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        廣西夾竹桃內(nèi)生真菌的多樣性和抑制幾種水產(chǎn)病原菌活性篩選

        2023-03-13 07:41:26宋靜靜羅美苗楊子聰王琳諸葛才智邱清華朱開昕蘇本偉
        廣西植物 2023年1期

        宋靜靜, 羅美苗, 李 露, 楊子聰, 王琳, 諸葛才智, 邱清華, 朱開昕, 蘇本偉, 龔 斌*

        ( 1. 廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室, 北部灣大學 海洋學院, 廣西 欽州535011; 2. 北部灣大學 陶瓷與設(shè)計學院, 廣西 欽州535011; 3. 欽州市中醫(yī)醫(yī)院, 廣西 欽州535099 )

        夾竹桃(Neriumoleande)是夾竹桃科(Apocynaceae)夾竹桃屬(Nerium)中的一種傳統(tǒng)藥用植物,含有非常豐富的活性化合物,在世界各地(特別是印度和中國)被廣泛應(yīng)用。在傳統(tǒng)中醫(yī)中,被用于治療心臟疾病、糖尿病、哮喘、癌癥和癲癇等疾病( Elliott, 2002)。近代藥理活性研究表明,夾竹桃含有抗細菌(Hussain & Gorsi, 2004)、抗真菌(Hadizadeh et al., 2009)、抗病毒(Singh et al., 2013)、抗氧化(Dey et al., 2012)、抗瘧疾(Sharma et al., 2005)等多種活性成分。

        內(nèi)生真菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,廣泛存在于植物的健康組織中。內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物在藥理學和農(nóng)業(yè)中應(yīng)用廣泛(Alurappa et al., 2014)。從在紫杉的內(nèi)生真菌Taxomycesandreanae中發(fā)現(xiàn)了抗癌化合物紫杉醇(Stierle et al., 1995)開始,目前已從植物內(nèi)生真菌分離出多個抗病毒、抗腫瘤、抗微生物活性化合物,僅就抗微生物活性而言,就已發(fā)現(xiàn)了Altersolanol A、Enfumafungin、Colletotric acid、Jesterone、Hydroxy-jesterone、Guignardic acid、Pestacin、Isopestacin等幾十種活性化合物(Gupta et al., 2020),并發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌可能在藥用植物活性物質(zhì)的合成中有重要作用。國內(nèi)外研究表明,目前有少量從夾竹桃中得到內(nèi)生菌及其活性物質(zhì)的報道(Vallabhbhai, 2008; Ramesha et al., 2013; Ren et al., 2016; Ma et al., 2017; 鄭浩等, 2020; 朱美林等, 2020),但是,其對真菌的鑒定主要基于形態(tài)學特征。植物內(nèi)生真菌很多不產(chǎn)孢,僅依靠形態(tài)學數(shù)據(jù)不能準確反應(yīng)夾竹桃內(nèi)生真菌種類,而采用分子系統(tǒng)的方法對夾竹桃內(nèi)生真菌多樣性進行研究還未有報道。此外,目前研究發(fā)現(xiàn)的夾竹桃內(nèi)生真菌及其活性物質(zhì)的類型主要包括抗腫瘤、抗氧化、殺蟲、抗植物病原真菌、抗人體的病原菌等,而在抗水產(chǎn)病菌方面鮮有報道。

        廣西地處亞熱帶地區(qū),良好的環(huán)境孕育了很多藥用價值高的道地藥材,該區(qū)域藥用植物內(nèi)生菌多樣性的研究可以為將來系統(tǒng)評估和確定藥材藥效的地域差異提供參考。目前,水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的使用受到了嚴格限制,導致新的水產(chǎn)病原菌及抗生素多耐藥菌不斷出現(xiàn)。夾竹桃內(nèi)生真菌作為發(fā)掘天然活性化合物的重要資源,有希望從中獲得抑制水產(chǎn)病原菌的新型抗菌活性菌株和化合物。本研究擬對廣西欽州市夾竹桃中的內(nèi)生真菌進行分離鑒定和抗菌活性篩選,以確定夾竹桃內(nèi)生真菌多樣性究竟如何,有哪些內(nèi)生真菌類型及其在不同組織的分布情況,以期能夠獲得一些具有抗水產(chǎn)病原弧菌活性的菌株,為進一步開發(fā)新型的抗菌劑奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 樣品采集和預(yù)處理

