石艷萍，陳弟詩，王 印，陳 斌，楊 悅，張鵬飛，李 春，邵 靚

（1.四川省動物疫病預防控制中心，四川成都 610041；2.四川農業(yè)大學，四川成都 611130）

PCR是普遍應用的病原微生物分子生物學檢測方法，可針對微生物的核酸片段進行檢測，但無法區(qū)分樣本中微生物的活死狀態(tài)。21世紀初，Nogva等[1]和Rudi等[2]將疊氮溴化乙錠（ethidium monoazide bromide，EMA）與PCR技術相結合，用于活死微生物的區(qū)別鑒定，顯著提高了鑒定靈敏度和速度。后來的研究者發(fā)現(xiàn)，EMA會造成活微生物60%的基因組損失，所以選擇了替代物——疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）。PMA類似于碘化丙啶（propidium iodide，PI），因在菲環(huán)中加入疊氮基團并使其具有雙正電荷，被認為是第二代DNA插層染料。PMA不會進入活細胞，也不會滲透到輕微受損的細胞中，因此在區(qū)分活死細胞方面更具特異性。本文對PMA-PCR檢測方法的基本原理、影響因素及其在動植物疫病防控、食品安全、公共衛(wèi)生等領域的應用進行了初步探討。

1 PMA-PCR原理

PMA是一種具有高親和力的光敏反應DNA結合染料，分子結構式如圖1-A。它自身的熒光非常微弱，但在結合核酸后熒光信號顯著增強。PMA傾向于結合雙鏈DNA，其光敏性疊氮基團生成高反應性的氮賓基團，與羥基化合物共價結合，形成穩(wěn)定的DNA修飾（圖1-B）。具有雙正電荷的PMA無法穿過有生物活性的細胞膜，而活死微生物最大的區(qū)別在于細胞膜的完整性?；钗⑸锏募毎ぞ哂羞x擇透過性，能夠將PMA排除在細胞膜外，而死微生物則不能。將微生物樣本懸液與PMA溶液混合后，PMA穿透死微生物受損的細胞膜與DNA結合，每分子的PMA可以和10～80 bp的DNA分子結合，在可見光（最大460 nm）照射下，分解產生一種氮烯類物質，其與DNA發(fā)生交聯(lián)反應，這種共價交聯(lián)產物可以抑制DNA的PCR擴增[3]。此外，這種共價交聯(lián)產物能夠在DNA提取過程中連同細胞碎片一同被除去。同時，殘留的PMA與反應體系中的水分子反應生成羥胺而失去反應活性，不會對活細胞以及活細胞裂解后裸露的DNA造成影響。因此，通過這種機制，PMA可以插入死微生物的DNA中，通過抑制其PCR擴增，從而達到只檢測活微生物的目的。

圖1 PMA的分子式及作用機理

2 PMA-PCR與其他分子生物學檢測方法的比較

分子生物學檢測方法有傳統(tǒng)PCR、qPCR、數(shù)字PCR[4-5]、環(huán)介導等溫擴增[6-8]、聚合酶交聯(lián)螺旋反應、交叉引物擴增[9-10]、重組酶聚合酶擴增[11-13]，基于CRISPR的核酸檢測[14]以及高通量測序等技術。PMA-PCR與這些技術相比，可有效鑒別樣本中的活死病原微生物，這是其他幾種方法無可比擬的（表1）。

表1 PMA-PCR與其他分子生物學檢測方法的比較

3 PMA-PCR影響因素

在實際應用中，PMA-PCR的檢測結果受樣本濁度、活死微生物的比例、PMA濃度、暗處理條件、曝光條件、樣本處理方法以及目的基因擴增長度的影響。

（1）不同來源樣本濁度不同，其中高濁度樣本常常含有影響PMA作用的物質，不僅會降低染料的作用，還會干擾PMA與DNA的交聯(lián)反應，因此適宜的樣本濁度對檢測結果極其重要。研究表明，當樣本濁度低于10 NTU時，PMA的處理對于檢測結果幾乎沒有影響[15]。

（2）樣本中活死微生物的比例過低或者過高會使檢測結果不準確。對于不同病原微生物，采用PMA-PCR方法檢測時活微生物含量的最低檢出限不一樣，比如地衣芽孢桿菌活菌膠囊中金黃色葡萄球菌的最低檢測閾值是1×104CFU/mL[16]，植物乳桿菌純培養(yǎng)物的最低檢測閾值為15拷貝/反應體系[17]。此外，Nocker等[18]在運用PMA-PCR方法測定污水中的大腸桿菌時發(fā)現(xiàn)，此方法更適用于測試低于10%活細胞的混合比例樣本，當活細胞大于50%時，該方法不能有效區(qū)分細菌死活狀態(tài)。

