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        自制海鹿復(fù)方治療實(shí)驗(yàn)小鼠再生障礙性貧血的藥效學(xué)研究

        2023-03-14 08:59:40王利群文金全劉延河孫武霞張寶娟
        當(dāng)代醫(yī)藥論叢 2023年3期
        關(guān)鍵詞:環(huán)孢素左旋咪唑

        王利群,文金全,劉延河,孫武霞,張寶娟,李 飛,羅 燕

        ﹝咸陽(yáng)彩虹醫(yī)院(咸陽(yáng)市兒童醫(yī)院)1.中醫(yī)兒科 2.小兒血液科,陜西 咸陽(yáng) 712000﹞

        再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)是一組以骨髓有核細(xì)胞增生減低和全血細(xì)胞減少,但無(wú)異常細(xì)胞浸潤(rùn)或骨髓纖維化為特征的骨髓衰竭性疾病[1]。目前AA 的藥物治療仍有一定的局限性,非骨髓移植治療主要是使用免疫抑制劑[2],但難以達(dá)到血液學(xué)的持續(xù)緩解及治愈目標(biāo),且不良反應(yīng)多,而將西藥與中藥聯(lián)合應(yīng)用可取得很好的療效[3-4]。海鹿復(fù)方是筆者根據(jù)AA 的發(fā)病機(jī)制及中醫(yī)組方規(guī)律研制而成的,臨床用于治療兒童AA 二十余年,取得了滿意療效。本研究以BALB/c 小鼠建立AA 動(dòng)物模型,探討應(yīng)用海鹿復(fù)方等藥物治療小鼠AA 模型對(duì)其體重、白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板、網(wǎng)織紅細(xì)胞、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、γ- 干擾素(IFN-γ)、輔助性T 細(xì)胞1(Th1)、輔助性T 細(xì)胞2(Th2)的影響,為本制劑的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 動(dòng)物及分組

        BALB/c 小鼠80 只,8 ~12 周齡,體重18 ~22 g,清潔級(jí),雌雄各半,實(shí)驗(yàn)在西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。采用隨機(jī)分組法分為8 組:1)空白對(duì)照組;2)模型組;3)單純海鹿復(fù)方小劑量組;4)單純海鹿復(fù)方大劑量組;5)黃芪當(dāng)歸組;6)司坦唑醇+ 左旋咪唑(早期治療AA 的方案)組;7)海鹿復(fù)方+司坦唑醇+左旋咪唑(早期中西醫(yī)結(jié)合治療方案)組;8)陽(yáng)性組:環(huán)孢素A+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑(目前治療AA 的常用方案)組。每組10 只活小鼠。

        1.2 藥物

        1)苯:分析純,由天津市富宇精細(xì)化工有限公司生產(chǎn),批號(hào):20160305。2)檢測(cè)IL-4、IFN-γ、Th1、Th2試劑,商用試劑盒。3)海鹿復(fù)方:鹿茸、海馬、西洋參等粉碎,過(guò)80 目篩;黃芪、當(dāng)歸等煎藥后分袋包裝50 mL,按含生藥2 g/mL 放置于冰箱備用。以上中藥由陜西省醫(yī)藥公司提供。4)主要儀器:血細(xì)胞分析儀:SYsmex-500i,由希森美康醫(yī)用電子有限公司生產(chǎn)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        將小鼠按性別及體重隨機(jī)分為8 組(每組10 只)分籠群養(yǎng),適應(yīng)飼養(yǎng)1 周后開(kāi)始建模。按刑海燕等[5]成功建模的方法,將苯劑以2 mL/kg 劑量注射于BALB/c小鼠尾根皮下,每周4 次,共20 次。建模成功后開(kāi)始治療給藥,空白對(duì)照組灌胃生理鹽水0.4 mL/10 g,其余各組藥物亦按此容積灌胃給藥,分別按人和動(dòng)物的等效劑量(人用量的12 倍)分組給藥治療(海鹿復(fù)方小劑量組給藥劑量0.4 g/kg,海鹿復(fù)方大劑量組給藥劑量4 g/kg)。治療周期為10 d。于最后一次給藥2 h后處理動(dòng)物。眼球取血等量注入2 管中分別行血常規(guī)檢查、網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測(cè)及IL-4、IFN-γ、Th1、Th2檢測(cè)。IL-4、IFN-γ、Th1及Th2細(xì)胞因子的檢測(cè)方法:采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測(cè),嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作流程加血清及試劑反應(yīng),以酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果。

