富的淋巴和血管。皮內接種后，DC吞噬抗原被激活，這些活化的細胞遷移到淋巴結，從而依次激活B淋巴細胞。疫苗誘導的局部炎癥反應可吸引炎性細胞，這些細胞可分化為DC和巨噬細胞，參與免疫應答。因此，無針皮內免疫反應過程可能比有針肌肉注射疫苗免疫反應更快、更安全有效[16-17]。與有針注射相比，無針注射產(chǎn)生的免疫應答情況持平或更強，能夠誘導更高水平的抗體滴度和血清抗體轉換率。同時，相比有針注射器注射疫苗后在組織中形成球形液體，無針注射器注射的疫苗形成的高壓射流，在組織中分散較好，無針注射技術在大規(guī)模免疫接種領域可以發(fā)揮更大作用[18-19]。

本試驗無針免疫后動物的耐受、自發(fā)活動、精神狀態(tài)、飲食飲水等均未見異常。與有針注射組動物比較，無針注射低劑量組動物試驗期間體質量增加量和日均增重量均有所提高，反映出無針免疫相對有針注射造成的免疫應激更小，無針注射的免疫方式更加安全可靠，減量免疫即可達到同等免疫效果，可以縮短免疫時間，便捷操作，同時可以節(jié)約免疫成本，有效促進仔豬生長。

本試驗表明，兩種免疫方式均可達到理想免疫效果。4組試驗動物經(jīng)2次免疫后體內抗體陽性率均達到100%，且均可以有效維持到試驗結束。無針免疫低、中劑量組動物體內抗體響應速度及二次免疫后保護效果與有針注射組動物無差異。有針組通過耳后肌肉注射，以球形液滴的形式存在于耳后肌肉組織，分散度欠佳，單次免疫第3周抗體陽性率降為80%，單次免疫抗體維持時間較短，造成一定階段的風險暴露；無針免疫通過高壓射流使疫苗迅速均勻接種到耳后皮下或皮內，迅速激活DC、B淋巴細胞，誘導更高的抗體滴度應答和血清抗體轉換率，并可以有效維持整個周期的有效免疫。無針免疫高劑量組動物體內抗體產(chǎn)生減慢，推測原因可能是由于多次免疫刺激，短時間4次重復免疫0.25 mL亞單位疫苗導致短時高速噴射入動物皮下和皮內的疫苗聚集，抗原劑量非最適免疫劑量，隨著吸收時間延長及2次免疫迅速激活抗原識別后，無針注射產(chǎn)生疫苗分散度較高的優(yōu)勢得以體現(xiàn)，同等劑量的疫苗經(jīng)有針和無針兩種方式進行2次免疫后，無針注射的動物體內抗體濃度更高。

綜上所述，采用無針注射器進行PCV-2亞單位疫苗接種安全、有效，降低免疫劑量仍可達到理想的免疫效果，且可以促進仔豬生長，實現(xiàn)全周期保護。綜合無針注射的免疫方式耗時短、避免交叉感染等特點，可以推廣為養(yǎng)豬業(yè)相關疫苗接種的有效方式。試驗中每組10頭豬的數(shù)量相對較少，在后續(xù)研究中課題組將進一步擴大受試動物數(shù)量和研究內容，更全面地評估無針免疫效果。