歐陽志偉, 李 伶, 覃 鋒, 何佶蔓, 唐文迪, 耿麗筱, 覃江克*

( 1. 廣西師范大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院， 省部共建藥用資源化學(xué)與藥物分子工程國家重點實驗室， 廣西 桂林 541004； 2. 廣西-東盟食品檢驗檢測中心， 南寧 530029 )

巖黃連，又名土黃連、巖胡，為罌粟科(Papaveraceae)紫堇屬植物石生黃堇(Corydalissaxicola)的全草，多分布于我國廣西、貴州、云南等高山石縫、石穴中，是典型的喀斯特地帶藥用植物之一(唐超玲等，2018)。據(jù)《廣西植物志》《中藥大辭典》《中華本草》等記載，巖黃連味苦、性寒，具有清熱、消腫、止血、止痛、利濕、拔毒等作用，在臨床上用于治療乙肝、肝硬化、急性黃疸型肝炎以及肝癌等肝部疾病，具有顯著療效(中國科學(xué)院廣西植物研究所，1993；江蘇新醫(yī)學(xué)院，1996；國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會，1999；韋記青等，2006；吳穎瑞等，2012；Zeng et al., 2013; Liang et al., 2016; Zhang et al., 2016; Wu et al., 2017)。

有研究表明，巖黃連中的主要有效成分是生物堿，其基本類型為四氫原小檗堿型、小檗堿型、阿樸菲型、血根堿型、芐基異喹啉型等。其中，脫氫卡維汀、小檗堿和巴馬汀為其主要生物堿類活性成分，具有抗腫瘤、保肝、鎮(zhèn)痛、抗菌等多種藥理活性(余姣嬌等，2018；張成等，2020；Kuai et al., 2020)。也有研究表明，炎癥與肝癌、肝硬化、黃疸型肝炎等疾病密切相關(guān)，在這些疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要角色，有效干預(yù)炎癥，有益于癥狀的緩解和相關(guān)疾病的治療(Luigi et al., 2013; Ashwini et al., 2018; Lee et al., 2021)。目前，對巖黃連抗炎活性方面的研究很少，并且主要集中在生物總堿部位等粗提物研究上(唐超玲等，2018；諸葛明麗等，2019；肖萍等，2019；郭雅婷等，2021)，而對其中單體化合物抗炎活性的研究尚未見報道，其抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)不明確。為了更深入了解巖黃連化學(xué)成分，探究其抗炎活性物質(zhì)，本課題組對巖黃連95%乙醇提取物中的乙酸乙酯部分進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分分離和純化、結(jié)構(gòu)鑒定及抗炎活性研究，以期從純單體化合物層面豐富壯藥巖黃連的化學(xué)成分，闡明其抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ)，為巖黃連的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

巖黃連購于廣西東蘭縣, 經(jīng)廣西師范大學(xué)生命科學(xué)院唐紹清教授鑒定為罌粟科植物石生黃堇(Corydalissaxicola)的全草。

1.2 儀器和試劑

LC3000型制備高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；LC-20A分析型高效液相色譜儀(日本島津科技公司)；Inertil ODS-3(4.6 mm×250 mm)分析柱(日本島津科技公司)；400、600 MHz 超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；ZHJH-C1112B超凈工作臺(Clean Bench公司)；TH4-200倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)；Infinite M1000型多功能酶標(biāo)儀(Tecan公司)；YMC-Pack-ODS 色譜柱 (20.0 mm×250 mm)(日本YMC公司)；AB-8大孔樹脂(鄭州和成新材料科技有限公司)；100～200目柱色譜硅膠(青島海洋化工有限公司)；Sephadex LH-20凝膠(美國GE公司)；MCI柱色譜(日本三菱公司)。甲醇(色譜純，美國TEDIA公司)；乙醇、乙酸乙酯、正丁醇等溶劑(分析純，西隴化工股份有限公司)；甲醇、三氟乙酸(TFA)溶劑(色譜純，上海泰坦科技股份有限公司)；RAW264.7巨噬細(xì)胞(中科院上海生命科學(xué)研究院)；一氧化氮(NO)試劑盒(碧云天公司，批號為022421210608)；噻唑藍(lán)(MTT)粉劑(Solarbio公司，批號為1223G0531)；脂多糖(Solarbio公司，批號為426Y031)；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司，批號為2110875CP)；吲哚美辛(西亞公司，批號為Y2462)。