        夾竹桃樣品采集于廣西欽州市欽北區(qū),經(jīng)欽州市中醫(yī)院中藥研究所朱開昕高級工程師鑒定為夾竹桃屬夾竹桃(Neriumoleander)。選取健康夾竹桃的新鮮莖段和葉組織塊,用自來水沖洗表面的泥土和灰塵,在無菌操作臺中進行表面消毒:先將樣品浸泡在75%酒精中3~5 min,再轉(zhuǎn)入3%~5%的次氯酸鈉溶液中浸泡30 s,然后再用無菌水沖洗干凈。在超凈操作臺中放到干燥滅菌的培養(yǎng)皿中晾干,備用。

        1.2 內(nèi)生真菌分離和純化

        將上述處理過的莖段和葉片組織用無菌剪刀剪成5 mm×5 mm小塊后,貼于PDA 培養(yǎng)基平板上;置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2~4 d,并定期觀察真菌的生長情況;得到生長狀況良好的菌株;待組織邊緣發(fā)現(xiàn)有菌絲長出時,在無菌環(huán)境下挑取菌絲尖端轉(zhuǎn)接到純化培養(yǎng)基平板上;經(jīng)多次分離純化后再接種于 PDA 斜面作為保種,保存在4~8 ℃冰箱備用。

        1.3 形態(tài)學鑒定

        將分離菌株接種于PDA培養(yǎng)基平板中,放置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在各菌株生長的最佳時期,對照《真菌鑒定手冊》(魏景超, 1979),觀察菌落形態(tài)(菌落顏色、大小、性狀及邊緣等)、生長情況、菌絲體、孢子的形態(tài)特征和表面特征,拍照記錄。

        1.4 DNA提取

        菌絲體用液氮研磨至勻漿狀,再加入600 μL的CTAB提取液,65 ℃水浴45 min,12 000 r·min-1離心5 min,取上清液;加入苯酚∶氯仿∶異戊醇混合液(25∶24∶1),混勻后4 ℃條件下,10 000 r·min-1離心5 min;取上清液,加入-20 ℃預(yù)冷的異戊醇靜置數(shù)分鐘;室溫12 000 r·min-1離心5 min,去上清液;取沉淀,用75%乙醇洗沉淀,加50 μL無菌水,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.5 ITS rDNA 序列分析

        提取內(nèi)生真菌的DNA后,用真菌鑒定通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 擴增真菌ITS rDNA序列。PCR反應(yīng)體系:ddH2O 20 μL,2×Taq PCR MasterMix 25 μL (北京索萊寶生物科技有限公司),10 μmol·L-1的引物各2 μL,10 ng·μL-1模板1 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30個循環(huán),72 ℃延伸10 min。引物合成和測序都由北京六合華大基因科技有限公司完成。將獲得的序列用BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性檢索,比對得出與其相似性最高的核酸序列。通過MEGA7.0軟件使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

        1.6 內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的提取和抑菌活性的測定

        接種分離真菌于100 mL液體PDA培養(yǎng)基,于26~28 ℃在200 r·min-1轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)10~20 d至菌絲體長滿三角瓶;8 000 r·min-1離心收集菌絲體,20 ℃下吹干水分;稱取0.3 g干燥后的菌體加入5 mL提取液(乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸=80∶15∶5)浸泡,然后將提取液靜置揮發(fā),加入500 μL乙酸乙酯溶解提取物。抑菌活性指示菌蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus) 、魔鬼弧菌(Vibriodiabolicus)由本實驗室購買保藏;溶藻弧菌(V.alginolyticus)、坎氏弧菌(V.campbellii)分離自患病的魚蝦。分別接種到LB液體培養(yǎng)基中,30~35 ℃搖床上以200 r·min-1的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)過夜。將上述菌液200 μL采用混菌法接種于培養(yǎng)皿中,采用濾紙片法測定抑菌活性,觀察抑菌圈的有無及大小,測量并記錄抑菌圈直徑(Gong et al., 2018)。該實驗使用濾紙片蘸取乙酸乙酯作為空白對照,陽性對照為濾紙片蘸取50 μg·mL-1的卡那霉素和氯霉素。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 內(nèi)生真菌的形態(tài)學鑒定

        如圖1所示,根據(jù)菌株的菌落、菌絲體和孢子的形態(tài)特征,對照《真菌簽定手冊》進行初步鑒定,分屬于7個屬。其中,葉部組織獲得12株菌,占63.16%,分屬于炭疽菌屬(Colletotrichumspp.)、球座菌屬(Guignardiaspp.)、葉點霉屬(Phyllostictaspp.)、 新殼梭孢屬 (Neofusicoccumsp.) 和曲霉屬(Aspergillusspp.);莖部分離到7株菌,分別屬于炭疽菌屬、隔孢殼科新屬(Nothophomasp.)和間座殼屬(Diaporthesp.),占分離總量的36.84%(表1),表明夾竹桃的內(nèi)生真菌在莖段、葉片組織中分布廣泛。

