劉照生，羅春蕊，孫艷紅，趙曉南，陳瑤瑤，張美玲，周潔楠

（云南省疾病預防控制中心流感網(wǎng)絡實驗室，云南昆明 650034）

禽流感是一種由禽流感病毒（AIV）引起的禽類傳染病[1]。AIV除感染禽類外，也可以感染哺乳動物和人類，與受感染禽類及其糞便和分泌物接觸是主要感染途徑[2]。根據(jù)神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）和表面蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）差異，AIV可被分成許多亞型，目前已鑒定出11種NA亞型和18種HA亞型[3]。我國1994年首次報道在雞群中發(fā)現(xiàn)AIV[4-5]，1997年首次報告發(fā)生H5N1亞型疫情，并且證明了H5N1亞型AIV能夠威脅人類生命安全[6]。此后，H6N1、H7N2、H7N3、H7N9、H9N2、H10N3、H10N8等亞型AIV相繼在我國被發(fā)現(xiàn)[7-11]。持續(xù)的禽流感暴發(fā)和流行，使AIV基因重組的可能性增加，對人類健康構成了巨大威脅。云南省禽類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)較發(fā)達，禽類交易市場、禽類屠宰加工廠數(shù)量多且分布廣泛，農(nóng)村地區(qū)有大量的散養(yǎng)禽類，同時也有大量的候鳥、野生禽類的聚居地和濕地，因此云南省AIV傳播和擴散的危險較高[12]。為做好禽流感防控工作，降低人和家禽的感染風險，為疫情研判、預警和風險評估提供依據(jù)，2019-2022年開展了云南省禽類相關外環(huán)境AIV監(jiān)測工作。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

根據(jù)《職業(yè)暴露人群血清學和環(huán)境高致病性禽流感監(jiān)測方案》（2011年版）[13]的要求，在云南省16個州（市）139個監(jiān)測點（涵蓋家禽規(guī)模養(yǎng)殖場、野生候鳥棲息地、城鄉(xiāng)活禽市場、家禽散養(yǎng)戶集中地區(qū)、家禽屠宰加工廠等），隨機采集糞便、禽類飲水、籠具、清洗禽類污水、宰殺或擺放禽肉案板等環(huán)境樣本，每個監(jiān)測點每季度采集外環(huán)境樣本至少10份，于4 ℃、48 h內(nèi)送往所在市（州）疾病預防控制中心國家流感/禽流感監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室進行AIV核酸檢測，并將陽性樣品一式三份分裝，全部送到云南省疾病預防控制中心國家流感網(wǎng)絡實驗室進行H5、H7和H9等亞型分型鑒定。

1.2 核酸檢測

對各州（市）采集的禽類相關外環(huán)境樣品，使用病毒RNA提取試劑盒（江蘇碩世生物科技股份有限公司產(chǎn)品，型號SDKF60102）提取核酸，嚴格按照說明書進行操作。應用實時熒光定量PCR技術，對樣品進行AIV核酸檢測及亞型分型鑒定。H5、H7、H9亞型的引物和探針序列，由國家流感中心提供。反應體系為美國Life公司的AgpathIDTMOnestep RT-PCR Kit試劑（AM1005）。其他N亞型（N2～5、N7～8）亞型核酸檢測試劑盒，以及部分市（州）的商品化試劑盒，購自江蘇碩世生物科技股份有限公司，并嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計分析

利用WPS Office 2019和SPSS 25.0軟件，對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計和整理，利用χ2檢驗進行陽性率比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義；利用 Mapinfo軟件，根據(jù)樣本核酸陽性率，統(tǒng)計分析不同時間、不同地區(qū)以及不同場點、樣本、亞型的分布特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 整體情況

