張慧，韓雪瑩，趙婷，張暋

(鄭州金域臨床檢驗中心有限公司 分子病理，河南 鄭州 450000)

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS) 是起源于造血干細胞異常增生的克隆性血液疾病[1]。該病的診斷、預后評估主要涉及細胞形態(tài)學、細胞遺傳學和分子檢測等方法[2]。細胞形態(tài)學和細胞遺傳學作為傳統(tǒng)的檢測方法，存在一定的局限性，對于缺乏典型MDS疾病特征的病例，這些檢測方法無法作為臨床診斷的金標準，目前臨床認為腫瘤的發(fā)病機制與基因突變相關(guān)[3-5]，分子病理的檢測結(jié)果有助于腫瘤的精準治療與分類，所以對MDS及疑似患者進行分子鑒別診斷是重要的檢驗方式[6-7]。本研究選取533例確診或者疑似MDS標本進行分析，使用二代測序(next-generation sequencing，NGS)檢測方法，分析MDS患者基因突變類型的分布情況，并且結(jié)合臨床患者資料和核型檢測結(jié)果分析MDS中的基因突變規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 樣本資料收集鄭州金域臨床檢驗中心2019年8月至2020年9月接受NGS方法檢測MDS相關(guān)基因突變的533例患者的數(shù)據(jù)，每例樣本檢測22個(ASXL1、DNMT3A、U2AF1、TET2、TP53、RUNX1、SETBP1、SF3B1、EZH2、CBL、BCOR、SRSF2、ZRSR2、STAG2、IDH2、NF1、NRAS、JAK2、IDH1、ETV6、PHF6和KRAS)基因突變情況。分析MDS疾病相關(guān)基因突變的類型并繪制突變譜。結(jié)合患者年齡、性別及核型分析結(jié)果。533例患者年齡15～90歲，中位年齡65歲。基因突變陽性347例，其中男220例，女125例，性別不詳2例。

1.2 DNA的提取和NGS的檢測提取乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝血DNA，DNA總量達到1 000 ng。將DNA進行酶切打斷，末端修復后加A尾和接頭。經(jīng)磁珠篩選后用乙醇進行純化，制備文庫。用設(shè)計好的MDS相關(guān)基因探針進行文庫雜交，并對靶基因進行捕獲上機(型號Illumina Nextseq 550)。數(shù)據(jù)分析時，需要先過濾掉良性突變位點，同義突變位點，并且查看測序質(zhì)量過濾掉低頻突變且質(zhì)量不好造成假陽性的位點，其余位點根據(jù)分級證據(jù)進行臨床意義分級，Ⅰ類突變位點具有強臨床意義，Ⅱ類突變位點具有潛在臨床意義，Ⅲ類突變位點臨床意義未明，Ⅳ類突變位點臨床意義良性或可能為良性。

1.3 FISH實驗方法吸取2 mL抗凝血，2 200 r·min-1離心4 min，離心半徑為160 mm，棄上清液，加8 mL氯化鉀進行低滲處理；加8 mL固定液固定(蛋白變性硬化，染色體形態(tài)固定)；加固定液滴片，56 ℃烤30 min～2 h，觀察細胞數(shù)；洗雜質(zhì)，加探針，75 ℃ 5 min，37 ℃ 18 h雜交；洗掉未結(jié)合的探針，加5 μL 125 μg·L-1DAPI復染，最后通過顯微鏡計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以頻數(shù)(n)和百分比(%)表示，采用χ2檢驗比較，如期望理論頻數(shù)小于5則采用Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MDS 22個相關(guān)基因陽性檢出情況選取與MDS相關(guān)的22個基因進行NSG檢測，將檢測到基因突變的結(jié)果稱為陽性結(jié)果。發(fā)現(xiàn)533例MDS標本中陽性結(jié)果共計347例，總陽性率為65.1%。其余未檢測到22種基因突變的結(jié)果稱為陰性結(jié)果。如圖1所示，在347例陽性結(jié)果中突變率最高的是ASXL1基因，陽性率高達38.6%，陽性率較高的DNMT3A、U2AF1、TET2、TP53基因的陽性率分別為20.4%、19.8%、18.1%、15.2%，KRAS基因陽性率最低，為1.7%。