（3）PMA濃度對于暗處理階段PMA與DNA的結合尤為重要。在此階段，PMA溶液的濃度過低，就不能完全結合DNA，濃度過高則可進入活微生物內造成假陽性結果。

（4）暗處理溫度及處理時間也是重要的影響因素。暗處理溫度會影響細胞膜的流動性和通透性。研究[19]證實，25 ℃為最佳處理溫度。合適的暗處理時間不僅能充分保證PMA與死微生物內的DNA完全結合，還能夠阻止PMA與活微生物內的DNA結合。不同微生物的暗處理時間不同，但大多數(shù)處理時間為5 min。

（5）曝光處理的光源和光處理時間也非常重要。不同光源的發(fā)射光譜不同，目前最常使用的光源為500～750 W的鹵素燈，波長為465 nm的發(fā)光二極管也能夠達到相同的效果。曝光時將樣品放置在離光源20～30 cm處，一般采用的光照時間為2～20 min，光照時間過短反應不完全，光照時間過長會導致微生物死亡。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，鹵素燈產生的熱量也會造成微生物死亡[20]。

（6）樣本處理方法對檢測結果也有很大影響。例如，由于紫外線處理不會立即引起細胞膜破損[21]，PMA不能進入死細胞內，因此PMA-PCR檢測不適用于紫外處理后的活細胞檢測。

（7）目的基因擴增長度也會影響PMA-PCR結果，擴增的長度越長，PCR的抑制率越高。

4 PMA-PCR的應用

4.1 動物疫病診斷

PMA-PCR方法可應用于動物疫病診斷、病原微生物活力鑒定、生物多樣性分析，并有助于在流行病學調查中通過鑒別各環(huán)節(jié)病原微生物的傳染性來精準發(fā)現(xiàn)疫病的傳播途徑[22-24]。Farhan等[25]對13份細菌分離培養(yǎng)陰性的乳樣品進行PMA-PCR檢測，并對純化的PCR擴增產物進行DNA測序，結果分析鑒定出7種類型的病原菌。相對于常規(guī)細菌分離培養(yǎng)，PMA-PCR檢測更有利于乳汁中病原菌的檢測，從而有助于亞臨床乳腺炎的快速診斷。

為評估加熱對弓形蟲卵囊活力的影響，Rousseau等[26]將未處理和熱殺死（99 ℃，5 min）的弓形蟲卵囊與PMA結合后孵育，并通過共聚焦顯微鏡和流式細胞術分析卵囊的染料滲透性。同時，通過優(yōu)化PMA濃度、孵育溫度以及選定目標基因和擴增片段長度等反應條件和參數(shù)，建立了可識別特異性活弓形蟲卵囊的PMA-qPCR方法。有研究[27]發(fā)現(xiàn)，PMA-PCR對布魯氏菌S2株的檢測敏感性比常規(guī)PCR方法高100倍，能夠快速評估體內或者胞內布魯氏菌的生存狀態(tài)，有助于疾病診斷。利用PMA不能穿透完整的病毒包膜結構，但能非特異性修飾核酸分子，使其不能通過qPCR擴增的特性，Zeng等[28]采用PMA結合qPCR檢測樣品中是否具有包膜結構完整的非洲豬瘟病毒粒子，用于鑒別非洲豬瘟病毒的感染性。

此外，PMA-PCR也可應用于生物多樣性分析。南美對蝦儲存樣品經過PMA前處理與未經過PMA前處理，在微生物群落結構上存在明顯差異。例如：4 ℃條件下，微桿菌屬是樣品中最主要的微生物，未經PMA處理的南美對蝦貯藏5 d后，微桿菌屬在樣品菌群中的比例可高達60%，而經過PMA處理的蝦樣其比例僅為45%；在30 ℃條件下，弧菌屬是最主要的微生物群落組成成分，隨著貯藏時間的增加，其在未經PMA處理對照組的比例變化趨勢為先減少后增加（2%～38%），而經PMA處理在貯藏期間卻沒有顯著變化（30%～40%）[29]。

4.2 植物病原微生物檢測

細菌和真菌感染會對植物生長造成不良影響。目前，PMA-PCR技術不僅應用于柑橘黃龍病菌、黃瓜細菌性角斑病菌、獼猴桃潰瘍病菌、胡蘿卜和玉米細菌性枯萎病菌的活菌檢測，還可以用來檢測多種花和果實中的病菌，以及田間和土壤中存活的孢子等[30-36]。Da Cunha等[37]建立了PMA-qPCR方法以評估巴西固氮螺菌在玉米根中的活力，通過比較qPCR、PMA-qPCR和平板計數(shù)的結果，發(fā)現(xiàn)玉米根中qPCR計數(shù)高于PMA-qPCR計數(shù)和平板計數(shù)。與依賴培養(yǎng)的方法相比，PMA-qPCR法在定量檢測活細胞方面更快速、準確。由青枯菌引起的桑青枯病是我國的一種毀滅性作物病害。曹夢琪[38]從患有青枯病的桑樹根部組織中分離到青枯菌菌株，用PMA對其進行預處理，發(fā)現(xiàn)可完全抑制107CFU/mL死菌中的DNA，且不會對活菌DNA擴增造成影響，能從活死菌混合體系中有效分辨出活菌。目前也構建了橡膠樹白粉病PMAqPCR檢測體系，為及時高效檢測橡膠樹白粉菌分生孢子活菌量提供了技術支撐[39]。