1.3 提取和分離

參考Zhang等(2016)的方法并有所改動。將9 kg巖黃連全草藥材粉碎后，加入50 L石油醚回流3 h去除葉綠素，過濾后再加入95%乙醇回流提取3次，每次3 h，將提取液合并濃縮得到浸膏0.7 kg。將浸膏溶于1 L 3%的酒石酸溶液(pH = 2～3)，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，濃縮得石油醚部位100 g、乙酸乙酯部位60 g、正丁醇部位60 g。

取乙酸乙酯部位(60 g)，用AB-8大孔樹脂初步分離，乙醇-水(0∶100→100∶0,V/V)梯度洗脫，得到Fr.1～Fr.8共8個組分。Fr.3經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱(甲醇-水,30∶70→100∶0,V/V)分離，得到Fr.3-1～Fr.3-8共8個組分。其中，F(xiàn)r.3-2經(jīng)制備型HPLC(甲醇-0.1% TFA，45∶55,V/V)純化后得到化合物1(16 mg)、2(15 mg)；Fr.3-4經(jīng)制備型HPLC(甲醇-0.1% TFA，40∶60,V/V)純化后得到化合物3(83.7 mg)；Fr.3-5經(jīng)制備型HPLC(甲醇-0.1% TFA，40∶60,V/V)純化后得到化合物4(10 mg)、5(10 mg)；Fr.3-6經(jīng)制備型HPLC(甲醇-0.1% TFA，40∶60,V/V)純化后得到化合物6(14 mg)；Fr.3-8經(jīng)制備型HPLC(甲醇-0.1% TFA，45∶55,V/V)純化后得到化合物7(11.7 mg)、8(7 mg)。Fr.5經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱(甲醇-水, 30∶70→100∶0,V/V)分離，得到Fr.5-1～Fr.5-5共5個組分。其中，F(xiàn)r.5-5經(jīng)制備型HPLC(甲醇-水，35∶665,V/V)純化后得到化合物9(6.1 mg)。Fr.8經(jīng)硅膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇)進(jìn)行分離，得到Fr.8-1～Fr.8-6共6個組分。其中，F(xiàn)r.8-1經(jīng)制備型HPLC(甲醇-0.1% TFA，75∶25,V/V)純化后得到化合物10(4.6 mg)；Fr.8-3經(jīng)MCI柱色譜處理后經(jīng)制備型HPLC(甲醇-水，72∶28,V/V)純化后得到化合物11(3.4 mg)、12(118.6 mg)；Fr.8-4和Fr.8-5經(jīng)制備型HPLC(甲醇-水，78∶22,V/V)純化后得到化合物13(3.7 mg)?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖 1 化合物1-13 結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of compounds 1-13

1.4 細(xì)胞的培養(yǎng)及毒性評價

RAW264.7細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，生長至70%時進(jìn)行傳代。采用MTT法(Mosmann, 1983)檢測化合物對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響。

將對數(shù)生長周期的RAW264.7細(xì)胞株，按照180 μL每孔的體積將濃度為1×105個·mL-1的細(xì)胞懸浮液接種于96孔板中，同時設(shè)置空白組、吲哚美辛組以及給藥組(50 μmol·L-1)，每組設(shè)3個復(fù)孔，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。在避光條件下每孔加入10 μL 5 g·L-1的MTT溶液，繼續(xù)于5% CO2、37 ℃條件下孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO試劑充分溶解后用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測量吸光度OD值，并根據(jù)OD值計算RAW264.7細(xì)胞的存活率。計算公式如下：