        A. 菌株ye-130; B. 菌株ye-134; C. 菌株ye-135; D. 菌株ye-136; E. 菌株jing-116; F. 菌株jing-117; G. 菌株jing-119; H. 菌株jing-180。A. Strain ye-130; B. Strain ye-134; C. Strain ye-135; D. Strain ye-136; E. Strain jing-116; F. Strain jing-117; G. Strain jing-119; H. Strain jing-180.圖 1 夾竹桃部分內(nèi)生真菌的典型菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of some endophytic fungi isolated from Nerium oleander

        表 1 夾竹桃不同組織中內(nèi)生真菌屬的組成Table 1 Composition of endophytic fungi in different tissues of Nerium oleander

        2.2 夾竹桃內(nèi)生真菌的分子生物學鑒定

        通過對得到的19株內(nèi)生真菌的DNA 進行PCR擴增和ITS測序,并進行BLAST分析,結(jié)果表明這19株內(nèi)生真菌都屬于子囊菌門,涵蓋5個目7個屬,且ITS序列和GenBank相似性都在98%以上(表2)?;贗TS 序列用MEGA 7軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹(圖2)顯示有6個分支,其中ye-127、ye-129、ye-130、ye-131、ye-132、ye-133和ye-134都屬于葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales),與Guignardiaalliacea、G.musicola、Phyllostictafallopiae構(gòu)成一個分支;jing-114、jing-115、jing-116、jing-118、jing-179、ye-126、ye-128都屬于小叢殼目(Glomerellales),與Colletotrichumfructicola和C.citri-maximae構(gòu)成一個分支;jing-117與Neofusicoccumparvum構(gòu)成一個分支;jing-180屬于間座殼目(Diaporthales),和Diaporthesp.構(gòu)成一個分支,其親緣關(guān)系比較近。ye-135、ye136和jing-119共同構(gòu)成一個大的分支,其中jing-119與Nothophomaanigozanthi親緣關(guān)系較近。ye-135、ye136都屬于Aspergillus,其中ye-135與Aspergillusneoellipticus親緣關(guān)系較近,而ye136與A.tamarii親緣關(guān)系較近。

        表 2 夾竹桃內(nèi)生菌ITS序列BLAST分析Table 2 BLAST analysis of ITS sequence of Nerium oleander

        圖 2 NJ法構(gòu)建的夾竹桃內(nèi)生真菌ITS序列系統(tǒng)進化樹圖Fig. 2 Phylogenetic tree of ITS rDNA sequences of endophytic fungi of Nerium oleander by NJ method

        2.3 內(nèi)生真菌在夾竹桃組織中的分布

        分離獲得的內(nèi)生真菌菌株中,優(yōu)勢屬為球座菌屬和炭疽菌屬,其中炭疽菌屬為7株,分離率為36.85%,主要分布于莖段中;球座菌屬分離到4株菌,分離率為21.05%,全部來源于葉組織;葉點霉屬分離到3株菌,分離率為15.79%,曲霉屬分離到2株菌,分離率為10.53%,全部來源于葉組織。另從葉片中分離到1株新殼梭孢屬真菌,從莖段中分離到隔孢殼科新屬、間座菌屬真菌各1株(表3)。

        表 3 夾竹桃內(nèi)生真菌在組織中的分布情況Table 3 Distribution of the endophytic fungi in Nerium oleander

        2.4 內(nèi)生真菌抑菌活性的分析

        挑選分離到的代表菌株進行液體發(fā)酵培養(yǎng)。將菌絲體和發(fā)酵液在干燥箱中干燥后用浸提液進行浸提。采用浸提物對蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌、坎氏弧菌和魔鬼弧菌進行抑菌活性檢測。結(jié)果(表4)顯示,jing-116、ye-135、ye-136對芽孢桿菌有較強的抑制效果,其中jing-116、ye-135的抑菌圈分別為7.98 mm和9.29 mm,ye-136更是高達15.36 mm;ye-134對溶藻弧菌有抑制效果,抑菌圈為6.65 mm;jing-117、ye-130、ye-136對坎氏弧菌有抑制效果,抑菌圈分別為8.28、8.33、9.74 mm。抑菌實驗結(jié)果表明,具有抑菌活性的內(nèi)生真菌在夾竹桃的不同組織中均有分布,其中葉片中內(nèi)生真菌的抑菌活性略高于莖段。

        表 4 分離出的內(nèi)生真菌的抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of the isolated endophytic fungi