        1.4 觀察指標(biāo)

        觀察建模后AA BALB/c 小鼠的存活情況。觀察海鹿復(fù)方對(duì)AA BALB/c 小鼠體重的影響。觀察海鹿復(fù)方對(duì)AA BALB/c 小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響,血液學(xué)指標(biāo)包括白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板和網(wǎng)織紅細(xì)胞。觀察海鹿復(fù)方對(duì)AA BALB/c 小鼠IL-4、IFN-γ、Th1、Th2的影響。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS 20.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量資料以±s表示,行t檢驗(yàn),P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 海鹿復(fù)方對(duì)AABALB/c 小鼠體重的影響

        模型建成后開(kāi)始給藥,連續(xù)給藥10 d,動(dòng)物表現(xiàn)為活動(dòng)基本正常,體重增加,毛色恢復(fù)光亮,大、小便正常,無(wú)死亡現(xiàn)象。由表1 可見(jiàn),模型組體重明顯低于空白對(duì)照組,P<0.01;各治療組(除環(huán)孢素A+司坦唑醇+左旋咪唑組)體重均高于模型組,P<0.01。前者證明建立小鼠AA 模型成功,后者提示治療后改善了小鼠的體重。

        表1 海鹿復(fù)方對(duì)AA BALB/c 小鼠體重的影響(g,± s)

        表1 海鹿復(fù)方對(duì)AA BALB/c 小鼠體重的影響(g,± s)

        注:與模型組比較,★P <0.05,★★P <0.01;與空白對(duì)照組比較,※P<0.05,※※P <0.01;當(dāng)時(shí)為節(jié)省費(fèi)用,未做海鹿復(fù)方大劑量組與體重間關(guān)系的研究。

        組別 動(dòng)物數(shù)(N)體重空白對(duì)照組 10 26.20±2.82★★模型組 10 16.00±1.79※※海鹿復(fù)方小劑量組 10 20.60±4.86★★※※黃芪當(dāng)歸組 10 20.10±3.22★★※※司坦唑醇+左旋咪唑組 10 20.40±4.45★★※海鹿復(fù)方+司坦唑醇+左旋咪唑組 10 19.10±2.71★※※環(huán)孢素A+司坦唑醇+左旋咪唑組 10 18.20±2.33※※

        2.2 海鹿復(fù)方對(duì)AABALB/c 小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

        模型組小鼠三系減少,網(wǎng)織紅細(xì)胞減少,與對(duì)照組相比,P<0.01,證明建模成功。各治療組血液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)與模型組比較均顯著增加,P<0.01,其中尤以海鹿復(fù)方+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑組、海鹿復(fù)方大劑量組白細(xì)胞升高最為顯著,而黃芪當(dāng)歸組、環(huán)孢素A+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑組白細(xì)胞升高相對(duì)較差,但與其他治療組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),提示應(yīng)用海鹿復(fù)方治療AA 的效果優(yōu)于目前通用的環(huán)孢素A+ 司坦唑醇治療方法。各治療組血液中血小板計(jì)數(shù)與模型組相較均顯著增加,P<0.01,其中尤以司坦唑醇+ 左旋咪唑組、海鹿復(fù)方大劑量組及海鹿復(fù)方+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑組血小板升高最為顯著,而黃芪當(dāng)歸組、環(huán)孢素A+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑組血小板升高相對(duì)較差。各治療組血液中網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)與模型組相較均顯著增加,P<0.01(僅黃芪當(dāng)歸組P<0.05),其中尤以環(huán)孢素A+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑組、司坦唑醇+ 左旋咪唑組、海鹿復(fù)方大、小劑量組為著。提示海鹿復(fù)方具有良好的促進(jìn)AA 小鼠造血的作用。各組間紅細(xì)胞計(jì)數(shù)變化不大,主要是由于紅細(xì)胞生存時(shí)間長(zhǎng),短期內(nèi)未顯現(xiàn)所致。詳見(jiàn)表2。

