徐碧林， 羅周瑜， 彭陳萬(wàn)里， 武 卉， 張子燁， 鄭 玥， 鄭永良

( 黃岡師范學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)資源學(xué)院， 經(jīng)濟(jì)林種質(zhì)資源改良與綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北省大別山特色資源開(kāi)發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心， 湖北 黃岡 438000 )

植物內(nèi)生菌是指生活史中某一階段或整個(gè)階段定殖在植物各組織器官或細(xì)胞間隙內(nèi)的一類對(duì)植物自身不引起明顯病害癥狀的微生物，包括內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌等(Matsumoto et al., 2017; Uzma et al., 2018)。對(duì)內(nèi)生菌與宿主植物的相互影響研究表明，它們對(duì)植物本身具有促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)抗逆性、生物防治和生物修復(fù)等有益的生物學(xué)功能(Giauque et al., 2019; De Lamo et al., 2020; El-Sayed et al., 2020; He et al., 2020)。不僅如此，藥用植物內(nèi)生菌還會(huì)獲得與宿主相同的部分代謝途徑，從而合成與宿主相同或相似的、具有潛在的抗菌、抗蟲(chóng)、抗癌、抗病毒、抗氧化、免疫制劑、降糖等生物活性的次生代謝產(chǎn)物(Gouda et al., 2016; 黃敬瑜等, 2017; Nongkhlaw et al., 2017)。因此，充分發(fā)掘藥用植物內(nèi)生菌具有廣闊的應(yīng)用前景。

艾草(Artemisiaargyi)隸屬于菊科(Compositae)艾屬(Artemisia)，是一種功能性藥用植物(Song et al., 2019)。蘄艾為湖北省蘄春縣特產(chǎn)，中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品，湖北省道地藥材，具有護(hù)肝、抗腫瘤、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗炎等多種藥理作用(洪宗國(guó), 2015; Dong et al., 2018)。明代醫(yī)圣李時(shí)珍在《本草綱目》中就有對(duì)蘄艾的推崇：“(艾葉)自成化以來(lái)，則以蘄州者為勝，用充方物，天下重之”，謂之“蘄艾”(Artemisiaargyivar.argyi‘Qiai’)。肖宇碩等(2018)對(duì)蘄艾及不同產(chǎn)地艾葉揮發(fā)油進(jìn)行了一系列的比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地艾葉揮發(fā)性成分有一定差異，其中蘄艾品質(zhì)最好。此外，Xiang等(2018)的研究還發(fā)現(xiàn)蘄艾揮發(fā)油具有較好的抑菌和殺菌活性。

近年來(lái)，關(guān)于蘄艾的種植、提取液、化學(xué)組分、藥理作用及艾灸和艾貼等產(chǎn)品開(kāi)發(fā)研究得較多，對(duì)蘄艾內(nèi)生菌的研究報(bào)道較少。Shi等(2017)從蘄艾艾葉中分離得到內(nèi)生真菌TrichodermakoningiopsisQA-3，并從其發(fā)酵液中成功分離鑒定出具有抗菌活性的5種新型真菌多酮類化合物和2種已知的酮類類似物。目前還尚未見(jiàn)對(duì)蘄艾內(nèi)生細(xì)菌的相關(guān)報(bào)道。本研究分別從蘄艾的根、莖和葉中分離內(nèi)生細(xì)菌，從微生物的分離、形態(tài)、生理生化特征、分子生物學(xué)鑒定和發(fā)酵液抑菌活性入手，探討蘄艾內(nèi)生細(xì)菌對(duì)常見(jiàn)的人類病原菌的抗菌作用及其產(chǎn)酶特性，旨為探尋有效拮抗微生物資源以及蘄艾的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)，為充分利用內(nèi)生菌資源生產(chǎn)工業(yè)用酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品蘄艾(Artemisiaargyivar.argyi‘Qiai’)：采自湖北省黃岡市蘄春縣赤東鎮(zhèn)三渡村五組大田種植，樣品采集后用自封袋密封后馬上回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離。