存活率=(OD給藥組)/(OD空白組)×100%

1.5 抗炎活性評價

細(xì)胞分為4組，分別為空白組、LPS炎癥模型組、不同濃度給藥組(測試化合物及陽性藥吲哚美辛)，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，取對數(shù)生長周期的RAW264.7細(xì)胞株，以1×105個·mL-1的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后給藥。空白組加入完全培養(yǎng)基，給藥組加入不同濃度的化合物，繼續(xù)培養(yǎng)孵育4 h后和LPS炎癥模型組一起加入質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的LPS，繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.6 NO含量測定

采用Griess法(Green et al., 1982; 焦兵等，2019)測定給藥組對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞上清液中NO的含量，收集各組細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照NO檢測試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1C19H14NO4，黃色晶體，HR-ESI-MSm/z: 321.259 0 [M+H]+。1H-NMR (DMSO-d6，400 MHz)δH: 7.78 (1H, s, H-1), 7.08 (1H, s, H-4), 3.20 (2H, t,J= 6.3 Hz, H-5), 4.89 (2H, t,J= 6.3 Hz, H-6), 9.97 (1H, s, H-8), 8.03 (1H, d,J= 8.6 Hz, H-11), 7.83 (1H, d,J= 8.6 Hz, H-12), 8.98 (1H, s, H-13), 6.17 (2H, s, 2-OCH2O-3), 6.53 (2H, s, 9-OCH2O-10);13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz)δc: 105.3 (C-1), 147.7 (C-2), 149.8 (C-3), 108.4 (C-4), 130.6 (C-4a), 26.3 (C-5), 55.1 (C-6), 143.8 (C-8), 111.6 (C-8a), 144.6 (C-9), 147.7 (C-10), 121.1 (C-11), 121.8 (C-12), 132.3 (C-12a), 121.1 (C-13), 136.8 (C-13a), 120.5 (C-13b), 102.1 (2-OCH2O-3), 104.5 (9-OCH2O-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(毛宇昂，2006)報道基本一致，故鑒定該化合物為黃連堿(coptisine)。

化合物2C20H18ClNO4，淺黃色結(jié)晶粉末，HR-ESI-MSm/z: 372.103 3 [M+H]+。1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δH: 7.79 (1H, s, H-1), 7.08 (1H, s, H-4), 3.20 (2H, t,J= 6.4 Hz, H-5), 4.94 (2H, t,J= 6.3 Hz, H-6), 9.91 (1H, s, H-8), 8.20 (1H, d,J= 9.2 Hz, H-11), 8.00 (1H, d,J= 9.0 Hz, H-12), 8.97 (1H, s, H-13), 6.17 (2H, s, 2-OCH2O-3), 4.09 (3H, s, 9-OCH3), 4.06 (3H, s, 10-OCH3);13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz)δC: 105.5 (C-1), 147.7 (C-2), 150.4 (C-3), 108.4 (C-4), 130.7 (C-4a), 26.3 (C-5), 55.2 (C-6), 143.7 (C-8), 121.4 (C-8a), 145.5 (C-9), 149.8 (C-10), 126.7 (C-11), 123.6 (C-12), 133.0 (C-12a), 120.5 (C-13), 137.5 (C-13a), 120.2 (C-13b), 102.1 (2-OCH2O-3), 62.0 (9-OCH3), 57.1 (10-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Janssen et al., 1989)報道基本一致，故鑒定該化合物為鹽酸小檗堿(berberine hydrochloride)。

化合物3C20H18NO4+，黃色粉末，HR-ESI-MSm/z: 337.127 6 [M+H]+。1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δH: 7.78(1H, s, H-1), 7.09 (1H, s, H-4), 13.20 (2H, t,J= 8.0 Hz, H-5), 4.93 (2H, t,J= 8 Hz, H-6), 9.88 (1H, s, H-8), 7.99 (1H, d,J= 9.1 Hz, H-10), 8.20 (1H, d,J= 9.2 Hz, H-11), 8.92 (1H, s, H-13), 6.17 (2H, s, -OCH2O-), 4.09 (3H, s, -OCH3), 4.07 (3H, s, -OCH3);13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz)δC: 105.4 (C-1), 149.8 (C-2), 147.7 (C-3), 108.5 (C-4), 120.4 (C-4a), 26.3 (C-5), 55.2 (C-6), 145.5 (C-8), 121.4 (C-8a), 150.4 (C-9), 123.5 (C-10), 126.8 (C-11), 143.7 (C-12), 133.0 (C-12a), 120.2 (C-13), 137.5 (C-13a), 130.7 (C-13b), 102.1 (C-OCH2O), 61.9 (9-OCH3), 57.1 (12-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Sun et al., 2009)報道一致，故鑒定該化合物為文殊蘭新堿(crinumaquine)。