        表2 海鹿復(fù)方對(duì)AA BALB/c 小鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板及網(wǎng)織紅細(xì)胞的影響(± s)

        表2 海鹿復(fù)方對(duì)AA BALB/c 小鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板及網(wǎng)織紅細(xì)胞的影響(± s)

        注:與模型組比較,★P<0.05,★★P <0.01 ;與對(duì)照組比較,※P <0.05,※※P <0.01。

        網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109/L)空白對(duì)照組 10 7.53±0.64★★ 13.04±0.54 699.90±141.08★★ 0.0145±0.0071★★模型組 10 2.54±0.65 ※※ 8.24±1.34※※ 312.70±117.05※※ 0.0046±0.0021※※海鹿復(fù)方小劑量組 10 7.62±2.12★★ 10.46±0.84 592.10±196.83★★ 0.0133±0.0068★★海鹿復(fù)方大劑量組 10 8.24±1.62★★ 11.45±0.24 613.20±112.52★★ 0.0156±0.0054★★黃芪當(dāng)歸組 10 6.53±2.01★★ 11.20±0.55 452.30±141.36★★ 0.0120±0.00582★司坦唑醇+左旋咪唑組 10 8.20±1.94★★ 10.06±0.42 770.60±111.60★★ 0.0219±0.0092★★海鹿復(fù)方+司坦唑醇+左旋咪唑組 10 9.03±2.63★★※ 12.40±0.60 603.90±109.23★★ 0.0088±0.0016★★環(huán)孢素A+司坦唑醇+左旋咪唑組 10 6.92±1.39★★ 11.98±1.20 579.50±141.15★★ 0.0279±0.0113★★※※組別 動(dòng)物數(shù)(N)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109/L)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(×1012/L)血小板計(jì)數(shù)(×109/L)

        2.3 海鹿復(fù)方對(duì)AABALB/c 小鼠IL-4、IFN-γ、Th1、Th2 的影響

        IL-4、INF-γ、Th1、Th2檢 測(cè) 結(jié)果:模 型 組INF-γ、Th1均高于空白對(duì)照組,IL-4、Th2均低于空白對(duì)照組,P<0.05。提示模型建立成功。各治療組INF-γ、Th1均低于模型組,IL-4、Th2均高于模型組,P<0.05,其中尤以司坦唑醇+ 左旋咪唑組、黃芪當(dāng)歸組、海鹿復(fù)方大、小劑量組IL-4 升高、INF-γ 降低最為顯著。詳見(jiàn)表3。

        表3 海鹿復(fù)方對(duì)AA BALB/c 小鼠IL-4、IFN-γ、Th1、Th2 的影響(± s)

        表3 海鹿復(fù)方對(duì)AA BALB/c 小鼠IL-4、IFN-γ、Th1、Th2 的影響(± s)

        注:與模型組比較,★P <0.05,★★P <0.01 ;與對(duì)照組比較,※P <0.05,※※P <0.01。

        組別 動(dòng)物數(shù)(N)IL-4(pg/mL) IFN-γ(pg/mL) Th1(ng/L) Th2(ng/L)空白對(duì)照組 10 131.68±4.57 610.99±19.88 69.63±3.55★★ 58.93±1.47★★模型組 10 55.42±5.00※※ 653.31±26.43※ 81.56±3.34※※ 30.94±2.81※※海鹿復(fù)方小劑量組 10 105.54±10.87★★※※ 471.47±52.22★★※※ 64.67±7.04★★ 36.22±5.05★★海鹿復(fù)方大劑量組 10 114.51±11.35★※※ 466.23±35.62★★※※ 55.52±8.12★★※※ 40.15±4.28★★黃芪當(dāng)歸組 10 118.62±8.62★★※※ 456.32±50.36★★※※ 61.45±8.12★★ 42.16±4.21★※司坦唑醇+左旋咪唑組 10 138.63±10.14※※ 435.98±45.15★★※※ 43.39±5.98※※ 45.61±1.31★※※海鹿復(fù)方+司坦唑醇+左旋咪唑組 10 91.36±8.97★★※※ 573.68±13.95★※ 58.53±2.12★★ 43.86±2.59★★※※環(huán)孢素A+司坦唑醇+左旋咪唑組 10 86.66±7.85★★※ 550.82±23.80★※ 61.26±3.24★★ 45.39±1.49★★※※