供試菌株：大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、變形桿菌(Proteusbacillusvulgaris) 和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)均保存于黃岡師范學(xué)院經(jīng)濟(jì)林種質(zhì)資源改良與綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

培養(yǎng)基：LB固體及液體培養(yǎng)基(1 L)(蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，pH 7.0，固體加瓊脂粉18 g)用于蘄艾不同組織內(nèi)生細(xì)菌的分離擴(kuò)繁。淀粉培養(yǎng)基(1 L)(牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，可溶性淀粉2 g，pH 7.0～7.2，瓊脂18 g)、牛奶培養(yǎng)基(LB固體培養(yǎng)基中加入11%滅菌的脫脂奶粉)、剛果紅培養(yǎng)基(1 L)(羧甲基纖維素鈉15 g，蛋白胨5 g，KH2PO42.0 g，MgSO40.2 g，NaCl 5 g，瓊脂18 g，剛果紅0.2 g，pH 7.0)和油脂培養(yǎng)基(LB固體培養(yǎng)基加入1%吐溫80)分別用來(lái)篩選產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶的內(nèi)生細(xì)菌。蛋白胨水培養(yǎng)基(1 L)(蛋白胨10 g，NaCl 15 g，pH 7.3～7.5)、蔗糖/葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)液[蛋白胨水培養(yǎng)基1 L，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1.5 mL，20%蔗糖溶液(蔗糖發(fā)酵)，20%葡萄糖溶液(葡萄糖發(fā)酵)]、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液(1 L) (葡萄糖5 g，蛋白胨5 g，K2HPO42 g，pH 7.2～7.4)、明膠液化培養(yǎng)基(1 L) (蛋白胨5 g，明膠100～150 g，pH 7.2～7.4)和檸檬酸鹽培養(yǎng)基(1 L) [檸檬酸鈉2 g，K2HPO41 g，NH4H2PO41 g，NaCl 5 g，MgSO40.2 g，瓊脂18 g，1%溴麝香草酚藍(lán)(酒精溶液)10 mL，pH 6.8]分別用來(lái)進(jìn)行吲哚試驗(yàn)、蔗糖/葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(VP試驗(yàn))/甲基紅試驗(yàn)(MR試驗(yàn))、明膠水解試驗(yàn)和檸檬酸鹽試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離純化 參照專利“一種艾草內(nèi)生菌的分離方法”分離蘄艾根、莖和葉的內(nèi)生細(xì)菌(徐碧林等, 2019)。取健康、無(wú)病害的艾葉、莖和根各約5 g，用自來(lái)水沖洗干凈后，用濾紙吸干表面水分，剪成小片(葉片)/段(莖和根)放入滅菌平皿中，用無(wú)菌水洗滌3次并吸干。用75%乙醇浸泡葉片30 s，莖段和根60 s。無(wú)菌水浸泡沖洗5次并吸干，用2.5%次氯酸鈉溶液浸泡葉片2 min，5%次氯酸鈉溶液浸泡莖段和根3 min，無(wú)菌水浸泡2 min，循環(huán)3次，用無(wú)菌濾紙吸干殘留的水分。吸取最后一次漂洗的無(wú)菌水200 μL涂布于LB培養(yǎng)基平板，驗(yàn)證消毒效果。

將消毒好的組織樣品放入無(wú)菌研缽中，向其內(nèi)加入9 mL無(wú)菌生理鹽水和無(wú)菌石英砂，研磨至成勻漿狀，100倍梯度稀釋，取200 μL的適當(dāng)梯度稀釋液至LB固體培養(yǎng)平板上，均勻涂布，分別置于28 ℃和37 ℃培養(yǎng)。挑選菌落形態(tài)不同的單菌落純化，并將形態(tài)大部分相似的菌落劃歸為同一類，保存菌株備用。