2019—2022年，在云南省16個州（市）139個監(jiān)測場點共采集外環(huán)境樣本3 235份。其中：家禽散養(yǎng)集中區(qū)域樣本326份、城鄉(xiāng)活禽市場樣本2 263份、野生鳥類棲息地樣本209份、家禽規(guī)模養(yǎng)殖場樣本411份、家禽屠宰加工場樣本26份；禽類糞便樣本984份、籠具表面擦拭樣本703份、宰殺或放置禽肉案板表面擦拭樣本565份、禽類飲水樣本413份、禽類清洗廢水樣本570份。

檢測結(jié)果（表1）顯示：共檢出1 124份AIV核酸陽性樣本，總陽性率為34.74%（1 124/3 235）；2019-2022年的年均陽性率分別為28.76%（222/772）、26.31%（161/612）、38.06%（317/833）、41.65%（424/1 018），陽性率逐年提高，不同年份間存在顯著差異（χ2=56.86，P＜0.001）。各亞型占比從高到低依次為H9亞型（88.88%，999/1 124）、H5與H9混合型（4.27%，48/1 124）、未分型（3.47%，39/1 124）、H5亞型（3.02%，34/1 124）、H7亞 型（0.36%，4/1 124），表 明H9為主要亞型。

表1 2019-2022年度云南省禽類相關外環(huán)境中AIV核酸檢測結(jié)果

2.2 不同監(jiān)測場點情況

不同監(jiān)測場點統(tǒng)計結(jié)果（表2）顯示：在5類監(jiān)測點中，AIV核酸陽性率從高到低依次為城鄉(xiāng)活禽市場（43.61%，987/2 263）、野生禽鳥棲息地（14.83%，31/209）、家禽規(guī)模養(yǎng)殖場（14.6%，60/411）、家禽散養(yǎng)戶（14.11%，46/326）、家禽屠宰加工廠（0，0/26），各監(jiān)測點間的陽性率差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=263.71，P＜0.001）。

2.3 不同類型樣本情況

不同類型樣本統(tǒng)計結(jié)果（表3）顯示：5大類樣本中均有AIV被檢出，其中禽類清洗廢水的陽性率最高，達47.02%（268/570），其他類型樣品的陽性率由高到低依次為籠具表面擦拭樣本（41.82%，294/703）、宰殺或擺放禽肉案板表面拭子樣本（40.71%，230/565）、禽類飲水樣本（30.02%，124/413）、禽類糞便樣本（21.14%，208/984），不同類型樣本的陽性率總體差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=146.66，P＜0.05）。

表3 不同類型樣本的AIV核酸檢測統(tǒng)計結(jié)果

2.4 不同地區(qū)情況

不同地區(qū)統(tǒng)計結(jié)果（表4）顯示：全省16州（市）在4年內(nèi)均檢測到AIV，各州（市）的總陽性率為14.24%～69.62%，其中紅河州（69.62%，165/273）、德宏州（59.23%，77/130）、西雙版納州（48.23%，68/141）總陽性率較高，各地區(qū)間的總陽性率差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=213.06，P＜0.001）。

表4 2019-2022年云南省各市（州）AIV核酸檢測統(tǒng)計結(jié)果

3 討論

禽流感是一種可以引起全身性或呼吸系統(tǒng)疾病的傳染病，其病原具有多種變化，可以在很短的時間內(nèi)轉(zhuǎn)化為高致病性毒株[14]，這在上海市、江西省等地都有報道[15-19]，并從病人的外部環(huán)境中追蹤到了相關病毒，推斷這些病例是由外環(huán)境病毒引起的。

本研究顯示，2019-2022年云南省外環(huán)境樣本的AIV平均陽性率為34.74%，且H5、H9亞型AIV均有檢出，還存在兩種亞型的混合檢出情況，提示H5和H9亞型有基因重組危險。不同亞型AIV由活禽排放到外部環(huán)境后，可在不同物種間進行基因重組，從而實現(xiàn)跨物種傳播[20-21]。本次監(jiān)測結(jié)果顯示，2022年的AIV陽性率高于前3年，且檢出4份H7亞型，表明不同亞型病毒間重配的風險加大。AIV流行加重可能與疫苗接種率和免疫效果下降有關，也可能與交易市場眾多且禽類來源廣泛，禽類檢疫和準入制度落實力度不夠以及禽類相關環(huán)境消毒工作不到位等因素有關。