化合物4C21H20NO4+，黃色針晶，HR-ESI-MSm/z: 351.143 3 [M+H]+。1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δH: 7.15(1H, s, H-1), 7.47 (1H, s, H-4), 3.11 (2H, s, H-5), 4.82 (2H, s, H-6), 9.89 (1H, s, H-8), 8.20 (2H, s, H-9, 12), 4.09(6H, s, -OCH3), 6.18 (2H, s, -OCH2O-), 2.93 (3H, s, CH3);13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz)δC: 110.6 (C-1), 146.4 (C-2), 149.0 (C-3), 108.2 (C-4), 133.8 (C-4a), 27.3 (C-5), 57.0 (C-6), 144.0 (C-8), 121.4 (C-8a), 144.1 (C-9), 150.3 (C-10), 125.9 (C-11), 120.4 (C-12), 133.0 (C-12a), 135.9 (C-13), 120.8 (C-13a), 130.1 (C-13b), 56.7 (O-CH3), 62.1 (O-CH3), 17.7 (C-CH3), 102.0 (-OCH2O-)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(李志峰等，2012)報道基本一致，故鑒定該化合物為甲基小檗堿(worenine)。

化合物5C21H20NO4+，黃色粉末，HR-ESI-MSm/z: 373.099 7 [M+Na]+。1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δH: 7.17 (1H, s, H-1), 7.38 (1H, s, H-4), 3.14 (2H, t,J= 5.9 Hz, H-5), 4.79 (2H, t,J= 5.8 Hz, H-6), 9.95 (1H, s, H-8), 8.00 (1H, d,J= 9.0 Hz, H-11), 8.06 (1H, d,J= 9.0 Hz, H-12), 3.89 (3H, s, 2-OCH3), 3.85 (3H, s, 3-OCH3), 6.56 (2H, s, 9-O-CH2-O-10), 2.97 (3H, s, 13-CH3);13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz)δC: 111.0 (C-1), 150.6 (C-2), 147.2 (C-3), 110.9 (C-4), 135.6 (C-4a), 26.8 (C-5), 56.7 (C-6), 143.1 (C-8), 132.4 (C-8a), 147.0 (C-9), 144.7 (C-10), 114.4 (C-11), 119.2 (C-12), 131.8 (C-12a), 120.2 (C-13), 130.5 (C-13a), 119.4 (C-13b), 56.1 (2-O-CH3), 55.9 (3-O-CH3), 104.7 (-OCH2O-), 18.2 (13-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(何志超等，2014)報道基本一致，故鑒定化合物為脫氫卡維丁(dehydrocavidine)。

化合物6C21H25NO4，淡黃色無定形粉末，HR-ESI-MSm/z: 356.186 6 [M+H]+。1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δH: 6.87(1H, s, H-1), 6.68 (1H, s, H-4), 2.93 (1H, m, H-5α), 2.44 (1H, m, H-5β), 2.54 (1H, m, H-6α), 3.10 (1H, m, H-6β), 4.06 (1H, d,J= 15.7 Hz, H-8β), 6.88 (2H, s, H-11,12), 2.60 (1H, dd,J= 15.3, 11.2 Hz, H-13α), 3.35 (1H, d,J= 3.7 Hz, H-13β), 3.39 (2H, dd,J= 3.6 Hz, H-8α, 13a), 3.77 (3H, s, 2-OCH3), 3.75 (3H, s, 3-OCH3), 3.73 (3H, s, 9-OCH3), 3.72 (3H, s, 10-OCH3);13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz)δC: 109.4 (C-1), 147.2 (C-2), 147.2 (C-3), 111.7 (C-4), 126.4 (C-4a), 28.6 (C-5), 50.9 (C-6), 53.4 (C-8), 127.7 (C-8a), 144.4 (C-9), 149.8 (C-10), 111.1 (C-11), 123.7 (C-12), 128.3 (C-12a), 35.7 (C-13), 58.8 (C-13a), 129.7 (C-13b), 55.4 (2-OCH3), 55.7 (3-OCH3), 59.6 (9-OCH3), 55.7 (10-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Blanchfieid et al., 2003)的報道基本一致，故鑒定化合物為左旋四氫巴馬汀[(-)-tetrahydropalmatine]。

