宋靜靜, 羅美苗, 李 露, 楊子聰, 王琳, 諸葛才智, 邱清華, 朱開昕, 蘇本偉, 龔 斌*

( 1. 廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室， 北部灣大學 海洋學院， 廣西 欽州535011； 2. 北部灣大學 陶瓷與設(shè)計學院， 廣西 欽州535011； 3. 欽州市中醫(yī)醫(yī)院， 廣西 欽州535099 )

夾竹桃(Neriumoleande)是夾竹桃科(Apocynaceae)夾竹桃屬(Nerium)中的一種傳統(tǒng)藥用植物，含有非常豐富的活性化合物，在世界各地(特別是印度和中國)被廣泛應(yīng)用。在傳統(tǒng)中醫(yī)中，被用于治療心臟疾病、糖尿病、哮喘、癌癥和癲癇等疾病( Elliott, 2002)。近代藥理活性研究表明，夾竹桃含有抗細菌(Hussain & Gorsi, 2004)、抗真菌(Hadizadeh et al., 2009)、抗病毒(Singh et al., 2013)、抗氧化(Dey et al., 2012)、抗瘧疾(Sharma et al., 2005)等多種活性成分。

內(nèi)生真菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，廣泛存在于植物的健康組織中。內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物在藥理學和農(nóng)業(yè)中應(yīng)用廣泛(Alurappa et al., 2014)。從在紫杉的內(nèi)生真菌Taxomycesandreanae中發(fā)現(xiàn)了抗癌化合物紫杉醇(Stierle et al., 1995)開始，目前已從植物內(nèi)生真菌分離出多個抗病毒、抗腫瘤、抗微生物活性化合物，僅就抗微生物活性而言，就已發(fā)現(xiàn)了Altersolanol A、Enfumafungin、Colletotric acid、Jesterone、Hydroxy-jesterone、Guignardic acid、Pestacin、Isopestacin等幾十種活性化合物(Gupta et al., 2020)，并發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌可能在藥用植物活性物質(zhì)的合成中有重要作用。國內(nèi)外研究表明，目前有少量從夾竹桃中得到內(nèi)生菌及其活性物質(zhì)的報道(Vallabhbhai, 2008; Ramesha et al., 2013; Ren et al., 2016; Ma et al., 2017; 鄭浩等, 2020; 朱美林等, 2020)，但是，其對真菌的鑒定主要基于形態(tài)學特征。植物內(nèi)生真菌很多不產(chǎn)孢，僅依靠形態(tài)學數(shù)據(jù)不能準確反應(yīng)夾竹桃內(nèi)生真菌種類，而采用分子系統(tǒng)的方法對夾竹桃內(nèi)生真菌多樣性進行研究還未有報道。此外，目前研究發(fā)現(xiàn)的夾竹桃內(nèi)生真菌及其活性物質(zhì)的類型主要包括抗腫瘤、抗氧化、殺蟲、抗植物病原真菌、抗人體的病原菌等，而在抗水產(chǎn)病菌方面鮮有報道。

廣西地處亞熱帶地區(qū)，良好的環(huán)境孕育了很多藥用價值高的道地藥材，該區(qū)域藥用植物內(nèi)生菌多樣性的研究可以為將來系統(tǒng)評估和確定藥材藥效的地域差異提供參考。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的使用受到了嚴格限制，導致新的水產(chǎn)病原菌及抗生素多耐藥菌不斷出現(xiàn)。夾竹桃內(nèi)生真菌作為發(fā)掘天然活性化合物的重要資源，有希望從中獲得抑制水產(chǎn)病原菌的新型抗菌活性菌株和化合物。本研究擬對廣西欽州市夾竹桃中的內(nèi)生真菌進行分離鑒定和抗菌活性篩選，以確定夾竹桃內(nèi)生真菌多樣性究竟如何，有哪些內(nèi)生真菌類型及其在不同組織的分布情況，以期能夠獲得一些具有抗水產(chǎn)病原弧菌活性的菌株，為進一步開發(fā)新型的抗菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和預(yù)處理

夾竹桃樣品采集于廣西欽州市欽北區(qū)，經(jīng)欽州市中醫(yī)院中藥研究所朱開昕高級工程師鑒定為夾竹桃屬夾竹桃(Neriumoleander)。選取健康夾竹桃的新鮮莖段和葉組織塊，用自來水沖洗表面的泥土和灰塵，在無菌操作臺中進行表面消毒：先將樣品浸泡在75%酒精中3～5 min，再轉(zhuǎn)入3%～5%的次氯酸鈉溶液中浸泡30 s，然后再用無菌水沖洗干凈。在超凈操作臺中放到干燥滅菌的培養(yǎng)皿中晾干，備用。