1.2.2 生理生化特征測(cè)定 參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》(周德慶和徐德強(qiáng), 2013)，采用平板劃線法分離得到內(nèi)生細(xì)菌單菌落，記錄菌落的顏色、形態(tài)、透明度等，并在顯微鏡下觀察其形態(tài)特征及革蘭氏染色反應(yīng)。參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠和蔡妙英, 2001)測(cè)定篩選菌株的生理生化反應(yīng)。此外，挑取活化后的內(nèi)生細(xì)菌，分別在含淀粉培養(yǎng)基平板、牛奶培養(yǎng)基平板、剛果紅培養(yǎng)基平板和油脂培養(yǎng)基平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)1～2 d后，在淀粉培養(yǎng)基平板上平鋪一層盧戈氏碘液，其余平板不做處理，分別觀察淀粉平板、牛奶平板和剛果紅平板上菌落周圍的透明水解圈，以及吐溫80平板上的白色暈圈，測(cè)量并計(jì)算透明水解圈和白色暈圈與菌落直徑的比值。

1.2.3 16S rDNA分子生物學(xué)鑒定 提取篩選菌株的染色體總DNA，以菌株的總DNA為模板，利用通用引物對(duì)27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′擴(kuò)增菌株16s rDNA基因。25 μL的反應(yīng)體系：模板1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL，Taq DNA聚合酶Mix12.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上電泳，根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明回收DNA片段，回收后的片段委托上海生工生物工程有限公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，將序列在EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/resources/16s_download)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)(Yoon et al., 2017)，采用MEGA 7.0中的 CLUSTAL_W模塊將菌株的16s rDNA序列與其同源關(guān)系相近的序列比對(duì)分析后，把兩頭的序列剪切整齊，轉(zhuǎn)換格式后，用MEGA 7.0中的Neighbor-Joining模塊構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，1 000次隨機(jī)抽樣，計(jì)算自引導(dǎo)值(Bootstrap)以評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的置信度(Kumar et al., 2016)。

1.2.4 篩選菌株發(fā)酵液揮發(fā)物抑菌試驗(yàn) 初篩：將篩選菌株活化并進(jìn)行平板劃線，挑單菌落于37 ℃液體培養(yǎng)12 h，按1%的接種量接種至100 mLLB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r·min-1，發(fā)酵5 d。超聲破細(xì)胞，按發(fā)酵液：乙酸乙酯1∶1(V/V)的比例沿著器皿內(nèi)壁緩慢加入(防止乳化)乙酸乙酯，超聲萃取3次，合并3次得到的萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35 ℃減壓條件下濃縮乙酸乙酯相，定容至500 μL，4 ℃保存?zhèn)溆??；罨袠?biāo)菌后，挑單菌落，在LB培養(yǎng)基平板上縱橫交叉密集劃線。在密集劃線的平板上等距貼直徑為6 mm的滅菌雙層濾紙片，每一個(gè)濾紙片上滴加8 μL內(nèi)生細(xì)菌揮發(fā)油，每一種內(nèi)生細(xì)菌揮發(fā)油做3組平行試驗(yàn)，并以等體積0.3 mg·mL-1的卡那霉素作為陽(yáng)性對(duì)照(+)，等體積乙酸乙酯作為陰性對(duì)照(-)。將處理好的平板置于4 ℃擴(kuò)散1 d，37 ℃培養(yǎng)1 d后，測(cè)量并計(jì)算平均抑菌圈直徑Φ。

復(fù)篩：采用Silva描述的方法對(duì)篩選菌株發(fā)酵液揮發(fā)物的最低抑菌濃度(MICs)和最低殺菌濃度(MBCs)進(jìn)行了測(cè)定(Silva et al., 2011)。用LB培養(yǎng)基對(duì)具有顯著抑菌效果的菌株發(fā)酵液揮發(fā)物進(jìn)行2倍梯度稀釋(1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0、256.0、512.0 μg·mL-1)，用于測(cè)定它們最低抑菌濃度。在稀釋后的培養(yǎng)液中分別加入50 μL約107CFU·mL-1的對(duì)應(yīng)菌液，將3組接種后的菌液置于37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)后完全抑制菌株生長(zhǎng)的揮發(fā)物的最低濃度即為MICs。MICs實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從每一個(gè)濃度梯度的試管中取200 μL培養(yǎng)物分別涂在LB平板上，無(wú)微生物生長(zhǎng)的平板上相應(yīng)濃度被確定為MBCs。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘄艾內(nèi)生細(xì)菌的分離結(jié)果

