劉 芳， 張遠芳， 李玲環(huán)， 彭忠祿， 王俊杰*

( 1. 湘南學(xué)院 藥學(xué)院， 湖南 郴州 423000； 2. 郴州市科技局， 湖南 郴州 423000 )

玄參科(Scrophulariaceae)婆婆納屬(VeronicaL.)植物約有250種，廣布全球，主產(chǎn)于亞歐大陸(Salehi et al., 2019)。目前，在我國發(fā)現(xiàn)的婆婆納屬植物有60余種，主要分布于西南地區(qū)，多數(shù)為傳統(tǒng)藥用植物，用于治療感冒、咳血、疝氣、止血活血、清熱解毒、生肌、祛風(fēng)利濕等多種疾病(Xue et al., 2019)。近年來，由于婆婆納屬植物顯著的傳統(tǒng)療效，因此國內(nèi)外學(xué)者對該屬植物的生物活性研究不斷增多，并發(fā)現(xiàn)其在抗氧化(Zivkovic et al.，2017)、抗病毒(Sharifi-Rad et al., 2018)、抗腫瘤(滕杰等，2008)、抗炎鎮(zhèn)痛(Kim et al., 2017)、保肝(Tan et al., 2017；Lu et al., 2021)、抑菌(Sharifi-Rad et al., 2018)等方面均有良好的活性。該屬植物在抗惡性腫瘤方面活性顯著，如阿拉伯婆婆納和常春藤婆婆納的甲醇提取物對口腔上皮癌細胞(KB細胞)和B16黑色素瘤細胞的生長均具有顯著的抑制作用(Harput et al., 2002)。盡管婆婆納屬植物具有成為抗癌藥物的優(yōu)質(zhì)潛能，但其活性基礎(chǔ)目前尚不清楚。

婆婆納(Veronicadidyma)為婆婆納屬植物中具代表性的傳統(tǒng)藥用植物之一，全草入藥，具有解毒消腫、涼血止血、理氣止痛等功效，用于治療癰腫、吐血、疝氣、睪丸炎、白帶等多種疾病，其物質(zhì)資源極為豐富，在我國各地均有分布(張仁波和竇全麗，2009)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，婆婆納醇提取物具有較好的抑制B16細胞增殖作用，其IC50=1.955 mg·mL-1，而文獻調(diào)研結(jié)果顯示，迄今為止未見對婆婆納植物化學(xué)成分的研究報道，并且活性基礎(chǔ)不明。因此，基于以上報道和本課題組前期研究基礎(chǔ)，為更好地利用婆婆納資源，本研究以闡明婆婆納抗黑色素瘤的活性部位及活性成分為目的，采用植物化學(xué)分離純化技術(shù)，以對B16和A375黑色素瘤細胞株生長的抑制作用為導(dǎo)向，擬探討以下問題：(1)婆婆納醇提取物抗黑色素瘤的活性部位；(2)婆婆納抗黑色素瘤活性部位的物質(zhì)基礎(chǔ)；(3)物質(zhì)基礎(chǔ)中單體化學(xué)成分的抗黑色素瘤活性評價。本研究結(jié)果可為合理開發(fā)利用婆婆納植物資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

所用材料于2020年4月采自湖南省郴州市蘇仙區(qū)，經(jīng)湘南學(xué)院藥用植物學(xué)教師劉鵬老師鑒定為玄參科婆婆納屬植物婆婆納(Veronicadidyma)的全草，標本(PPN202005CZ)保存于湘南學(xué)院的湖南省教育廳天然產(chǎn)物心腦血管重點實驗室。

核磁共振儀(德國Bruker AM-400 spectrometer、Bruker AM-500 spectrometer)，高效液相色譜儀(島津LC-20A系列)，制備色譜儀(島津Essentia Prep LC-16P系列)，多功能酶標儀(CytationTM3 )，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific，F(xiàn)orm 311)，生物安全柜(Thermo Fisher Scientific，MSC-Advantage 1.8)，葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20, Lipophilic Sephadex LH-20, Pharmacia)，預(yù)制硅膠板(青島海洋化工，GF254)，制備C18色譜柱 (YMC-Pack ODS-A, 250 mm × 20 mm, 5 μm, YMC Co., Ltd, Kyoto, Japan)，甲醇(色譜純，麥克林)，其他常規(guī)試劑(分析純，國藥集團)。小鼠黑色素瘤細胞株B16(武漢博士德)，人黑色素瘤細胞株A375(武漢博士德)，CCK8試劑盒(上海生工)，DMSO(Biosharp)，胎牛血清(Gibco)，培養(yǎng)基RPMI-1640(HyClone)，胰酶(Gibco)。