        3 討論與結(jié)論

        本研究從夾竹桃的葉和莖中分離到19株內(nèi)生真菌,采用形態(tài)學結(jié)合ITS序列分析表明其分屬于7個屬,優(yōu)勢屬包括炭疽菌屬、球座菌屬、葉點霉屬,其他還包括新殼梭孢屬、曲霉屬、隔孢殼科新屬、間座殼屬。其他學者對夾竹桃內(nèi)生真菌的研究中也曾分離到炭疽菌屬(Ramesha et al., 2013),而其他6個屬在以往的夾竹桃內(nèi)生真菌的研究中較少被提及,這可能是因為球座菌屬、葉點霉屬、新殼梭孢屬、曲霉屬、隔孢殼科和間座殼屬較少產(chǎn)孢,依靠形態(tài)學的鑒定方法較難準確鑒定這些真菌。例如,從夾竹桃中分離到42株內(nèi)生真菌,分屬于14個類群, 依靠形態(tài)能夠確認的僅包括炭疽菌屬、毛殼菌屬和枝孢霉屬(Huang et al., 2007);而印度學者Ramesha等(2013)從夾竹桃中分離到28株內(nèi)生真菌,也僅描述出鐮刀菌(FusiumsemitectumNOF-3)、交鏈孢菌(AlternariaNOF-7)、球孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesNOF-8)和菌絲霉菌(MyceliasteriliaNOS-6) 這些比較容易通過形態(tài)學進行鑒定的種屬。本研究利用形態(tài)學結(jié)合ITS序列分析相互結(jié)合的方法,準確地鑒定出夾竹桃內(nèi)生真菌的類型及其在不同組織的分布狀況等,首次為夾竹桃內(nèi)生真菌多樣性的研究提供了準確的參考數(shù)據(jù)。

        本研究分離得到6株活性菌株(jing-116、jing-117、ye-130、ye-134、ye-135、ye-136),其中大部分抗菌活性較強的內(nèi)生真菌(如ye-130、ye-134、ye-135和ye-136)來源于夾竹桃的葉,而夾竹桃的強心甙、三萜皂甙等活性成分也主要分布在葉中,表明內(nèi)生真菌的活性可能與宿主植物有關(guān)(Radu & Kqueen, 2002)。因此,從植物的藥用部位分離內(nèi)生真菌獲得活性菌株的機會可能更大(Gouda et al., 2016)。另外,本研究分離到的球座菌屬和炭疽菌屬包含多株真菌,如ye-127、ye-129、ye-130、ye-132的ITS序列相同,均屬于球座菌屬(Guignardia),僅ye-130有抗菌活性;同理jing-115和jing-116的ITS序列相同,均屬于炭疽菌屬(Colletotrichum),僅jing-116有抗菌活性,說明抗菌活性具有菌株特異性,與Phongpaichit等(2006)的研究結(jié)果一致。這說明在做夾竹桃內(nèi)生真菌分離時,通過增加分離的真菌數(shù)量,將有利于得到更多抗菌活性菌株。

        本研究分離得到的抗細菌活性的內(nèi)生真菌中,ye-134(球座菌屬,Guignardiasp.)對溶藻弧菌有抑制作用,jing-117(新殼梭孢屬,Neofusicoccumsp.)、ye-130(Guignardiasp.)和ye-136(曲霉屬,Aspergillussp.)對坎氏弧菌有抑制作用。坎氏弧菌(Dong et al., 2017)是最近幾年發(fā)現(xiàn)的病原弧菌,因此本研究展現(xiàn)了其良好的應(yīng)用前景。目前,從曲霉屬真菌中有發(fā)現(xiàn)鰻弧菌(Guo et al., 2016)、副溶血性弧菌(Zhu et al., 2018)、抗哈維氏弧菌(Guo et al., 2019)的活性物質(zhì),但還未從新殼梭孢屬和球座菌屬真菌中發(fā)現(xiàn)抗弧菌的真菌和活性物質(zhì)。新殼梭孢菌是植物病原菌,目前包含大約50個種,從7個種的新殼梭孢菌中分離鑒定了9類化合物,包括環(huán)己烯酮、5,6-二氫-2-吡喃酮、麥托考酮、萘酮、萘醌、酚和醇、倍半萜等(Salvatore et al., 2021)。球座菌屬真菌也曾經(jīng)在其他植物內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)有抗菌活性(Gong et al., 2014)。在后續(xù)研究中,我們將針對ye-134、ye-130和jing-117開展活性物質(zhì)的研究,有望獲得一些新型的抗水產(chǎn)病菌的抗菌劑。

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