最后一次清洗試驗(yàn)材料的無(wú)菌水涂布LB平板，置于37 ℃培養(yǎng)1周沒(méi)有微生物生長(zhǎng)，說(shuō)明試驗(yàn)材料表面消毒徹底，分離到的細(xì)菌均為蘄艾內(nèi)部所有，而非外界環(huán)境污染所致。本試驗(yàn)一共從蘄艾的根、莖和葉中分別分離到6、7、7株內(nèi)生細(xì)菌。

2.2 篩選菌株總DNA的提取和16s rDNA擴(kuò)增結(jié)果

篩選菌株基因組DNA提取結(jié)果見(jiàn)圖1：A，基因組DNA在電泳圖上的23 130 bp附近一條明顯的條帶，可以用于PCR 擴(kuò)增。以基因組DNA為模板，以及通用引物對(duì)27F/1492R，擴(kuò)增得到了特異性長(zhǎng)度約為1 500 bp的目的條帶(圖1：B)。

A. 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳； B. 16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖。A. Agarose gel electrophoresis of genomic DNA; B. Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA amplification products.圖 1 內(nèi)生細(xì)菌基因組DNA和16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of endophytic bacterial genomic DNA and 16S rDNA amplification products

2.3 篩選菌株系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

對(duì)20株內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于葉和莖的內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列同源性為100%，表明它們共有相同的內(nèi)生細(xì)菌。將來(lái)源于莖和根的13株內(nèi)生細(xì)菌的基因序列提交到EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ezbiocloud.net/resources/16s_download)中進(jìn)行同源性比對(duì)，查找與其同源性大于99%的菌株，最終確定蘄艾不同組織中的內(nèi)生細(xì)菌歸屬。如表1和圖2所示，來(lái)源于蘄艾莖和葉中共有內(nèi)生細(xì)菌含有6屬7種，分別為芽孢桿菌屬(Bacillus)2株、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)1株、假單胞菌屬(Pseudomonas)1株、短小桿菌屬(Curtobacterium)1株、黃體桿菌屬(Luteibacter)1株和類節(jié)桿菌屬(Paenarthrobacter)1株；來(lái)源于蘄艾根的內(nèi)生細(xì)菌含有3屬6種，分別為芽孢桿菌屬(Bacillus)4株、腸桿菌屬(Enterobacter)1株和干燥桿菌屬(Siccibacter)1株。蘄艾的內(nèi)生細(xì)菌在莖和葉中的組成幾乎相同，葉和莖與根中的內(nèi)生細(xì)菌種類只共有1個(gè)屬，其余都不共有。

表 1 蘄艾不同組織內(nèi)生細(xì)菌比較Table 1 Comparison of endophytic bacteria in different tissues of Artemisia argyi

分支點(diǎn)上的數(shù)值為1 000 次自展值分析所得值，標(biāo)尺0.020為進(jìn)化距離。Numbers at the nodes indicate the level of bootstrap values based on 1 000 replications, bar is 20 nt substitutions per 1 000 nt.圖 2 基于16S rDNA序列的蘄艾內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of endophytic bacteria from Artemisia argyi based on 16S rDNA sequences

