張汝勝， 李 霞， 黃永林， 王亞鳳， 陽丙媛， 李典鵬， 何瑞杰*

( 1. 桂林理工大學 化學與生物工程學院， 廣西 桂林 541006； 2. 廣西植物功能物質(zhì)與資源持續(xù)利用重點實驗室，廣西壯族自治區(qū)中國科學院 廣西植物研究所， 廣西 桂林 541006 )

廣西地不容(Stephaniakwangsiensis)屬于防己科(Menispermaceae)千金藤屬(Stephania)多年生草質(zhì)落葉藤本植物，長超過3 m，塊根通常扁球形，葉互生、紙質(zhì)，葉柄于葉基部1～1.5 cm處盾狀著生、長4～9 cm，葉片三角狀圓形至近圓形，主產(chǎn)于我國廣西西北部至西南部，生于石灰?guī)r地區(qū)的山地灌叢(中國科學院中國植物志委員會，1996)。防己科植物大多含有豐富的生物堿，具有較高的藥用價值。廣西地不容藥用部位(塊根)含有豐富的生物堿，具有很好的生物活性，如鎮(zhèn)痛和抗炎作用(羅昱瀾等，2017)、抑菌活性(鄧業(yè)成等，2006)、殺蟲活性(鄧業(yè)成和徐漢虹，2005)、抗病毒活性(郝靜等，2008)。在臨床上主要用于鎮(zhèn)痛、解熱(王憲楷和趙同芳，1990)、鎮(zhèn)靜(金國章，1987)等。廣西地不容作為廣西地方特色藥用植物，其非藥用部位(莖、葉)的資源存量巨大，而對于野生資源日益匱乏的今天，從非藥用部位中尋找可替代藥用部位中一些有效成分的研究顯得尤其重要。

廣西地不容植物富含生物堿，由于該類成分在分離純化過程中極易被柱材料吸附，從而導(dǎo)致拖尾嚴重、收率低，因此生物堿的分離一直是天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域的一個熱點和難點問題。本研究以廣西地不容非藥用部位(莖、葉)為對象，依托現(xiàn)代先進的儀器設(shè)備，采用Sephadex LH-20、堿化硅膠、聚酰胺、MCI gel CHP-20P等多種柱色譜法和現(xiàn)代波譜學技術(shù)以及現(xiàn)代藥理學技術(shù)，擬探討以下問題：(1)廣西地不容非藥用部位甲醇提取物中的化學成分；(2)所分離得到的部分化合物的抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

植物材料：廣西地不容地上部分于2019年8月采自廣西桂林恭城瑤族自治縣，經(jīng)廣西植物研究所黃俞淞副研究員鑒定為廣西地不容(Stephaniakwangsiensis)的非藥用部位，標本(編號：20190824)保存于廣西植物功能物質(zhì)與資源持續(xù)利用重點實驗室。

供試菌種：所用菌種為大腸桿菌(Escherichiacoli)、金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)，均由桂林理工大學化學與生物工程學院李海云老師課題組提供。

儀器：LC-MS/IF-TOF液質(zhì)聯(lián)用色譜儀(日本，島津公司)、Brucker Avance Ш HD-500 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀(瑞士，Brucker公司)、OSB-2100油浴鍋、真空泵(上海愛朗儀器有限公司)、HH·BII·360-S-II恒溫培養(yǎng)箱 (上海躍進醫(yī)療器械廠)、SW-CJ-1F超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)、TQZ-312振蕩器(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)、YXQ-LS-50SII高壓滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

材料與試劑：Sephadex LH-20(GE Healthcare Bio-Science AB，Sweden)、MCI gel CHP-20P(75 ～ 150 μm；Mitsubishi Chemical, Tokyo, 日本)、硅膠(200 ～ 300目，青島海洋化工有限公司)、聚酰胺(100 ～ 200目，江蘇長豐化工有限公司)、TLC薄層色譜板(德國Merck公司)、LB營養(yǎng)瓊脂(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)、LB肉湯(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)、氨芐青霉素(上海源葉生物科技有限公司)、99%生物技術(shù)級二甲基亞砜(DMSO，上海麥克林生化科技有限公司)、提取與分離所使用的試劑皆為實驗室常用分析純。