1.2 內(nèi)生真菌分離和純化

將上述處理過的莖段和葉片組織用無菌剪刀剪成5 mm×5 mm小塊后，貼于PDA 培養(yǎng)基平板上；置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2～4 d，并定期觀察真菌的生長情況；得到生長狀況良好的菌株；待組織邊緣發(fā)現(xiàn)有菌絲長出時，在無菌環(huán)境下挑取菌絲尖端轉(zhuǎn)接到純化培養(yǎng)基平板上；經(jīng)多次分離純化后再接種于 PDA 斜面作為保種，保存在4～8 ℃冰箱備用。

1.3 形態(tài)學鑒定

將分離菌株接種于PDA培養(yǎng)基平板中，放置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在各菌株生長的最佳時期，對照《真菌鑒定手冊》(魏景超, 1979)，觀察菌落形態(tài)(菌落顏色、大小、性狀及邊緣等)、生長情況、菌絲體、孢子的形態(tài)特征和表面特征，拍照記錄。

1.4 DNA提取

菌絲體用液氮研磨至勻漿狀，再加入600 μL的CTAB提取液，65 ℃水浴45 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液；加入苯酚∶氯仿∶異戊醇混合液(25∶24∶1)，混勻后4 ℃條件下，10 000 r·min-1離心5 min；取上清液，加入-20 ℃預(yù)冷的異戊醇靜置數(shù)分鐘；室溫12 000 r·min-1離心5 min，去上清液；取沉淀，用75%乙醇洗沉淀，加50 μL無菌水，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ITS rDNA 序列分析

提取內(nèi)生真菌的DNA后，用真菌鑒定通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 擴增真菌ITS rDNA序列。PCR反應(yīng)體系：ddH2O 20 μL，2×Taq PCR MasterMix 25 μL (北京索萊寶生物科技有限公司)，10 μmol·L-1的引物各2 μL，10 ng·μL-1模板1 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。引物合成和測序都由北京六合華大基因科技有限公司完成。將獲得的序列用BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性檢索，比對得出與其相似性最高的核酸序列。通過MEGA7.0軟件使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的提取和抑菌活性的測定

接種分離真菌于100 mL液體PDA培養(yǎng)基，于26～28 ℃在200 r·min-1轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)10～20 d至菌絲體長滿三角瓶；8 000 r·min-1離心收集菌絲體，20 ℃下吹干水分；稱取0.3 g干燥后的菌體加入5 mL提取液(乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸=80∶15∶5)浸泡，然后將提取液靜置揮發(fā)，加入500 μL乙酸乙酯溶解提取物。抑菌活性指示菌蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus) 、魔鬼弧菌(Vibriodiabolicus)由本實驗室購買保藏；溶藻弧菌(V.alginolyticus)、坎氏弧菌(V.campbellii)分離自患病的魚蝦。分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，30～35 ℃搖床上以200 r·min-1的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)過夜。將上述菌液200 μL采用混菌法接種于培養(yǎng)皿中，采用濾紙片法測定抑菌活性，觀察抑菌圈的有無及大小，測量并記錄抑菌圈直徑(Gong et al., 2018)。該實驗使用濾紙片蘸取乙酸乙酯作為空白對照，陽性對照為濾紙片蘸取50 μg·mL-1的卡那霉素和氯霉素。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的形態(tài)學鑒定

如圖1所示，根據(jù)菌株的菌落、菌絲體和孢子的形態(tài)特征，對照《真菌簽定手冊》進行初步鑒定，分屬于7個屬。其中，葉部組織獲得12株菌，占63.16%，分屬于炭疽菌屬(Colletotrichumspp.)、球座菌屬(Guignardiaspp.)、葉點霉屬(Phyllostictaspp.)、 新殼梭孢屬 (Neofusicoccumsp.) 和曲霉屬(Aspergillusspp.)；莖部分離到7株菌，分別屬于炭疽菌屬、隔孢殼科新屬(Nothophomasp.)和間座殼屬(Diaporthesp.)，占分離總量的36.84%(表1)，表明夾竹桃的內(nèi)生真菌在莖段、葉片組織中分布廣泛。