2.4 篩選菌株的生理生化特征

對(duì)分離獲得的13株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了葡萄糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、VP試驗(yàn)和產(chǎn)酶等生理生化特征檢測(cè)(表2)，部分菌株產(chǎn)酶結(jié)果見(jiàn)圖3，從圖3:A-C中可以看出，lzy-17、lzy-20和lzy-21均能在剛果紅培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生不同大小的水解圈，表明它們均能分泌纖維素酶，其中l(wèi)zy-21產(chǎn)纖維素酶能力最強(qiáng)，水解圈與菌落直徑比約為6.0；從圖3：D-G中可以看出，lzy-1、lzy-9、lzy-12和lzy-20均能在牛奶平板上產(chǎn)生不同大小的透明水解圈，表明它們均能分泌蛋白酶，其中l(wèi)zy-1和lzy-20產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)，水解圈與菌落直徑比約為4.0；從圖3：H中可以看出，lzy-1能在含吐溫80平板上產(chǎn)生與菌落直徑比約為3.5的白色暈圈， 表明其能分泌脂肪酶。從圖3：I中可以看出，lzy-12能在含淀粉平板上產(chǎn)生與菌落直徑比約為2.5的透明水解圈，表明其能分泌淀粉酶。

A-C. lzy-17、lzy-20和lzy-21在纖維素剛果紅培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生透明水解圈情況； D-G. lzy-1、lzy-9、lzy-12和lzy-20在牛奶平板上產(chǎn)生透明水解圈情況； H. lzy-1在含1%吐溫80的平板上產(chǎn)生白色暈圈情況； I. lzy-12在淀粉培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明水解圈情況。A-C. Hydrolytic circles produced on the cellulose Congo red medium plate by lzy-17, lzy-20 and lzy-21; D-G. Hydrolytic circles produced on the milk plate by lzy-1, lzy-9, lzy-12 and lzy-20; H. White halocircles produced on the plate containing 1% Tween 80 by lzy-1; I. Hydrolytic circles produced on the starch medium plate by lzy-12.圖 3 內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)酶情況檢測(cè)Fig. 3 Hydrolysis of different substrates by endophytic bacteria

2.5 篩選菌株發(fā)酵液揮發(fā)物的抑菌效果

以常見(jiàn)的6種病原菌作為靶標(biāo)菌，采用濾紙片擴(kuò)散法對(duì)篩選菌株發(fā)酵液揮發(fā)物抑菌活性進(jìn)行初篩，結(jié)果見(jiàn)表3，除了lzy-9，其余12株細(xì)菌揮發(fā)物具有不同程度的抑菌活性，占分離菌株的92.3%。對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、枯草芽孢桿菌、變形桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌具有抑菌作用的菌株分別有8、5、8、7、5、3株，其中，lzy-20對(duì)大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌和枯草芽孢桿菌都具有相對(duì)較好的抑菌活性，wnn4-3對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和變形桿菌均具有相對(duì)較好抑菌活性，lzy-12對(duì)金黃色葡萄球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌均具有較好的抑菌活性，lzy-17和lzy-21都對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌均具有較好的抑菌活性。

對(duì)具有抑菌效果的菌株發(fā)酵液揮發(fā)物的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表4所示，其中l(wèi)zy-20對(duì)大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌和枯草芽孢桿菌的MICs均為16 μg·mL-1，對(duì)三者的MBCs依次為32、32 μg·mL-1和16 μg·mL-1。wnn4-3對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和變形桿菌均的MICs均為16 μg·mL-1，對(duì)三者的MBCs依次為16、32 μg·mL-1和32 μg·mL-1。lzy-12對(duì)金黃色葡萄球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的MICs均為16 μg·mL-1，對(duì)二者的MBCs分別為32 μg·mL-1和16 μg·mL-1。lzy-17和lzy-21都對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的MICs均為16 μg·mL-1，二者對(duì)其MBCs分別為16 μg·mL-1和32 μg·mL-1。

表 3 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液揮發(fā)物抑菌效果Table 3 Bacteriostatic effect of endogenous bacterial volatile oil

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)從蘄艾莖、葉和根中分別分離得到7、7株和6株內(nèi)生細(xì)菌，16S rDNA全序列的系統(tǒng)發(fā)育分析及生理生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，來(lái)源于蘄艾莖和葉中的共有內(nèi)生細(xì)菌含有6屬7種，來(lái)源于蘄艾根的內(nèi)生細(xì)菌與來(lái)源于莖和葉的內(nèi)生細(xì)菌共有1個(gè)屬。上述結(jié)果表明，蘄艾內(nèi)生細(xì)菌在地上和地下組織中的組成不同，不同的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)蘄艾的組織具有差異性和專一性。