2 實驗方法

2.1 提取和分離

將新鮮婆婆納全草晾干，取1 kg干燥全草粉碎，用90%乙醇室溫浸提3次，每次72 h，合并提取浸提液，減壓濃縮至無醇味，加純水稀釋粉碎，最終體積為1 L。經(jīng)水分散后的提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，少量多次，至萃取液顏色變淡為止，減壓回收萃取溶劑，得7.7 g的石油醚層、13.30 g的乙酸乙酯層、9.30 g的正丁醇層、25.46 g的水層樣品。

通過活性評價發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯層樣品即乙酸乙酯萃取部位(PPNE)較其他樣品具有突出的抑制黑色素瘤細胞B16和A375的活性，對PPNE樣品進行系統(tǒng)的分離純化。取PPNE(12.56 g)樣品用適量甲醇溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾頭過濾，反向硅膠(ODS)拌樣，以甲醇∶水(1∶1～1∶0)為洗脫劑進行ODS柱層析，經(jīng)高效液相色譜(HPLC)和薄層色譜(TLC)檢測，合并餾分，得A、B、C、D、E五個部分。A部分，采用葡聚糖凝膠柱(HL-20，洗脫劑為甲醇和水系統(tǒng))進行反復(fù)的柱層析，得化合物1(45 mg)和化合物2(39 mg)。B部分，采用葡聚糖凝膠柱(HL-20，洗脫劑為甲醇和水系統(tǒng))進行反復(fù)的柱層析，得化合物5(19 mg)。C部分，采用葡聚糖凝膠柱(HL-20，洗脫劑為甲醇和水系統(tǒng))進行反復(fù)的柱層析，得化合物6(15 mg)，分別合并凝膠柱層析后含有化合物3和化合物4的餾分，采用半制備色譜進行制備(檢測波長為254 nm，甲醇∶水為55∶45)，制備后采用凝膠柱層析純化得化合物3(21 mg)和化合物4(19 mg)。E部分，采用葡聚糖凝膠柱(HL-20，洗脫劑為甲醇和水系統(tǒng))柱層析后，采用半制備色譜進行制備[檢測波長為254 nm，甲醇∶水(65∶35)]，制備后采用凝膠柱層析純化得化合物7(35 mg)。

2.3 HPLC分析

采用HPLC對活性較好的乙酸乙酯層(PPNE)進行分析。色譜條件：色譜柱Kromasil 100-5-C18 柱(4.6 mm × 250 mm)，檢測波長為276 nm，流動相(0.1 %甲酸A～乙腈B)，流速為1 mL·min-1，進樣體積為5 μL，采用梯度洗脫，平衡柱子采用15 % B。洗脫過程為0～5 min，30% B；5～10 min，30%～40%；10～20 min，40% B；20～30 min，40%～50% B；40～45 min, 50%～60% B；45～50 min, 60%～98% B；50～55 min，98% B；55～60 min，15% B。PPNE的HPLC如圖2所示。

圖 1 婆婆納的分離純化流程圖Fig. 1 Separation and purification flow chart of Veronica didyma

圖 2 乙酸乙酯萃取部位的HPLC圖Fig. 2 HPLC diagram of ethyl acelate extract (PPNE)

2.3 細胞培養(yǎng)

細胞接種于直徑為6 cm的細胞培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞貼壁生長融合到85%左右時，采用胰酶消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4 用CCK8法檢測婆婆納樣品對B16和A375的增殖抑制作用

取處于對數(shù)生長期的細胞，用胰酶消化后離心得細胞沉淀，用培養(yǎng)基稀釋成1×104個·mL-1的單細胞懸液接種于96孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，將培養(yǎng)液換成含有婆婆納提取物或單體化合物的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每孔100 μL；用含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，換新鮮培養(yǎng)液，同時每孔加10 μL CCK8，振搖混合均勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用多功能酶標儀測吸光度值，測定波長為450 nm。設(shè)置給藥孔(A1)、細胞空白孔(A2)、無細胞空白孔(A0)，5個復(fù)孔。