化合物7C20H20NO4+，黃色無定形粉末，HR-ESI-MSm/z: 339.143 4 [M+H]+。1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δH: 7.04(1H, s, H-1), 7.57 (1H, s, H-4), 3.19 (2H, t, H-5), 4.93 (2H, t,J= 6.3 Hz, H-6), 9.85 (1H, s, H-8), 8.03 (1H, d,J= 9.1 Hz, H-11), 8.17 (1H, d,J= 9.1 Hz, H-12), 8.78 (1H, s, H-13), 3.88 (3H, s, C2-OCH3), 4.05 (3H, s, C9-OCH3), 4.08 (3H, s, C10-OCH3);13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz)δC: 111.5 (C-1), 150.7 (C-2), 146.6 (C-3), 112.3 (C-4), 127.1 (C-4a), 26.1 (C-5), 55.6 (C-6), 145.5 (C-8), 119.2 (C-8a), 150.3 (C-9), 143.6 (C-10), 123.7 (C-11), 126.7 (C-12), 133.2 (C-12a), 119.6 (C-13), 137.9 (C-13a), 121.4 (C-13b), 56.0 (C-OCH3), 62.0 (C-OCH3), 57.1 (C-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Li et al., 2019)報道一致，故鑒定化合物為藥根堿(jatrorrhizine)。

化合物8C11H13NO3，無色棱晶，HR-ESI-MSm/z: 208.097 6 [M+H]+。1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz)δH: 3.33 (2H, m, H-3), 2.81 (2H, t,J= 6.6 Hz, H-4), 7.34 (1H, s, H-5), 7.72 (1H, s, H-8), 6.88 (1H, s, N-H), 3.80 (3H, s, 6-OCH3), 3.75 (3H, s, 7-OCH3);13C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz)δC: 164.7 (C-1), 40.1 (C-3), 27.4 (C-4), 132.9 (C-4a), 109.7 (C-5), 151.6 (C-6), 147.4 (C-7), 110.4 (C-8), 121.6 (C-8a), 55.7 (6-CH3), 55.5 (7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(崔澤旭等，2018)報道相符，故鑒定化合物為紫堇定(corydaldine)。

化合物9C19H21NO5，淡粉色粉末，HR-ESI-MSm/z: 344.149 3 [M+H]+。1H-NMR (CDCl3, 600 MHz)δH: 6.96 (1H, s, H-2), 7.03 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-5), 6.89 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-6), 7.53 (1H, d,J= 15.5 Hz, H-7), 6.17 (1H, d,J= 15.5 Hz, H-8), 6.70 (2H, d,J= 7.8 Hz, H-2′, 6′), 6.86 (2H, d,J= 7.8 Hz, H-3′, 5′), 2.81 (2H, t,J= 6.9 Hz, H-7′), 3.62 (2H, q,J= 6.9 Hz, H-8′), 3.88 (6H, d, -OCH3);13C-NMR (CDCl3, 150 MHz)δC: 127.4 (C-1), 109.7 (C-2), 147.6 (C-3), 146.8 (C-4), 111.4 (C-5), 122.3 (C-6), 141.3 (C-7), 114.6 (C-8), 166.4 (C-9), 130.8 (C-1′), 114.9 (C-2), 146.8 (C-3′), 144.4 (C-4′), 118.2 (C-5′), 121.5 (C-6′), 35.4 (C-7′), 41.0 (C-8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(宋坤等，2014)報道相一致，故鑒定化合物9為反式阿魏酸酰對羥基苯乙胺(N-trans-feruloyl tyramine)。