        3 討論

        AA 的主要發(fā)病機(jī)制目前多認(rèn)為與免疫異常、造血干細(xì)胞及造血微環(huán)境受損有關(guān)。本病屬于中醫(yī)學(xué)中“血證”“虛勞”等范疇,主要由于六淫、七情、飲食不節(jié)、邪毒等傷及氣血臟腑,氣虛血虛,陰陽(yáng)失調(diào),尤其影響到脾、腎及骨髓功能,漸至元?dú)馓潛p,精血虛少,氣血生化不足所致。其病機(jī)以“腎虛”為本,以“血虛”為標(biāo)。我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在治療AA 方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)認(rèn)為,鹿茸、海馬為補(bǔ)腎中藥,用于治療AA 主要是基于腎主骨、骨生髓的中醫(yī)理論基礎(chǔ)?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,鹿茸、海馬中均含有蛋白多肽類成分、氨基酸、無(wú)機(jī)元素、糖類、生物胺類、甾體類及脂類等成分[6-7],具有性激素樣作用及免疫促進(jìn)作用[7-8];海馬對(duì)羥基脲所造成的腎陽(yáng)虛小鼠有明顯的治療作用[9],可增加雌二醇致腎陽(yáng)虛小鼠紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白濃度及血小板數(shù)量[10]。有報(bào)道指出,活性鹿茸可抵抗昆明小鼠環(huán)磷酰胺所致骨髓抑制及體重減輕[11],鮮活鹿茸治療腫瘤化療后骨髓抑制有效[12]。這符合AA 的免疫發(fā)病機(jī)制及臨床用雄性激素治療AA 有效的依據(jù)。

        免疫機(jī)制是AA 發(fā)病研究的熱點(diǎn),免疫抑制劑環(huán)孢霉素A 及抗淋巴細(xì)胞球蛋白對(duì)AA 治療有效是有力的證據(jù),臨床治療重型AA 的有效率達(dá)75% ~80%[13]。揭示免疫功能及免疫細(xì)胞的活化,產(chǎn)生大量的造血負(fù)調(diào)控因子IFN-γ 及腫瘤壞死因子-α,尤其是IFN-γ 增高對(duì)造血的影響更大[14],而造血的正調(diào)控因子IL-4 減少,前者由Th1細(xì)胞分泌,后者由Th2細(xì)胞分泌。本組實(shí)驗(yàn)顯示,各治療方法均可降低AA 小鼠血液中INF-γ、Th1的含量,增加IL-4、Th2的含量,這與再障飲對(duì)AA 模型小鼠造血細(xì)胞的影響[15]結(jié)果一致。本組尤以司坦唑醇+ 左旋咪唑組、黃芪當(dāng)歸組、海鹿復(fù)方大、小劑量組促使IL-4 升高、對(duì)INF-γ 降低作用較強(qiáng),且作用程度超過(guò)陽(yáng)性組環(huán)孢素A+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑組。這提示海鹿復(fù)方及黃芪、當(dāng)歸不僅具有增強(qiáng)免疫功能[7-8]的作用,還具有免疫調(diào)節(jié)作用,提示海鹿復(fù)方及黃芪、當(dāng)歸等是治療AA 適當(dāng)、合理的組方。

        本實(shí)驗(yàn)顯示,海鹿復(fù)方能增加AA 小鼠的體重,改善其生存質(zhì)量;海鹿復(fù)方能增加AA 小鼠白細(xì)胞、血小板、網(wǎng)織紅細(xì)胞的數(shù)量;海鹿復(fù)方能增加AA 小鼠外周血中Th2及IL-4 的含量,降低外周血中Th1及IFN-γ 的含量。海鹿復(fù)方可作為AA 的一種新的治療藥物。

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