葉靜文，趙欣欣，王寶金，劉立燕，逯彥越，鄔智偉

(1.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院 婦科，河南 鄭州 450000；2.河南省卵巢癌惡性腫瘤國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的腫瘤之一[1]。2018年全球有57萬例宮頸癌新確診病例，其中有31萬例病死[2]。早期篩查和疫苗接種能提高宮頸癌的診斷率和治療率[3-4]。但基于宮頸癌惡性侵入性特性，晚期宮頸癌患者5 a生存率低于30%[5]。Micro(mi) RNA是1個(gè)高度保守的非編碼RNA家族，參與癌癥的發(fā)生進(jìn)展[6]。miRNAs在癌組織中的異常表達(dá)和在體液中顯著的穩(wěn)定性使其成為有價(jià)值的腫瘤診斷、治療和預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物[7-8]。例如，miR-G-10可以通過與GRSF1蛋白結(jié)合激活A(yù)KT/NF-κB信號(hào)通路，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[9]。miR-96表達(dá)上調(diào)與宮頸癌的臨床特征密切相關(guān)[10]。然而，未有關(guān)于miR-3193在癌癥中的研究報(bào)道，miR-3193與宮頸癌的相關(guān)性尚不清楚。以往的研究主要集中在miRNA表達(dá)水平對(duì)生物學(xué)功能的影響，很少有研究者探索miRNA的分子修飾現(xiàn)象。有研究表明，大多數(shù)RNA分子，在正常生命過程中受到化學(xué)分子修飾[11]。最近有研究表明，甲基化修飾存在于成熟的miRNA中，甲基化修飾miRNA可能是早期癌癥的診斷標(biāo)志[12]。

本研究基于The Cancer Genome Atlas (TCGA)的數(shù)百份樣本，用生物信息學(xué)分析揭示了miR-3193表達(dá)、臨床特征、DNA甲基化與患者預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 TCGATCGA作為生物信息學(xué)挖掘平臺(tái)(https://portal.gdc.cancer.gov/)，包含了常見腫瘤的基因表達(dá)數(shù)據(jù)、DNA甲基化和突變數(shù)據(jù)等多種類型的數(shù)據(jù)[13]。從TCGA中下載宮頸癌患者的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。最終納入191例宮頸癌患者進(jìn)行生物信息學(xué)分析?；颊叩脑敿?xì)臨床信息，如年齡、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期和甲基化狀態(tài)見表1。

表1 宮頸癌患者詳細(xì)臨床信息

1.2 GO and KEGG富集分析DAVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)為在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)整合分析工具，可以方便地為用戶提供基因或蛋白的數(shù)百個(gè)最具顯著富集生物功能注釋信息[14]。此外，Kobas database 6 (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)為常用的網(wǎng)絡(luò)工具，用于注釋細(xì)胞信號(hào)通路[15]。上傳差異表達(dá)基因，用于在DAVID中進(jìn)行GO功能分析，在Kobas中進(jìn)行KEGG通路富集分析(P<0.05)。

1.3 CMap分析The connectivity map database (CMap)(https://portals.broadinstitute.org/cmap/)是生物信息學(xué)領(lǐng)域已知的一個(gè)基于化學(xué)試劑處理后的基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)庫[16]。將差異表達(dá)基因上傳CMap數(shù)據(jù)庫尋找可能用于治療宮頸癌的藥物(P<0.001， enrichment <-0.9)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用R軟件(3.6.1版)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。通過單向ANOV A或t檢驗(yàn)來闡明miR-3193表達(dá)與其他臨床病理因素的相關(guān)性。通過繪制Kaplan-Meier生存曲線和受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線，預(yù)測(cè)miR-3193的預(yù)后價(jià)值。曲線下面積(area under curve，AUC)值為0.5～1.0，AUC越接近于1，說明診斷效果越好。通過Cox回歸分析miR-3193的上調(diào)與宮頸癌預(yù)后的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-3193表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系利用宮頸癌TCGA-RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，探索miR-3193在不同臨床階段的表達(dá)水平。miR-3193在Ⅳ期表達(dá)高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期miR-3193水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.690、0.560、0.350)(圖1A)。病理-T(原發(fā)腫瘤大小和局部浸潤程度)級(jí)別較高時(shí)miR-3193表達(dá)增加，但T1與T2之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.660)(圖1B)。miR-3193表達(dá)隨組織學(xué)、病理-N(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)和病理- M(遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)分級(jí)增高而增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.160)(圖1C～1E)。