我們分離得到的13種內(nèi)生細(xì)菌中，皮提不動(dòng)桿菌和與其親緣關(guān)系較近的鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)、診所不動(dòng)桿菌(A.nosocomialis)組成的Acb復(fù)合體是重要的院內(nèi)感染病原體，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的皮提不動(dòng)桿菌被鑒定為多重耐藥菌株(Wang et al., 2020)。根據(jù)巴斯德研究所MLST數(shù)據(jù)庫(kù)的最新數(shù)據(jù)，皮提不動(dòng)桿菌的來(lái)源有人類、兔子、白鸛、火雞和魚(yú)類，其中人類是皮提不動(dòng)桿菌及其許多變種的主要宿主，魚(yú)類可能是其新興宿主(Li et al., 2017; Wang et al., 2020)， 目前還未見(jiàn)植物源的皮提不動(dòng)桿菌報(bào)道，本研究分離得到皮提不動(dòng)桿菌lzy-1系首次從植物中分離到皮提不動(dòng)桿菌。耐冷假單胞菌(Pseudomonaspsychrotolerans)的部分菌株在一定條件下可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)(Liu et al., 2017; Kang et al., 2020)。藤黃短小桿菌(Curtobacteriumluteum)的菌株具有抗病原菌的作用(Suhandono et al. 2016)，且與甲霜靈同時(shí)處理黑胡椒能大幅減少線蟲(chóng)感染，還能促進(jìn)黑胡椒的生長(zhǎng)并提高其產(chǎn)量(Bhai et al., 2017)。該結(jié)果表明，本研究分離得到的耐冷假單胞菌lzy-2和藤黃短小桿菌lzy-9可能具有潛在的促生和生防價(jià)值。自2010年以來(lái)， 對(duì)松尼索利黃體桿菌屬的報(bào)道較少， Akter和Hou(2018)從紅松根際土壤分離到一株能降解酪蛋白的松尼索利黃體桿菌MAH-14，Baltrus等(2019)對(duì)該菌進(jìn)行了全基因組測(cè)序。本研究分離得到的松尼索利黃體桿菌lzy-12也具有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶能力，該類菌株可能參與宿主的代謝活動(dòng)。截至目前，對(duì)噬尼古丁類節(jié)桿菌的報(bào)道也比較少，Maeng等(2018)首次從韓國(guó)土壤中分離到耐輻射的噬尼古丁類節(jié)桿菌，其可能能提高作物對(duì)輻射的耐受性。據(jù)此，我們推測(cè)來(lái)源于蘄艾的內(nèi)生細(xì)菌噬尼古丁類節(jié)桿菌lzy-17也能提高其宿主的耐輻射能力。

表 4 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液揮發(fā)物MICs和MBCsTable 4 MICs and MBCs of endophytic bacteria fermentation broth volatiles