1.2 提取和分離

取干燥廣西地不容地上部分4.2 kg，粉碎后用甲醇室溫浸提3次，每次30 L，每次1周，合并過濾提取液，減壓濃縮后得到浸膏480.1 g。浸膏加蒸餾水使其混懸后依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，減壓回收萃取溶劑，得石油醚萃取物44.0 g、乙酸乙酯萃取物33.4 g、正丁醇萃取物80.0 g。取正丁醇萃取物75.0 g上MCI柱層析(7 cm × 80 cm)，用甲醇-水(0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)進行梯度洗脫，經(jīng)TLC薄層層析檢測后合并得到12個餾分，即Fr.1～Fr.12。將Fr.1(26.3 g)進行Sephadex LH-20柱色譜(甲醇-水，0% ～ 100%，每20%為1個梯度)分離純化，得到5個餾分，即Fr.1-1～Fr.1-5。將Fr.1-1(16.8 g)進行反復(fù)Sephadex LH-20柱層析(20%甲醇-水)得到化合物4(8.7 g)。將Fr.2 (3.6 g)用二氯甲烷∶甲醇∶水體系(36∶1∶0.1，18∶1∶0.1，9∶1∶0.1，V/V/V)進行硅膠柱層析，得到6個餾分，即Fr.2-1～Fr.2-6。將Fr.2-2(1.2 g)用二氯甲烷∶甲醇體系(100∶0～50∶50，V/V)進行聚酰胺柱層析，得到9個餾分，即Fr.2-2-1～Fr.2-2-9。將Fr.2-2-1(0.2 g)用二氯甲烷∶甲醇(1∶1，V/V)進行Sephadex LH-20柱色譜分離純化得到化合物1(12.0 mg)、2(3.0 mg)、3(6.1 mg)、8(5.3 mg)。將Fr.3 (8.4 g)用二氯甲烷∶甲醇體系(1∶1，V/V)進行反復(fù)Sephadex LH-20柱色譜分離，得到6個餾分，即Fr.3-1～Fr.3-6。將Fr.3-3 (1.5 g )用二氯甲烷∶甲醇∶水體系(18∶1∶0.1，9∶1∶0.1，8∶2∶0.2，V/V/V)進行反復(fù)硅膠柱層析等色譜技術(shù)分離純化，最終得到化合物5(4.5 mg)、6(5.1 mg)、7(6.3 mg)、9(11.0 mg)、10(3.3 mg)。化合物1-10的化學結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖 1 化合物1-10的化學結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of compounds 1-10

2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物6C20H24NO4，黑色油狀。HR-ESI-MSm/z：343.175 8 [M+H]+。1H-NMR (500 MHz, MeOD)δ：6.78 (1H, d,J= 7.9 Hz, H-9), 6.66 (1H, d,J= 7.9 Hz, H-8), 6.37 (1H,s, H-3), 4.09 (1H, d,J= 13.8 Hz, H-15), 3.60 (3H, s, 10-OCH3), 3.53 (1H, br d,J= 12.4 Hz, H-1), 3.71 (3H, s, 2-OCH3), 3.35 (3H, s, N-CH3), 2.90 (3H, s, N-CH3), 2.72 (1H, m, H-4), 2.60 (2H, br t,J= 12.9 Hz, H-7)。13C-NMR (125 MHz, MeOD)δ：148.0 (C-1), 152.4 (C-2), 122.5 (C-3a), 110.1 (C-3), 24.7 (C-4), 62.4 (C-5), 126.3 (C-7a), 31.7 (C-7), 118.4 (C-8), 111.2 (C-9), 151.2 (C-10), 147.6 (C-11), 122.8 (C-12), 118.0 (C-13), 121.3 (C-14), 71.0 (C-15), 56.5 (-OCH3), 54.0 (N-CH3), 56.3 (-OCH3), 43.6 (N-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(李海濱，2006；王建忠等，2013)報道一致，故鑒定化合物6為magnoflorine。