A為臨床分期；B為病理-T分級(jí)；C為病理-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；D為病理-遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；E為組織學(xué)分級(jí)。

2.2 miR-3193對(duì)宮頸癌患者生存結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值根據(jù)miR-3193的表達(dá)情況，將TCGA宮頸癌患者分為低miR-3193表達(dá)組和高miR-3193表達(dá)組。繪制Kaplan-Meier生存曲線，結(jié)果顯示高miR-3193表達(dá)組患者的總生存時(shí)間更短(圖2A)。Cox回歸法繪制ROC曲線，驗(yàn)證其對(duì)宮頸癌預(yù)后的價(jià)值(圖2B)，3、5 a曲線下面積分別為0.675、0.764，說明miR-3193上調(diào)對(duì)不良預(yù)后具有較高的診斷價(jià)值。

2.3 miR-3193在宮頸癌中的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值單因素Cox回歸分析，miR-3193高表達(dá)、臨床晚期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是宮頸癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。見圖2C。為了排除混雜因素，進(jìn)一步多因素Cox回歸分析表明，miR-3193高表達(dá)是宮頸癌的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素。見圖2D。

2.4 miR-3193與甲基化修飾的關(guān)系利用TCGA甲基化數(shù)據(jù)分析了miR-3193甲基化在宮頸癌病理和預(yù)后中的生物學(xué)價(jià)值。miR-3193有2個(gè)(cg00494337和cg09923107)甲基化位點(diǎn)。見圖3A。 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-3193的表達(dá)與其2個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化呈負(fù)相關(guān)(圖3B、3D和3E)。miR-3193的甲基化水平與宮頸癌臨床分級(jí)和腫瘤大小密切相關(guān)(圖4A和4B)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)(圖4D和4C)。在miR-3193的甲基化與組織學(xué)分級(jí)之間的相關(guān)性中，miR-3193的甲基化在組織學(xué)分級(jí)中呈上升趨勢(shì)，但這種上升差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024)(圖4E)。采用Kaplan -Meier方法評(píng)價(jià)2種甲基化對(duì)預(yù)后的影響,發(fā)現(xiàn)高甲基化水平的cg00494337與預(yù)后相關(guān)(P=0.015)(圖3C)，cg09923107甲基化水平與預(yù)后無相關(guān)性(P=0.515)(圖3F)。

A為臨床分期；B為病理-T分級(jí)；C為病理-遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；D為病理-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；E為組織學(xué)分級(jí)。

2.5 GO富集分析及KEGG通路富集分析結(jié)合GO和KEGG分析，取得差異表達(dá)基因相關(guān)的生物過程和細(xì)胞信號(hào)通路的全面視圖。GO術(shù)語包括 3類：生物過程、細(xì)胞成分和分子功能(見表2)。KEGG分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因在多種細(xì)胞信號(hào)通路中顯著富集(見表3)。

表2 差異基因的GO分析

表3 差異基因的KEGG分析

2.6 CMap數(shù)據(jù)庫篩選宮頸癌候選治療藥物通過CMap數(shù)據(jù)庫篩選出關(guān)聯(lián)度最大的4種小分子化合物：阿霉素、喜樹堿、GW-8510和阿扎胞苷。在PubChem平臺(tái)上搜索了化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息。見圖5。