A. 菌株ye-130; B. 菌株ye-134; C. 菌株ye-135; D. 菌株ye-136; E. 菌株jing-116; F. 菌株jing-117; G. 菌株jing-119; H. 菌株jing-180。A. Strain ye-130; B. Strain ye-134; C. Strain ye-135; D. Strain ye-136; E. Strain jing-116; F. Strain jing-117; G. Strain jing-119; H. Strain jing-180.圖 1 夾竹桃部分內(nèi)生真菌的典型菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of some endophytic fungi isolated from Nerium oleander

表 1 夾竹桃不同組織中內(nèi)生真菌屬的組成Table 1 Composition of endophytic fungi in different tissues of Nerium oleander

2.2 夾竹桃內(nèi)生真菌的分子生物學鑒定

通過對得到的19株內(nèi)生真菌的DNA 進行PCR擴增和ITS測序，并進行BLAST分析，結(jié)果表明這19株內(nèi)生真菌都屬于子囊菌門，涵蓋5個目7個屬，且ITS序列和GenBank相似性都在98%以上(表2)?；贗TS 序列用MEGA 7軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹(圖2)顯示有6個分支，其中ye-127、ye-129、ye-130、ye-131、ye-132、ye-133和ye-134都屬于葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales)，與Guignardiaalliacea、G.musicola、Phyllostictafallopiae構(gòu)成一個分支；jing-114、jing-115、jing-116、jing-118、jing-179、ye-126、ye-128都屬于小叢殼目(Glomerellales)，與Colletotrichumfructicola和C.citri-maximae構(gòu)成一個分支；jing-117與Neofusicoccumparvum構(gòu)成一個分支；jing-180屬于間座殼目(Diaporthales)，和Diaporthesp.構(gòu)成一個分支，其親緣關(guān)系比較近。ye-135、ye136和jing-119共同構(gòu)成一個大的分支，其中jing-119與Nothophomaanigozanthi親緣關(guān)系較近。ye-135、ye136都屬于Aspergillus，其中ye-135與Aspergillusneoellipticus親緣關(guān)系較近，而ye136與A.tamarii親緣關(guān)系較近。

表 2 夾竹桃內(nèi)生菌ITS序列BLAST分析Table 2 BLAST analysis of ITS sequence of Nerium oleander

圖 2 NJ法構(gòu)建的夾竹桃內(nèi)生真菌ITS序列系統(tǒng)進化樹圖Fig. 2 Phylogenetic tree of ITS rDNA sequences of endophytic fungi of Nerium oleander by NJ method

2.3 內(nèi)生真菌在夾竹桃組織中的分布

分離獲得的內(nèi)生真菌菌株中，優(yōu)勢屬為球座菌屬和炭疽菌屬，其中炭疽菌屬為7株，分離率為36.85%，主要分布于莖段中；球座菌屬分離到4株菌，分離率為21.05%，全部來源于葉組織；葉點霉屬分離到3株菌，分離率為15.79%，曲霉屬分離到2株菌，分離率為10.53%，全部來源于葉組織。另從葉片中分離到1株新殼梭孢屬真菌，從莖段中分離到隔孢殼科新屬、間座菌屬真菌各1株(表3)。

表 3 夾竹桃內(nèi)生真菌在組織中的分布情況Table 3 Distribution of the endophytic fungi in Nerium oleander

2.4 內(nèi)生真菌抑菌活性的分析

挑選分離到的代表菌株進行液體發(fā)酵培養(yǎng)。將菌絲體和發(fā)酵液在干燥箱中干燥后用浸提液進行浸提。采用浸提物對蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌、坎氏弧菌和魔鬼弧菌進行抑菌活性檢測。結(jié)果(表4)顯示，jing-116、ye-135、ye-136對芽孢桿菌有較強的抑制效果，其中jing-116、ye-135的抑菌圈分別為7.98 mm和9.29 mm，ye-136更是高達15.36 mm；ye-134對溶藻弧菌有抑制效果，抑菌圈為6.65 mm；jing-117、ye-130、ye-136對坎氏弧菌有抑制效果，抑菌圈分別為8.28、8.33、9.74 mm。抑菌實驗結(jié)果表明，具有抑菌活性的內(nèi)生真菌在夾竹桃的不同組織中均有分布，其中葉片中內(nèi)生真菌的抑菌活性略高于莖段。

表 4 分離出的內(nèi)生真菌的抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of the isolated endophytic fungi