細胞增殖的抑制率(%)={ [(A2-A0)-(A1-A0)]/(A2-A0)}×100。

3 結(jié)果與分析

3.1 對婆婆納乙醇浸提物及不同萃取部位的抗黑色素瘤活性評價

婆婆納乙醇浸提物及不同溶劑萃取部位對黑色素瘤細胞B16和A375增殖的抑制結(jié)果如表1所示。從整體上來看：(1)婆婆納樣品對B16細胞增殖的抑制作用強于A375細胞；(2)乙酸乙酯部位的抑制黑色素瘤的作用最強(樣品濃度為8 mg·mL-1時，其B16細胞的IC50值為0.177 mg·mL-1)，石油醚層次之；(3)婆婆納乙醇提取物有抑制黑色素瘤的作用，尤其是對B16細胞的抑制作用較強(樣品濃度為8 mg·mL-1時，其B16細胞的IC50值為1.955 mg·mL-1)，其他水層、正丁醇層抑制黑色素瘤的作用較弱或基本無抑制作用。由此可見，乙酸乙酯部位是婆婆納抑制黑色素瘤細胞增殖的活性部位，婆婆納抗黑色素瘤的活性成分主要分布在乙酸乙酯部位和石油醚部位，尤其是乙酸乙酯部位。

表 1 婆婆納各樣品對黑色素瘤細胞的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of different samples of Veronica didyma on melanoma cells

3.2 婆婆納乙酸乙酯萃取部位(PPNE)的化學(xué)成分

通過系統(tǒng)的分離純化，我們從乙酸乙酯層分離得到了7個化合物，鑒定結(jié)果：化合物1為對羥基苯甲醛，化合物2為胡黃連苷II，化合物3為isoscutellarein 7-O-(6?-Oacetyl)-β-allopyranosyl (1?→2″)-β-glucopyranoside，化合物4為3′-hydroxy-4′-O-methylisoscutellarein 7-O-[6?-O-acetyl-β-D-allopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside，化合物5為 6-O-veratroylcatalposide，化合物6為veronicoside，化合物7為 isoscutellarein 4′-methyl ether 7-O-(6?-O-acetyl)-ballopyranosyl (1?→2″)-β-glucopyranoside。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖3所示，化合物的13C-NMR數(shù)據(jù)如表2所示?；衔?、5、6屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物，化合物3、4、7屬于黃酮苷類化合物。

表 2 化合物3-7的13C-NMR數(shù)據(jù)Table 2 13C-NMR spectral data of compounds 3-7

化合物1白色粉末，易溶于甲醇，1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 10.94(1H, s, -CHO), 7.78(2H, d,J=8.5 Hz, H-2, 6), 6.81(2H, d,J=8.5 Hz, H-3, 5);13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 131.99(C-1), 131.95(C-2, 6), 115.53(C-3, 5), 161.98(C-4), 189.29(-CHO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(黃宇飛等，2020)報道一致，化合物1鑒定為對羥基苯甲醛。

化合物2無色方晶，溶于甲醇，和胡黃連苷II對照品一起進行HPLC分析，不同洗脫系統(tǒng)保留時間相同，DAD圖譜相同，混合樣品在胡黃連苷II對照品色譜峰的位置僅有一個色譜峰，化合物2鑒定為胡黃連苷II。

化合物3黃色粉末，溶于甲醇，1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 6.85 (1H, s, H-3), 6.70 (1H, s, H-6), 7.98 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-2′), 7.98 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-6′), 6.95 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-3′), 6.95 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5′), 12.37 (1H, s, 5-OH), 5.08 (1H,d,J=6.5 Hz, H-Glu-1), 3.60 (1H, m, H-Glu-2), 3.52 (1H, m, H-Glu-3), 3.26 (1H, m, H-Glu-4), 3.46 (1H, m, H-Glu-5), 3.75 (1H, m, H-Glu-6a), 3.52 (1H, m, H-Glu-6b), 4.93(1H, d,J= 8.0 Hz, H-All-1), 3.26 (1H, m, H-All-2), 3.93 (1H, m, H-All-3), 3.43 (1H, m, H-All-4), 3.88 (1H, m, H-All-5), 4.03(1H, m, H-All-6a), 4.02 (1H, m, H-All-6b), 1.88 (3H, s, -OAc),13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(Albach et al.，2003)一致，故化合物3鑒定為isoscutellarein 7-O-(6?-oacetyl)-β-allopyranosyl (1?→2″)-β-glucopyranoside。