化合物10C16H22O4，無色油狀液體，HR-ESI-MSm/z: 301.142 4 [M+Na]+。1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz)δH: 7.70 (2H, q,J= 4.3 Hz, H-2, 5), 7.65 (2H, q,J= 4.3 Hz, H-3, 6), 4.19 (4H, t, H-9, 9′), 1.58 (4H, m, H-10, 10′), 1.33 (4H, m, H-11, 11′), 0.88 (6H, t, H-2, 12′);13C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz)δC: 132.1 (C-1, 4), 129.1 (C-2, 5), 132.0 (C-3, 6), 167.6 (C-7, 7′), 65.6 (C-9, 9′) ,30.4 (C-10, 10′), 19.1 (C-11, 11′), 13.9 (C-12, 12′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(陳磊等，2010)報道基本一致，故鑒定該化合物10為對苯二甲酸二丁酯(dibutylterephthalate)。

化合物11C15H10O6，黃色無定形粉末，HR-ESI-MSm/z: 287.054 8 [M+H]+。1H-NMR (MeOH-d4, 600 MHz)δH: 8.04 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-2′, H-6′), 6.86 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-3′, H-5′), 6.14 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-6), 6.35 (1H, d,J= 1.7 Hz, H-8);13C-NMR (MeOH-d4, 150 MHz)δC: 146.6 (C-2), 135.7 (C-3), 175.9 (C-4), 161.1 (C-5), 97.9 (C-6), 164.1 (C-7), 93.1 (C-8), 156.8 (C-9), 103.1 (C-10), 122.3 (C-1′), 129.3 (C-2′, C-6′), 114.9 (C-3′, C-5′), 159.1 (C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(斯建勇等，2006)報道相一致，故鑒定化合物為山奈酚(kaempferol)。

化合物12C11H16O3，淡黃色粉末，HR-ESI-MSm/z: 197.117 0 [M+H]+。1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz)δH: 5.79 (1H, s, H-8), 4.90 (1H, s, 3-OH), 3.98 (1H, m, H-3), 2.35 (2H, ddd,J= 11.6, 4.1, 2.1 Hz, H-2α), 1.51 (3H, s, H-1), 1.89 (1H, ddd,J= 12.8, 4.3, 2.2 Hz, H-4α), 1.29 (2H, d,J= 11.6 Hz, H-2β), 1.22 (3H, s, H-12),1.19 (3H, s, H-11),1.15 (1H, d,J= 12.1 Hz, H-4β);13C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz)δC: 34.8 (C-1), 47.9 (C-2), 63.1 (C-3), 49.7 (C-4), 86.5 (C-5), 171.0 (C-7), 112.4 (C-8), 181.8 (C-9), 25.3 (C-10), 29.8 (C-11), 24.7 (C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(付露等，2019)報道相一致，故鑒定化合物為異地芰普內(nèi)酯(isololiolide)。

化合物13C11H16O3，淡黃色粉末，HR-ESI-MSm/z: 197.117 0 [M+H]+。1H-NMR (Pyr-d5, 600 MHz)δH: 5.86 (1H, s, H-8), 4.38(1H, s, 3-OH), 3.94 (1H, m, H-3), 2.60 (1H, dd,J= 13.4, 2.3 Hz, H-4α), 2.04 (1H, dd,J= 14.2, 2.5 Hz, H-2α), 1.93 (3H, s, H-1), 1.76 (1H, dd,J= 13.4, 3.9 Hz, H-4β), 1.52 (3H, s, H-12), 1.41 (1H, dd,J= 14.2, 3.9 Hz, H-2β), 1.14 (3H, s, H-11);13C-NMR (Pyr-d5, 150 MHz)δC: 37.1 (C-1), 47.3 (C-2), 66.8 (C-3), 48.6 (C-4), 88.0 (C-5), 172.8 (C-7), 114.0 (C-8), 183.9 (C-9), 31.6 (C-10), 28.2 (C-11), 27.5 (C-12)。經(jīng)比對，與化合物12為同分異構(gòu)體，并且以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Sun W et al., 2015)報道相一致，故鑒定化合物為地芰普內(nèi)酯(loliolide)。