3 討論與結(jié)論

本研究從夾竹桃的葉和莖中分離到19株內(nèi)生真菌，采用形態(tài)學結(jié)合ITS序列分析表明其分屬于7個屬，優(yōu)勢屬包括炭疽菌屬、球座菌屬、葉點霉屬，其他還包括新殼梭孢屬、曲霉屬、隔孢殼科新屬、間座殼屬。其他學者對夾竹桃內(nèi)生真菌的研究中也曾分離到炭疽菌屬(Ramesha et al., 2013)，而其他6個屬在以往的夾竹桃內(nèi)生真菌的研究中較少被提及，這可能是因為球座菌屬、葉點霉屬、新殼梭孢屬、曲霉屬、隔孢殼科和間座殼屬較少產(chǎn)孢，依靠形態(tài)學的鑒定方法較難準確鑒定這些真菌。例如，從夾竹桃中分離到42株內(nèi)生真菌，分屬于14個類群， 依靠形態(tài)能夠確認的僅包括炭疽菌屬、毛殼菌屬和枝孢霉屬(Huang et al., 2007)；而印度學者Ramesha等(2013)從夾竹桃中分離到28株內(nèi)生真菌，也僅描述出鐮刀菌(FusiumsemitectumNOF-3)、交鏈孢菌(AlternariaNOF-7)、球孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesNOF-8)和菌絲霉菌(MyceliasteriliaNOS-6) 這些比較容易通過形態(tài)學進行鑒定的種屬。本研究利用形態(tài)學結(jié)合ITS序列分析相互結(jié)合的方法，準確地鑒定出夾竹桃內(nèi)生真菌的類型及其在不同組織的分布狀況等，首次為夾竹桃內(nèi)生真菌多樣性的研究提供了準確的參考數(shù)據(jù)。

本研究分離得到6株活性菌株(jing-116、jing-117、ye-130、ye-134、ye-135、ye-136)，其中大部分抗菌活性較強的內(nèi)生真菌(如ye-130、ye-134、ye-135和ye-136)來源于夾竹桃的葉，而夾竹桃的強心甙、三萜皂甙等活性成分也主要分布在葉中，表明內(nèi)生真菌的活性可能與宿主植物有關(guān)(Radu & Kqueen, 2002)。因此，從植物的藥用部位分離內(nèi)生真菌獲得活性菌株的機會可能更大(Gouda et al., 2016)。另外，本研究分離到的球座菌屬和炭疽菌屬包含多株真菌，如ye-127、ye-129、ye-130、ye-132的ITS序列相同，均屬于球座菌屬(Guignardia)，僅ye-130有抗菌活性；同理jing-115和jing-116的ITS序列相同，均屬于炭疽菌屬(Colletotrichum)，僅jing-116有抗菌活性，說明抗菌活性具有菌株特異性，與Phongpaichit等(2006)的研究結(jié)果一致。這說明在做夾竹桃內(nèi)生真菌分離時，通過增加分離的真菌數(shù)量，將有利于得到更多抗菌活性菌株。

本研究分離得到的抗細菌活性的內(nèi)生真菌中，ye-134(球座菌屬，Guignardiasp.)對溶藻弧菌有抑制作用，jing-117(新殼梭孢屬，Neofusicoccumsp.)、ye-130(Guignardiasp.)和ye-136(曲霉屬，Aspergillussp.)對坎氏弧菌有抑制作用。坎氏弧菌(Dong et al., 2017)是最近幾年發(fā)現(xiàn)的病原弧菌，因此本研究展現(xiàn)了其良好的應(yīng)用前景。目前，從曲霉屬真菌中有發(fā)現(xiàn)鰻弧菌(Guo et al., 2016)、副溶血性弧菌(Zhu et al., 2018)、抗哈維氏弧菌(Guo et al., 2019)的活性物質(zhì)，但還未從新殼梭孢屬和球座菌屬真菌中發(fā)現(xiàn)抗弧菌的真菌和活性物質(zhì)。新殼梭孢菌是植物病原菌，目前包含大約50個種，從7個種的新殼梭孢菌中分離鑒定了9類化合物，包括環(huán)己烯酮、5，6-二氫-2-吡喃酮、麥托考酮、萘酮、萘醌、酚和醇、倍半萜等(Salvatore et al., 2021)。球座菌屬真菌也曾經(jīng)在其他植物內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)有抗菌活性(Gong et al., 2014)。在后續(xù)研究中，我們將針對ye-134、ye-130和jing-117開展活性物質(zhì)的研究，有望獲得一些新型的抗水產(chǎn)病菌的抗菌劑。