化合物4黃色粉末，溶于甲醇，1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 6.81 (1H, s, H-3), 6.69 (1H, s, H-6), 7.51 (1H, d,J= 1.5 Hz, H-2′), 7.62 (1H, dd,J= 8.5, 2.0 Hz, H-6′), 7.12 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5′), 12.35 (1H, s, 5-OH), 3.88 (1H, s, -OCH3), 5.10 (1H, d,J=2.5 Hz, H-Glu-1), 3.60 (1H, m, H-Glu-2), 3.50 (1H, m, H-Glu-3), 3.25 (1H, m, H-Glu-4), 3.46 (1H, m, H-Glu-5), 3.74(1H, m, H-Glu-6a), 3.52 (1H, m, H-Glu-6b), 4.92(1H, d,J= 8.0 Hz, H-All-1), 3.25 (1H, m, H-All-2), 3.92 (1H, m, H-All-3), 3.43 (1H, m, H-All-4), 3.88 (1H, m, H-All-5), 4.03(1H, m, H-All-6a), 4.03 (1H, m, H-All-6b), 1.88 (3H, s, OAc),13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(Lenherr et al.，1987)一致，故化合物4鑒定為3′-hydroxy-4′-O-methylisoscutellarein 7-O-[6?-O-acetyl-β-D-allopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside。

化合物5白色粉末，1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 7.65(1H, dd,J= 8.0, 1.5 Hz, H-6″), 7.47(1H, d,J=1.5 Hz, H-2″), 7.10(1H, d,J=9.0 Hz, H-5″), 6.43(1H, dd,J=10.0, 1.0 Hz, H-3), 5.14 (1H, m, H-1), 5.11 (1H, m, H-6), 5.01 (1H, m, H-4), 4.63 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-1′), 3.94 (1H, dd,J= 13.5, 5.0 Hz, H-10a), 3.74 (1H, m, H-10b), 3.74 (1H, m, H-6′a), 3.74 (1H, m, H-7), 3.43 (1H, m, H-6′b), 3.03～3.20 (4H, m, H-2′,3′,4′,5′), 2.60 (1H, m, H-5), 2.50 (1H, dd,J= 9.0, 7.0 Hz, H-9)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(高坤等，2003)一致，故化合物5鑒定為6-O-veratroylcatalposide。

化合物6淡棕色粉末，1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.02 (2H, d,J= 7.5 Hz, H-2″, 6″), 7.70 (1H, t,J= 7.5 Hz, H-4″), 7.56 (2H, t,J= 8.0 Hz, H-3″, 5″), 6.43 (1H, dd,J= 6.0, 1.5 Hz, H-3), 5.14 (1H, H-1), 5.12 (1H, m, H-6), 5.01 (1H, m, H-4), 4.63 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-1′), 3.94 (1H, dd,J= 13.3, 4.8 Hz, H-10a), 3.74 (1H, m, H-10b), 3.74 (1H, m, H-6′a), 3.74 (1H, br s, H-7), 3.44 (1H, m, H-6′b), 3.03～3.20 (4H, m, H-2′,3′,4′,5′), 2.61 (1H, m, H-5), 2.50 (1H, H-9);13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)。以上數(shù)據(jù)與文獻一致(Kwak et al.，2009)，故化合物6鑒定為veronicoside。

化合物7黃色粉末，溶于甲醇，1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 6.93 (1H, s, H-3), 6.70 (1H, s, H-6), 8.10 (1H, d,J= 9.2 Hz, H-2′), 8.10 (1H, d,J= 9.2 Hz, H-6′), 7.13 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-3′), 7.13 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5′), 12.33(1H, s, 5-OH), 3.87 (1H, s, -OCH3), 5.08 (1H,d,J=7.6 Hz, H-Glu-1), 3.60 (1H, m, H-Glu-2), 3.52 (1H, m, H-Glu-3), 3.25 (1H, m, H-Glu-4), 3.46 (1H, m, H-Glu-5), 3.74 (1H, m, H-Glu-6a), 3.52 (1H, m, H-Glu-6b), 4.92(1H, d,J= 8.0 Hz, H-All-1), 3.25 (1H, m, H-All-2), 3.92 (1H, m, H-All-3), 3.43 (1H, m, H-All-4), 3.88 (1H, m, H-All-5), 4.03(1H, m, H-All-6a), 4.03 (1H, m, H-All-6b), 1.88 (3H, s, -OAc)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(Nugroho et al.，2008)一致，故化合物7鑒定為isoscutellarein 4′-methyl ether 7-O-(6?-O-acetyl)-ballopyranosyl (1?→2″)-β-glucopyranoside。