2.2 抗炎活性測試

炎癥是生物體對抗外來有害物質(zhì)或損傷的防御性反應(yīng)，通過釋放NO、TNF-α等炎癥介質(zhì)或因子對抗細(xì)菌、病毒等入侵物質(zhì)，以維持機(jī)體平衡；適度的炎癥反應(yīng)對生物體有利，但過度和持續(xù)的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、破裂并釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)，最終引起組織壞死，引發(fā)炎癥性疾病(Sun LD et al., 2015)。NO是一種獨特的內(nèi)源性信號分子，參與正常生理活動；然而，炎癥反應(yīng)過度爆發(fā)時，NO會異常過量表達(dá)，導(dǎo)致炎癥加劇，其與多種炎癥疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，通常被認(rèn)為是炎癥產(chǎn)生的標(biāo)志并用作體外抗炎藥物篩選模型(Guzik et al., 2003)。本研究采用LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)NO對所分離的化合物進(jìn)行抗炎活性初篩。首先，采用MTT方法測定化合物對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響，以確保后續(xù)實驗NO抑制實驗在基本無毒的條件下進(jìn)行。本研究結(jié)果表明，當(dāng)化合物濃度為50 μmol·L-1時，除化合物1-3外，其余化合物RAW264.7細(xì)胞存活率均高于70%。因此，我們用Griess法進(jìn)一步測試了化合物4-13對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的抑制作用(表1)。從表1可以看出，化合物4、9、11對NO的產(chǎn)生有明顯的抑制活性，IC50值分別為(18.8 ± 0.2)、(29.1 ± 0.3)、(18.0 ± 0.1)μmol·L-1，優(yōu)于對照藥吲哚美辛，表現(xiàn)出良好的體外抗炎活性。

表 1 化合物4-13對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO抑制的IC50值Table 1 IC50 values of compounds 4-13 on NO production in LPS-induced RAW264.7 macrophage cells

3 討論與結(jié)論

作為我國西南喀斯特地帶民間常用的珍貴藥材之一，巖黃連在治療急性黃疸型肝炎、肝硬化、肝癌等疾病方面具有良好的療效，非常值得深入研究與開發(fā)利用。巖黃連相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)，其化學(xué)成分與藥理學(xué)的系統(tǒng)研究是基礎(chǔ)。本研究從巖黃連95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位中分離出13個化合物，包括9個生物堿類化合物(1-9)、3個酯類化合物(10、12、13)和1個黃酮(11)。其中，化合物3、4、8-13成分首次從巖黃連植物中分離得到，抗炎活性篩選的研究結(jié)果表明化合物4、9和化合物11對LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生炎癥介質(zhì)NO具有良好的抑制活性，優(yōu)于陽性對照吲哚美辛。

有研究表明，急性黃疸型肝炎往往會導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)，并且炎癥會與肝硬化、肝癌的發(fā)展密切相關(guān)，適當(dāng)干預(yù)炎癥有助于這些疾病的治療(Muratori & Longhi, 2013; Karthikeyan et al., 2018; Lee et al., 2021)。巖黃連中的單體化合物除表現(xiàn)出抗病毒、抗腫瘤等活性外，還表現(xiàn)出良好的抗炎活性，其可能亦通過對炎癥的干預(yù)發(fā)揮協(xié)同治療作用，這可能是其表現(xiàn)出良好療效的因素之一。本研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了巖黃連的化學(xué)成分，并發(fā)現(xiàn)了其中有效的抗炎化合物，為今后闡明巖黃連中的抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，以及為其進(jìn)一步深度研究與開發(fā)利用提供了科學(xué)理論依據(jù)。