芽孢桿菌屬是內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群之一，高地芽孢桿菌的菌株是新型馬鈴薯赤霉病的潛在生物防治劑(Li et al., 2019)，可以減輕低磷和高鹽脅迫對(duì)小麥的損傷(Yue et al., 2019)，此外，它們不僅能促進(jìn)水稻生長(zhǎng)，還能提高抗旱能力(Kumaravel et al., 2018)。從狐尾藻中分離得到耐受高濃度錳離子的蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)WSE01不僅能促進(jìn)狐尾藻的生長(zhǎng)，還能增強(qiáng)其對(duì)錳離子的耐受性(Tang et al., 2020)。特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)的菌株不僅是防治番茄枯萎病最有效且環(huán)保的化學(xué)殺菌劑替代品，還能抑制稻瘟病菌及促進(jìn)大白菜幼苗的生長(zhǎng)(Li et al., 2018; Bhattacharya et al., 2019; Kang et al., 2019)。阿氏芽孢桿菌(B.aryabhattai)的菌株可以提高番茄對(duì)鹽的耐受性、提高海蓬子屬多枝檉柳種子的萌發(fā)率、促進(jìn)植物生長(zhǎng)并降解人工污染土壤中的磷胺(Figueira et al., 2019; Yoo et al., 2019; Dash et al., 2020)。除了單獨(dú)發(fā)揮作用，阿氏芽孢桿菌H26-2 和暹羅芽孢桿菌H30-3同時(shí)接種不僅可以促進(jìn)大白菜生長(zhǎng)，還能緩解高溫和干旱脅迫(Jeong et al., 2019)。來(lái)源于暹羅芽孢桿菌的菌株產(chǎn)生的揮發(fā)物可以在不需要生長(zhǎng)素或乙烯/茉莉酸的情況下促進(jìn)根的發(fā)育，從紫錐肉蓯蓉根中分離的暹羅芽孢桿菌CV5分泌的可輻射誘導(dǎo)的具有輻射防護(hù)作用的胞外多糖CV5，可以減少電離輻射產(chǎn)生的自由基損傷(Sihem et al., 2019)。Zhou等(2021)的研究表明，韓國(guó)芽孢桿菌181-22能促進(jìn)水稻生長(zhǎng)，緩解鎘脅迫。上述結(jié)果表明，本研究分離得到的高地芽孢桿菌lzy-4、蠟樣芽胞桿菌wnn1-2、特基拉芽孢桿菌wnn2-15、阿氏芽孢桿菌wnn2-22、暹羅芽孢桿菌wnn4-3和韓國(guó)芽孢桿菌lzy-21可能是潛在的生防或促生菌。

在水果粉、配方奶粉、香料和草藥中可檢測(cè)到蘇黎世干燥桿菌(Siccibacterturicensis)，它們和與食物相關(guān)的致病菌克洛諾斯桿菌屬(Cronobacter)成員有較近的親緣關(guān)系，2018年Lepuschitz等首次從奧地利口角炎患者的唇角分離到蘇黎世干燥桿菌，表明其具有致病性(Sarah et al., 2018)。本研究分離得到的蘇黎世干燥桿菌wnn1-3的生理功能還有待進(jìn)一步研究。Sutton等(2018)利用計(jì)算機(jī)對(duì)已經(jīng)測(cè)序的腸桿菌序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，羅根坎普氏腸桿菌(Enterobacterroggenkampii)是阿斯氏腸桿菌(E.asburiae)的同義詞，阿斯氏腸桿菌的菌株可以通過(guò)抑制鐵的吸收來(lái)降低玉米植株中鎘的毒性、具有殺線蟲(chóng)和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的活性，阿斯氏腸桿菌Vt-7揮發(fā)物對(duì)花生貯藏過(guò)程中產(chǎn)生的黃曲霉和黃曲霉毒素具有抗性(Mira et al., 2018; Sutton et al., 2018; Gong et al., 2019; Zhou et al., 2019)。該結(jié)果表明，本研究分離得到的羅根坎普氏腸桿菌wnn1-1可能具有生物防治功能。

本研究分離的菌株中，皮提不動(dòng)桿菌lzy-1系首次從植物中分離到皮提不動(dòng)桿菌，松尼索利黃體桿菌報(bào)道較少，已報(bào)道的與我們分離得到的其余11種內(nèi)生菌同屬的菌株分別擁有各自有益的生物學(xué)功能，體現(xiàn)在促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)抗逆性、生物防治、生物修復(fù)和具有良好的抗菌效果等方面。因此，我們猜測(cè)，從蘄艾中分離得到的這些內(nèi)生細(xì)菌，與蘄艾本身易于種植、植株高大、全草入藥及其良好抑菌效果之間有一定的關(guān)聯(lián)，可能是在長(zhǎng)期進(jìn)化中，內(nèi)生菌菌株促進(jìn)蘄艾生長(zhǎng)，增強(qiáng)其對(duì)環(huán)境的耐受性；同時(shí)，它們也獲得了蘄艾本身的部分特性，從而實(shí)現(xiàn)與宿主植物共同進(jìn)化。