2.2 MDS相關(guān)基因突變譜的分析將347例數(shù)據(jù)中的突變位點制作成基因突變譜，如圖2所示，圖中不同深淺的灰色代表不同的突變類型，其中Multi_Hit代表同1例樣本同1個基因有2種及以上的突變形式。ASXL1基因的移碼突變和無義突變較多，同時發(fā)生多個突變的樣本也相對較多，這些突變常發(fā)生于13號外顯子上。在移碼突變中，G646fs(44.3%)和G645fs(40.8%)數(shù)量較多。在無義突變中，R693(26.6%)數(shù)量較多，點突變的數(shù)量較少。在134例ASXL1基因突變中只有7例(D656N、R625Q、G927R、G99R、R413W和I597N，其中R625Q出現(xiàn)了2例)為錯義突變，這些位點都是臨床意義未明的Ⅲ類位點，暫時無相關(guān)文獻報道其與MDS的相關(guān)性。DNMT3A基因點突變的數(shù)量較多，頻率最高的是R882(38.3%)，其次是R736(14.5%)和R635(7.9%)。U2AF1基因只有點突變：S34(76.2%)和Q157(20.4%)，其中有2例同時發(fā)生這2個點突變。TET2基因突變主要以點突變、無義突變、移碼突變?yōu)橹?，且多個同1樣本包含2個及以上的突變位點，其中包含2個突變位點的有17例，3個突變位點的有5例，4個突變位點的有1例。TP53基因突變以點突變居多，剪切位點突變較少，多個突變位點的樣本中只有2個突變位點同時發(fā)生，其中出現(xiàn)頻率較高的有R273、R248、R175。RUNX1基因突變點突變和移碼突變較多，多個同1個樣本出現(xiàn)多個突變位點，點突變中有一些Ⅱ類位點和Ⅲ類位點。SETBP1基因突變點突變居多，出現(xiàn)頻率最高的是D868(47.2%)，其次是G870(22.8%)。SF3B1基因突變點突變居多，其中K700有19例(52.1%)，K666有9例(24.8%)，K700_K701del有2例(4.9%)。EZH2基因點突變居多，無義突變、移碼突變和剪切位點突變都是Ⅰ類突變，點突變大部分是Ⅲ類突變，有2個點(R690C和V626M)是Ⅱ類位點，有零星文獻報道這2個位點可能有臨床意義。CBL基因點突變居多，有少量無義突變，點突變中C404有3例(11.1%)，R420有6例(22.4%)，Y371有3例(10.6%)。BCOR基因有多種突變類型，有個別突變出現(xiàn)了2次，其余突變都只出現(xiàn)了1次，有1例樣本同時出現(xiàn)了5個突變位點，另外還有6例(22.4%)同時出現(xiàn)了2個突變位點。SRSF2基因的21例陽性樣本中只有2種突變，P95有17例(80.8%)，P95-R102del有4例(19.2%)。ZRSR2和STAG2基因有多種突變類型，ZRSR2基因中較多的是剪切位點突變。IDH2基因有1例R172-H173delinsSA突變，其余R140Q居多，有11例(60.6%)。NF1基因有多種突變形式，無規(guī)律。NRAS基因點突變居多，G12有12例(65.8%)，G13有3例(16.2%)。JAK2基因的V617F突變位點最多。IDH1基因的R132最多，有9例(60.2%)。ETV6和PHF6基因有多種突變類型，PHF6基因中R274Q是1個Ⅱ類位點，出現(xiàn)了2次。KRAS基因只有點突變，包括G12、G13、T58、A59 共4個點。

2.3 MDS相關(guān)基因突變與患者年齡的相關(guān)性分析將347陽性結(jié)果的患者按照年齡分為<60歲組和≥60歲組，其中有5例年齡不詳。如表1結(jié)果所示，將套餐內(nèi)的22個基因按照年齡分組進行統(tǒng)計分析，兩組DNMT3A、U2AF1、TET2、SETBP1、SF3B1、CBL和SRSF2基因陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這說明這些基因突變與患者年齡相關(guān)，其中DNMT3A、TET2、SF3B1、CBL和SRSF2基因突變多見于60歲以上患者中，而U2AF1和SETBP1基因突變常見于60歲以下患者中。兩組其他基因陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 MDS相關(guān)基因突變與患者性別的相關(guān)性分析將347陽性結(jié)果的患者按照性別分組，其中2例性別不詳。如表1結(jié)果所示，將套餐內(nèi)的22個基因按照性別分組進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，不同性別ASXL1、U2AF1、SRSF2、ZRSR2基因陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且男性這4個基因的陽性率高于女性。不同性別其他基因突變陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 不同年齡和性別患者的MDS相關(guān)基因突變陽性率比較[n(%)]

表1(續(xù))

2.5 NGS陽性患者中核型結(jié)果分析347例患者中，發(fā)生TP53基因突變的樣本共51例，如圖3所示，其中有40例患者進行了FISH MDS 4項的檢測(5q-、+8、20q-、7q-)，且20例檢測到了5q-，表明TP53基因突變常會伴有5號染色體缺失的現(xiàn)象。另SETBP1基因突變樣本共38例，其中有31例同時進行了FISH檢測，3例檢測到了7q-，顯示SETBP1基因突變偶爾伴有7號染色體的缺失。