4.3 食品行業(yè)檢測

PMA在食品行業(yè)的應用已取得了一定發(fā)展，可以用來檢測各種食物樣品中大腸桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌等的活菌含量[40-46]。PMA-qPCR方法可以在牡蠣樣品中計數(shù)活的大腸桿菌，雖然可能有假陽性，但與使用依賴培養(yǎng)的方法相比，其操作更簡便，結果所需時間更短[47]。周陽等[48]研究證實，1.0 mg/mL質量濃度的PMA在單增李斯特菌的檢測中能有效提高活菌檢出率。海德堡腸道沙門氏菌能夠引起食源性感染。利用PMA-qPCR方法，可鑒別區(qū)分海德堡沙門氏菌和其他沙門氏菌，并顯示出100%的特異性[49]。PMA-qPCR還能夠對新鮮和加工肉類樣品中活的但不可培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、產氣莢膜梭菌和腸桿菌科細菌進行定量檢測[50]。此外，曹瀟等[51]發(fā)現(xiàn)，當PMA溶液質量濃度為3 μg/mL時，在650 W鹵素燈曝光5 min的條件下，PMA能夠完全抑制1.2×107拷貝/mL的死食源金黃色葡萄球菌核酸擴增。PMA-PCR也可用于檢測黃酒釀造過程中5種乳桿菌的活菌數(shù)[52]，以及檢測人工添加奶粉、米粉、酸奶樣品和凍干樣品中的植物乳桿菌[17]。

4.4 公共衛(wèi)生檢測

隨著PMA-PCR在其他領域的成功應用，這種方法也被應用于一些人類疾病的診斷。PMA-PCR能夠被應用于植入假體造成關節(jié)感染時葡萄球菌、腸球菌屬和痤瘡皮桿菌的活菌鑒定，在PMA質量濃度為10 μg/mL、暗培養(yǎng)5 min、光激活10 min時，該方法的敏感性為79%，特異性為89%，與普通PCR相比，特異性和敏感性顯著提高[53]。郁震等[54]發(fā)現(xiàn)，PMA 質量濃度范圍在5～10 μg/mL時，可以區(qū)分卡介苗死菌和活菌，并且能夠被檢測到的最小活菌濃度是3×104CFU/mL；當卡介苗濁度小于10 NTU時，PMA能有效抑制死細胞DNA的PCR擴增，而當濁度大于50 NTU時，PMA失去效果。而霍亂弧菌在12.5 μg/mL的PMA質量濃度時與qPCR技術相結合，可抑制106CFU/mL霍亂弧菌死菌的DNA擴增[55]。李聰聰[21]發(fā)現(xiàn)，當大腸桿菌活菌/總菌＞1%時，經PMA預處理，可以消除膜損傷菌DNA的干擾，實現(xiàn)對活菌的定量檢測。劉丹丹等[56]通過優(yōu)化PMA預處理條件，建立了新型冠狀病毒PMA-RT-qPCR檢測方法；用建立的檢測方法對采用含氯消毒劑滅活和不同溫度熱滅活的病毒進行檢測，評估其檢測病毒活性的效果，為判斷樣本中病毒的感染性提供了輔助手段。此外，PMA-qPCR可用于檢測水環(huán)境中的病原。過濾水樣經PMA處理后，通過降低受損細菌的信號來避免qPCR的假陽性結果，有助于健康風險評估和微生物風險定量評估，例如用PMA-qPCR可快速檢測游泳池中銅綠假單胞菌[57]。

5 結語

PMA-PCR 作為一種能夠有效區(qū)分活死微生物的新型核酸擴增方法，現(xiàn)階段已被初步應用于動植物疫病防控、食品安全、公共衛(wèi)生等多個領域。PMA除了與PCR交聯(lián)使用，還能夠與其他分子生物學技術聯(lián)合用于活死微生物區(qū)分。如：PMA結合環(huán)介導等溫擴增技術（PMA-LAMP）檢測結核桿菌和金黃色葡萄球菌，其靈敏度及特異性明顯優(yōu)于PMA-PCR。而將鈣黃素聯(lián)合PMA-LAMP檢測食品中活微生物的方法直觀、快速，又準確[58]。雖然PMA-PCR檢測方法在檢測病原微生物狀態(tài)時具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢，但其精確性和靈敏度還有待進一步提高；因不同病原微生物理化特性不同，需要分別對其PMA預處理條件進行摸索；病原感染性由病原自身致病力、宿主免疫狀態(tài)、宿主生存環(huán)境等多方面決定，運用該方法鑒定病原感染性時需綜合評估。隨著對該技術特異性、敏感性、適用性等方面的不斷探索，相信未來該技術具有更廣闊的應用前景。