化合物9C20H23NO4，黑色油狀。HR-ESI-MSm/z：342.168 5 [M+H]+。1H-NMR (500 MHz, MeOD)δ：7.15 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-9), 7.02 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-8), 6.81 (1H, s, H-3), 2.58 (3H, s, H-17), 3.68 (3H, s, 2-OCH3), 3.91 (3H, s, 10-OCH3), 3.86 (3H, s, 11-OCH3)。13C-NMR (125 MHz, MeOD)δ：143.2 (C-1), 150.5 (C-2), 113.5 (C-3), 29.28 (C-4), 62.3 (C-5), 64.3 (C-6), 35.9 (C-7), 125.6 (C-8), 112.8 (C-9), 153.5 (C-10),145.5 (C-11), 127.0 (C-12), 119.3 (C-13), 120.6 (C-14), 131.2 (C-15), 128.8 (C-16), 43.9(C-17), 53.8 (2-OCH3), 56.3 (11-OCH3), 56.6 (10-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(鄧業(yè)成和徐漢虹，2004)報道一致，故鑒定化合物9為紫堇定堿。

化合物10C20H19NO4，黃色針晶。HR-ESI-MSm/z：338.137 2 [M+H]+。1H-NMR (500 MHz, MeOD)δ：7.99 (1H, d,J= 8.6 Hz, H-11), 7.06 (1H, d,J= 8.6 Hz, H-10), 6.71 (1H, s, H-3), 6.25 (1H, d,J= 1.5 Hz, -OCH2O-), 6.10 (1H, d,J= 1.5 Hz, -OCH2O-), 4.09 (3H, s, 8-OCH3), 4.00 (3H, s, 9-OCH3), 2.77 (3H, s, N-CH3)。13C-NMR (125 MHz, MeOD)δ：142.2 (C-1), 123.2 (C-1a), 146.7 (C-2), 107.0 (C-3), 126.7 (C-3a), 29.35 (C-4), 53.8 (C-5), 44.2 (C-6), 62.0 (C-6a), 27.0 (C-7), 116.7 (C-7a), 152.2 (C-8), 146.0 (C-9), 110.4 (C-10), 124.8 (C-11), 130 (C-11a), 100.7 (-OCH2O-), 55.9 (8-OCH3), 60.8 (9-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(彭樹林等，1992)報道一致，故鑒定化合物10為克班寧。

3 體外抗菌活性研究

3.1 培養(yǎng)基配置

固體培養(yǎng)基的配置：稱取LB營養(yǎng)瓊脂8 g使其完全溶解于200 mL蒸餾水中，于121 ℃高溫下滅菌20 min，備用。

液體培養(yǎng)基的配置：稱取LB肉湯5 g 于200 mL蒸餾水中使其完全溶解，于121 ℃高溫下滅菌20 min，備用。

3.2 體外抗菌實驗

采用濾紙片法測定其抑菌圈的大小。以DMSO為溶劑，準確稱取各個化合物，將其配置成6 mg·mL-1的樣品溶液，測定各個化合物對各種菌的抑制效果。參照胡野(2004)的方法，具體的實驗步驟如下：(1)將實驗所用到的濾紙片、鑷子、培養(yǎng)皿、三角刮刀、移液槍頭等用品用干凈的報紙包好后放入高溫滅菌鍋中，在121 ℃下高溫殺菌20 min，備用；(2)菌種接種，將指示菌種采用劃線法接種于制備好的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在(36±1)℃的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24 h后放入冰箱內(nèi)保存，備用；(3)菌懸液的配制，在相應(yīng)的瓊脂斜面培養(yǎng)基上用接種環(huán)在培養(yǎng)好的菌種內(nèi)取1環(huán)菌種放入對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，在(37±1)℃下進行恒溫震蕩24 h后，取100 μL培養(yǎng)好的菌懸液，用無菌水稀釋300倍，使菌懸液稀釋到106～108CFU·mL-1，并置于4 ℃下冷藏，備用；(4)樣品溶液的配置，將準備好的0.6 cm大小的濾紙片經(jīng)過高溫滅菌后，浸泡在配好濃度的樣品溶液以及空白對照溶液中1 h左右；(5)抑菌圈的測定，在無菌操作臺中用移液槍吸取200 μL菌懸液于平板固體培養(yǎng)基上，先使用三角刮刀在培養(yǎng)基上均勻涂抹，再放在直徑為0.6 cm完全浸滿樣品的濾紙片上，在(36±1)℃下培養(yǎng)24 h，最后測定其抑菌圈直徑。實驗平行3次，用DMSO作為陰性對照，用氨芐青霉素(AMP，100 mg·mL-1，即稱取100 mg氨芐青霉素溶解于1 mL 1 mol·L-1HCl中)作為陽性對照。