本次監(jiān)測比較了不同監(jiān)測場點中禽類相關外環(huán)境樣本的AIV核酸陽性率，發(fā)現(xiàn)外環(huán)境樣本陽性率最高的是城鄉(xiāng)活禽市場?；钋菔袌鲋?，各種禽類混合聚集，人與禽類接觸密集，環(huán)境中病毒污染較嚴重，因而增加了人與家禽的感染風險。研究[22]表明，人類感染AIV的最大風險地點為活禽市場，大多數(shù)感染者均有與病/死禽接觸史或有活禽交易場所活動痕跡，說明人與禽類密切接觸是造成人感染的主要途徑。這提示監(jiān)管部門應加大對活禽市場中病死禽的管理力度，加強活禽交易市場內(nèi)環(huán)境的衛(wèi)生清理與消毒，實行定期休市制度，同時也要注重對從事禽類相關工作人員的防護。家禽屠宰加工廠樣本中未檢出陽性，可能與家禽活動范圍小，樣本采集份數(shù)少有關，也可能受采樣時間和采樣地點的影響。

本次監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，所有類別外環(huán)境樣本中均檢出AIV核酸陽性樣本，且陽性率偏高，提示AIV廣泛存在于禽類相關外環(huán)境中。研究[23]發(fā)現(xiàn)，在禽類屠宰、售賣、存放過程中，清洗后的污水、籠具表面、宰殺或放置禽類的砧板表面、禽類飲水、禽類糞便等均為AIV傳播的關鍵風險點。這提示要加強各禽類相關外環(huán)境的消毒工作。屠宰、銷售禽類所用籠具經(jīng)清洗后AIV陽性率仍高達40.71%，說明此類籠具有較高的AIV傳播風險。因此，建議將屠宰或放置禽肉臺面、禽類廢水作為重點消毒處理對象，勤換洗禽水和禽類飲用水，及時清潔案板表面，降低AIV傳播危險。

全省16個州（市）中，紅河州、德宏州和西雙版納州AIV陽性率較高。其原因：一是三地屬于亞熱帶高原季風氣候和熱帶雨林氣候，適宜野生禽類生存，因此野生禽類數(shù)量較多，病毒傳入風險較高；二是農(nóng)村家禽散養(yǎng)居多，飼養(yǎng)條件差，管理粗放，增加了病毒感染風險；三是禽類養(yǎng)殖場、禽類交易市場、流動禽類攤販分布廣泛，市場禽類來源錯綜復雜，病毒傳播風險較高。因此，這3個地區(qū)必須提高警惕，在現(xiàn)有監(jiān)測的基礎上，進一步強化外部環(huán)境AIV監(jiān)測，嚴格監(jiān)管轄區(qū)內(nèi)活禽交易場所，并做好轄區(qū)內(nèi)的死禽無害化處理工作，深入追蹤病毒來源，加強部門間的聯(lián)防聯(lián)控，及時防范禽間疫情發(fā)生以及可能發(fā)生的人感染事件。各州（市）監(jiān)測到的AIV亞型和數(shù)量存在差異，這與各地監(jiān)測點設置、采樣時間、采集樣本類別與數(shù)量有關，可能會引起結(jié)果誤差，因此其他地區(qū)也不能忽視AIV監(jiān)測工作。

4 結(jié)論

綜上所述，云南省禽類相關外環(huán)境中AIV污染逐年加重，污染范圍較廣；血清型較為復雜，以H9亞型占主導優(yōu)勢；活禽市場污染最為嚴重，是AIV感染高風險區(qū)。因此，應進一步加強禽流感監(jiān)測以及活禽市場的衛(wèi)生管理，對重點人群做好防護，降低人間及禽間疫情的發(fā)生風險。