2.6ASXL1基因與其他基因突變相關(guān)性分析347例NGS陽性結(jié)果中ASXL1基因的突變率最高，在對這些陽性結(jié)果進行統(tǒng)計的時候發(fā)現(xiàn)ASXL1基因常常伴隨某些基因同時出現(xiàn)，選取與ASXL1基因同時出現(xiàn)率最高的5種基因，分別為U2AF1、SETBP1、EZH2、RUNX1和TET2基因。如圖4所示，ASXL1基因發(fā)生突變時，U2AF1、SETBP1、EZH2、RUNX1基因陽性率明顯高于ASXL1基因陰性時的陽性率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這說明U2AF1、SETBP1、EZH2、RUNX1基因突變常伴隨ASXL1基因突變，而TET2基因與之無相關(guān)性。

3 討論

選取533例MDS相關(guān)基因(22個)突變檢測結(jié)果，其中347例樣本檢測到這22個基因的陽性結(jié)果，通過分析整個基因突變譜，其中Ⅰ類突變位點為依據(jù)NCCN指南中明確顯示的位點或者突變類型，這些位點有些對預后和用藥有指導作用。Ⅱ類位點在MDS中無特別明確的臨床意義或在其他疾病中有相關(guān)臨床意義的研究。Ⅲ類突變表示無臨床文章報道，臨床意義未明[8]。有些位點突變頻率接近50%或100%，提示良性雜合胚系突變的可能性很高，也有Ⅰ類Ⅱ類位點出現(xiàn)胚系突變，Ⅰ類胚系突變可能和致病相關(guān)[9]。頻率遠離50%或100%的Ⅲ類突變位點也常常出現(xiàn)，但臨床意義未明，可能成為MDS潛在的診斷或預后的靶點，有待后續(xù)的研究證實，給MDS分子診斷提供了新的研究方向。

把NSG結(jié)果同患者年齡、性別結(jié)合起來分析，發(fā)現(xiàn)有些基因突變與性別、年齡具有相關(guān)性，說明不同年齡和性別的人群對某些基因可能存在易感性。FISH分析結(jié)果可以提示預后，例如TP53在5q-MDS中突變率為15%～20%，TP53突變是MDS預后不良的獨立因素[10]，來那度胺為5q-綜合征患者的首選藥物，突變提示對來那度胺治療無效或治療后失效，另TP53突變提示在干細胞移植后總生存期較短。本文分析結(jié)果表明TP53基因突變常伴有5q-，占比達到了50%，符合相關(guān)文章的研究結(jié)果，而SETBP1是造血相關(guān)基因，在MDS中突變率低于5%，多伴7號染色體或者7q-[11]，提示疾病進展。本次分析結(jié)果7號染色體異常與SETBP1基因突變重合率并不高，但是二者結(jié)合分析有利于輔助MDS的診斷和治療，提示疾病進展。

在MDS基因突變譜的分析結(jié)果中，陽性率最高的是ASXL1基因，其大部分突變都是移碼突變，導致C末端截短，影響蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[12]。ASXL1變異常見于MDS中，常與U2AF1及TET2基因變異共存，伴有該變異的患者白血病轉(zhuǎn)化率高[13]。通過分析發(fā)現(xiàn)ASXL1突變與U2AF1、SETBP1、EZH2和RUNX1基因突變有相關(guān)性，說明ASXL1基因突變常伴有這4個基因共突變。ASXL1編碼表觀調(diào)節(jié)因子在MDS中突變率為15%～25%，ASXL1基因突變是MDS預后不良的獨立因素。其他 4個基因中U2AF1基因參與編碼RNA剪接因子，在MDS突變率為8%～12%，與不良預后相關(guān)；EZH2基因在MDS中突變率為5%～10% ，是MDS和MDS/MPN預后不良的獨立因素；RUNX1基因是造血過程中關(guān)鍵基因，其變異會導致多種惡性血液病，在MDS中突變率為10%～15%，也是MDS預后不良的獨立因素，該突變在其他血液腫瘤中亦見報道。這3個基因突變都顯示了不良預后，再伴隨ASXL1基因突變，不良預后發(fā)生風險更高。

NGS技術(shù)在MDS的診斷和預后中發(fā)揮了重要的作用，可以輔助診斷分級和臨床治療方案的制定。目前在指南中，已有數(shù)個基因突變在MDS中有明確的臨床意義，甚至已經(jīng)具體到某1個位點，同1個基因的不同位點突變有不同的意義，例如SF3B1基因的Ⅰ級位點突變可用于MDS疾病的分型，而Ⅲ級位點是臨床意義未明。這說明研究具體位點突變具有重要的臨床意義，NGS技術(shù)以高通量的優(yōu)點被熟知，不僅在臨床檢測中可測出基因突變的所有位點，協(xié)助臨床治療，而且在科研中，NGS技術(shù)為血液病的分子研究提供了技術(shù)支持。隨著測序技術(shù)的不斷成熟，MDS基因突變的臨床意義理解和應用將不斷更新。