3.3 結(jié)果和分析

分別用大腸桿菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、尖孢鐮刀菌作為供試菌，將從廣西地不容非藥用部位中分離得到的化合物通過濾紙片法測定其抑菌圈的直徑，測定結(jié)果如表1所示。表1結(jié)果顯示，與陽性對照AMP比較，化合物1、2、5對大腸桿菌的抑制作用顯著降低(P<0.05)，化合物2對金色葡萄球菌的抑制率極顯著低于陽性對照AMP的抑制率(P<0.01)，化合物3和化合物8對枯草芽孢桿菌有弱的抑制作用，但無顯著性差異(P>0.05)。

表 1 廣西地不容非藥用部位化學成分的抑菌活性Table 1 Antimicrobial activities of chemical constituents from non-medicinal parts of Stephania kwangsiensis

4 討論與結(jié)論

本研究從廣西地不容非藥用部位醇提物中分離鑒定出4個阿樸啡生物堿。其中，異紫堇定堿(3)是“解痙寧”的主要成分，并具有很好的止瀉功效，這與沈雅琴和張明發(fā)(1998)的研究結(jié)果一致， 在臨床上主要用于治療胃腸、 膽、 血管等痙攣所致的疼痛；Magnoflorine(6)具有使心血管系統(tǒng)處于高動力狀態(tài)的效用，有利于運動員較長時間維持高強度運動能力，有抗疲勞功效，這與呂瑩等(2001)的研究結(jié)果一致；克班寧(10)具有抗心律失常的作用，這與淤澤溥等(1992)的研究結(jié)果一致，可誘導(dǎo)人類癌細胞的G1阻滯和凋亡作用(Wongsirisirt et al., 2012)，以及通過抑制MAPKs和Akt信號通路表現(xiàn)出抗炎活性(Intayoung et al., 2016)。鄧業(yè)成等(2006)研究發(fā)現(xiàn)，廣西地不容藥用部位(塊根)的提取物具有廣譜抗菌作用，而由于本研究從廣西地不容非藥用部位中所分離得到的化合物在濃度為6 mg·mL-1時對實驗所選用的菌種均顯示較弱的抑制作用，因此對于非藥用部位是否存在較強的抗菌成分還有待進一步研究。廣西地不容植物富含生物堿，使用普通柱層析分離會因不可逆吸附產(chǎn)生而導(dǎo)致樣品損失量大，本研究使用了氨蒸汽堿化硅膠柱材料，極大地改善了不可逆吸附的產(chǎn)生，提高了分離效率，這與劉吉華等(2013)的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果為廣西地不容植物其他部位以及其他生物堿的分離提供了方法指導(dǎo)。同時，廣西地不容的非藥用部位(莖、葉)作為中藥“金不換”的一個副產(chǎn)物，由于其蘊含多種生物堿成分，如異紫堇定堿、magnoflorine、克班寧已在臨床中被廣泛使用，因此該部分資源開發(fā)潛力巨大，隨著更多化學成分被發(fā)現(xiàn)以及其藥理研究的深入，該部位有作為新藥源的可能。