3.3 單體化合物的抗黑色素瘤活性評價

從PPNE樣品中分離純化得到7個較大量單體成分，對這7個單體成分的抗B16和A375細胞增殖活性進行評價，結(jié)果如表3所示。除化合物1外，化合物2-7對B16和A375細胞株的增殖均有良好的抑制B16和A375細胞增殖的作用，并且對B16細胞增殖的抑制作用強于A375細胞，此結(jié)果與乙醇提取物和PPNE的活性一致。黃酮苷類化合物3、4、7對B16和A375細胞增殖的抑制作用弱于環(huán)烯醚萜苷類化合物2、5、6的抑制作用?？梢姡h(huán)烯醚萜類和黃酮類物質(zhì)可能是婆婆納抗黑色素瘤的活性基礎(chǔ)。

表 3 單體化合物對黑色素瘤細胞的抑制作用Table 3 Inhibitory effect of compounds of Veronica didyma on melanoma cells

圖 3 乙酸乙酯萃取部位(PPNE)中化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig. 3 Compound structures from PPNE

4 討論與結(jié)論

從婆婆納抗黑色素瘤的活性部位PPNE層得到7個較大量化合物，均為首次從婆婆納植物中得到。本研究首次報道了黃酮類化合物3、4、7，環(huán)烯醚萜類化合物5具有良好抗黑色素瘤活性，并且本文首次對化合物3、4、5的活性進行了報道?；衔?為6-O-veratroylcatalposide，最早從植物Gardeniajasminoides中分離得到(Lee et al.，1987)，筆者之前未見其相關(guān)活性數(shù)據(jù)?；衔?較化合物3黃酮母核C環(huán)上多個甲氧基，化合物3和化合物4最早由Lenherr等人從唇形科刺蕊草屬植物Stachysrecta中得到(Lenherr et al.，1984)；其后化合物3在其他植物中也有獲得，如植物Stachysanisochila、長果婆婆納等，化合物4從唇形科刺蕊草屬植物Stachysanisochila中也曾獲得，筆者之前未見化合物3和化合物4的活性報道。化合物7較化合物3黃酮母核C環(huán)上多了個甲氧基，最早從植物Veronicafiliformis的全草中獲得(Chari et al.，1981)，其后化合物7曾從植物水蘇(Stachysjaponica)中分離得到，具有顯著抑制乙酰膽堿酯酶(IC50=39.94 mg·mL-1)和丁酰酯酶活性的作用(IC50=86.98 mg·mL-1)(Nugroho et al.，2018)。

對婆婆納不同萃取部位的抗黑色素瘤活性進行評價，結(jié)果顯示婆婆納抗黑色素瘤的活性成分主要分布在乙酸乙酯萃取部位(PPNE)層和石油醚部位，尤其是PPNE層。PPNE層得到的單體化合物進行抗黑色素瘤活性評價，結(jié)果顯示環(huán)烯醚萜類化合物2、5、6具有顯著抑制黑色素瘤細胞增殖作用，當(dāng)細胞培養(yǎng)液中藥物濃度為50 μg·mL-1時，其對B16細胞的抑制率分別為89.62%、91.62%、93.36%，對A375細胞的抑制率分別為58.29%、53.96%、53.49%；黃酮類化合物3、4、7也具有較好的抑制B16和A375增殖的作用，黃酮苷類化合物對B16增殖的抑制作用稍弱于環(huán)烯醚萜苷類化合物，對A375增殖的抑制作用同環(huán)烯醚萜苷類化合物類似。綜上所述，婆婆納醇提取物的PPNE層為婆婆納的抑制黑色素瘤細胞增殖的活性部位，環(huán)烯醚萜類化合物和黃酮類化合物均為活性部位抑制黑色素瘤細胞增殖的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，尤其是環(huán)烯醚萜類化合物?；钚詸C制的初步研究發(fā)現(xiàn)活性部位和活性單體化合物可以抑制黑色素瘤細胞的遷移和侵襲，但具體機制還有待進一步的研究和驗證。