A為阿霉素；B為喜樹堿；C為GW-8510；D為阿扎胞苷。

3 討論

miRNAs具有穩(wěn)定性、組織特異性且易獲取，可作為腫瘤的早期診斷標(biāo)志物[17]。本研究首次對(duì)miR-3193的表達(dá)進(jìn)行了全面系統(tǒng)的分析，試圖探討其在宮頸癌病理過程中的潛在作用。首先評(píng)估m(xù)iR-3193在宮頸癌中的表達(dá)及預(yù)后意義。結(jié)果顯示miR-3193表達(dá)及預(yù)后與宮頸癌臨床分級(jí)及腫瘤大小密切相關(guān)，miR-3193是預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，推測(cè)miR-3193可能作為癌基因促進(jìn)腫瘤生長，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。雖然無直接證據(jù)支持miR-3193可以促進(jìn)腫瘤生長，但許多宮頸癌相關(guān)的miRNAs與細(xì)胞增殖侵襲密切相關(guān)，如miR-93[18]、miR-4262[19]、miR-181a[20]和miR-494[21]。

有研究表明miRNA的甲基化修飾可以作為早期癌癥的診斷標(biāo)志物。Konno等[12]在早期胰腺癌患者的血清中檢測(cè)到甲基化的miR-17-5p，而在健康者的血清中，甲基化的miR-17-5p不存在或僅低水平存在。這啟發(fā)探究miR-3193在宮頸癌中的甲基化意義。Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，miR-3193的表達(dá)水平可能受到甲基化修飾的負(fù)調(diào)控。miR-3193低甲基化與晚期惡性特征密切相關(guān)，表明miR-3193表達(dá)與miR-3193甲基化之間的負(fù)相關(guān)。宮頸癌患者的預(yù)后與甲基化位點(diǎn)cg00494337相關(guān)。這提示miR-3193的甲基化修飾可能是宮頸癌的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物。

GO富集分析顯示，侵襲能力增強(qiáng)[22-24]、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[25]、遷移[26]和細(xì)胞周期紊亂[27]都是影響腫瘤細(xì)胞惡性增殖的重要因素。KEGG通路分析顯示，Notch信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、癌癥中的MicroRNAs和PI3K-AKT信號(hào)通路和HPV感染等與宮頸癌密切相關(guān)。Notch信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖[28]。MiR-200a通過調(diào)控HIFα/VEGF通路增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞增殖能力[29]。盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與TGF-β信號(hào)通路在宮頸癌中的調(diào)控密切相關(guān)[30]。PI3K-AKT通路的激活增加了癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性[31]。持續(xù)感染高危HPV感染是宮頸癌發(fā)生的最重要的原因[32]。前面探討了miR-3193的表達(dá)及預(yù)后與宮頸癌臨床密切相關(guān)，對(duì)于接下來進(jìn)一步研究miR-3193調(diào)控宮頸癌的相關(guān)機(jī)制，GO和KEGG分析結(jié)果給予研究者相關(guān)啟發(fā)。

為了改善宮頸癌患者的生存和預(yù)后，通過CMap分析篩選了4種小分子藥物(阿霉素、喜樹堿、GW-8510和阿扎胞苷)，認(rèn)為其可能抑制宮頸癌的發(fā)展。阿霉素是一種廣譜抗腫瘤藥物，已被廣泛用于治療惡性腫瘤，如白血病、惡性淋巴瘤和乳腺癌[33]，在裸鼠乳腺癌模型中注射阿霉素，小鼠腫瘤生長明顯受到抑制[34]。有研究發(fā)現(xiàn)通過培養(yǎng)內(nèi)生真菌提取出的喜樹堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞(HeLa)抑制能力呈濃度依賴性[35]。雖然無直接證據(jù)表明GW-8510和阿扎胞苷對(duì)宮頸癌的治療效果，但它們?cè)谄渌┌Y中被廣泛提及[36]。CMap分析結(jié)果為宮頸癌的治療提供了新的選擇。

綜上所述，本研究探討了miR-3193在宮頸癌中的致癌作用及其機(jī)制。miR-3193的上調(diào)和低甲基化均提示宮頸癌患者預(yù)后不良。miR-3193可能參與多種信號(hào)通路，可能成為宮頸癌診斷和個(gè)體化治療的有價(jià)值的靶點(diǎn)。