彭文藝，周喆，王德瓊，巨靈翎，張黎，孫雄山，李霜*，楊大春*

1西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610083；2解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川 成都 610083

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是指糖尿病患者在沒有其他引起心肌病變疾病的情況下心肌結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，其主要病理特征為心肌肥大、間質(zhì)纖維化、心臟小血管基底膜增厚等[1-2]。研究顯示，糖尿病病理刺激下的心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)可發(fā)生增殖并向心肌成纖維細(xì)胞(cardiac myofibroblasts，CMFs)轉(zhuǎn)分化，分泌過多的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白促進(jìn)心臟纖維化，后者是造成糖尿病心力衰竭的主要原因之一[3]。然而，目前DCM心臟纖維化發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚未明確，也無有效的抗纖維化治療策略。因此，有必要研究糖尿病高血糖狀態(tài)下CFs活化及膠原分泌的機(jī)制與防范措施。近年研究顯示，Yes相關(guān)蛋白(Yesassociated protein，YAP)在不同的心血管疾病中均可出現(xiàn)表達(dá)變化[4]，提示YAP可能參與了多種心血管疾病的發(fā)病機(jī)制。有研究報告，YAP可通過調(diào)控成纖維細(xì)胞活動而參與肺、腎和肝臟等多種器官與組織的纖維化過程[5]；在糖尿病大鼠CFs中，YAP可經(jīng)PRR-AMPK或MALAT1/CREB[6]等信號通路上調(diào)，從而促進(jìn)心臟纖維化，提示YAP與CFs活化密切相關(guān)，但YAP調(diào)控CFs活化的具體機(jī)制尚不清楚[7-8]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，在細(xì)胞水平采用高濃度葡萄糖體外模擬糖尿病高血糖狀態(tài)，培養(yǎng)SD大鼠乳鼠CFs，探究糖尿病CFs中YAP的作用及其相關(guān)機(jī)制，旨在進(jìn)一步揭示DCM心臟纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠120只，1～3日齡，體重5～6 g，購于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(陜)2019-001]。本研究獲得西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批(2021EC4-87)，實(shí)驗(yàn)過程符合國家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物管理和使用的規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM(低糖)培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液和磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國HyClone公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自美國Corning公司；膠原酶購自美國Sigma公司；RIPA裂解液和BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體、兔抗Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ，Col Ⅰ)多克隆抗體、兔抗Ⅲ型膠原蛋白(collagen Ⅲ，ColⅢ)多克隆抗體、兔抗α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)多克隆抗體、兔抗β微管蛋白(β-tubulin)多克隆抗體等購自美國Abcam公司；小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購自美國Proteintech公司；兔抗YAP單克隆抗體、兔抗Ki-67單克隆抗體購自美國Cell Signaling Techonology公司；兔抗結(jié)締組織生長因子(CTGF)多克隆抗體購自江蘇Affinity Biosciences公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗兔小鼠IgG、山羊抗兔IgG(H+L)Cy3標(biāo)記的二抗以及山羊抗兔IgG(H+L)FITC標(biāo)記的熒光二抗購自西安壯志生物科技有限公司；DAPI染色液購自美國博士德生物工程有限公司；YAP抑制劑維替泊芬(verteporfin，VP)購自美國MCE公司。細(xì)胞培養(yǎng)孵箱購自美國Thermo公司；全自動酶標(biāo)儀購自美國Tecan公司；Western blotting電泳儀和ChemiDoc MP凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 大鼠CFs的提取、培養(yǎng)及鑒定 選取1～3日齡SD大鼠，在無菌條件下剪取心臟放入預(yù)冷的PBS，撕去心房、血管后漂洗3次，吸出液體，而后轉(zhuǎn)移至安瓿瓶培養(yǎng)皿內(nèi)。向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入約3 ml的0.2%Ⅰ型膠原酶(現(xiàn)配現(xiàn)用)，將心臟組織用眼科剪剪成1～2 mm3的組織碎塊，37 ℃孵箱內(nèi)消化5 min后，收集上清液于提前配好的完全DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS)內(nèi)，而后繼續(xù)加入約3 ml的0.2% Ⅰ型膠原酶于瓶內(nèi)，重復(fù)上述步驟7或8次，直至瓶內(nèi)無明顯組織碎塊。將收集的細(xì)胞懸液離心5 min(1200 r/min)，棄上清液。加入低糖DMEM培養(yǎng)液(含10% FBS)重懸細(xì)胞， 移至培養(yǎng)皿后，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60 min，采用差速貼壁法去除未貼壁的細(xì)胞，待細(xì)胞生長近融合狀態(tài)時按1:2消化傳代，依據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)和免疫學(xué)表型(vimentin) 確定是否為CFs。實(shí)驗(yàn)采用2～4代細(xì)胞。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力 取對數(shù)生長期大鼠CFs，經(jīng)胰酶消化、傳代后，接種于9 6孔板(2×103/孔)正常過夜，分別設(shè)5.5 mmol/L、25.0 mmol/L、33.0 mmol/L、40.0 mmol/L、50.0 mmol/L葡萄糖組，每組6個復(fù)孔，次日晨施予相應(yīng)葡萄糖濃度干預(yù)，培養(yǎng)24 h；每孔加入10 μl CCK-8 溶液孵育3 h；采用酶標(biāo)儀測定各孔450 nm 波長處的吸光度(OD450)值，每組去除最高值和最低值后進(jìn)行分析。

1.5 細(xì)胞分組與處理 在6孔板中放入爬片，加入細(xì)胞懸液，將細(xì)胞分為正常糖(NG)組、正常糖+維替泊芬(NG+VP)組、高糖(HG)組、高糖+維替泊芬(HG+VP)組。正常糖組葡萄糖濃度為5.5 mmol/L，高糖組葡萄糖濃度為40.0 mmol/L；YAP抑制劑維替泊芬(VP)濃度均為0.5 μmol/L。處理24 h后采用Ki-67免疫熒光染色檢測細(xì)胞增殖情況，Western blotting 檢測細(xì)胞YAP、α-SMA、Col Ⅰ、Col Ⅲ和CTGF蛋白含量。

1.6 Ki-67免疫熒光染色檢測細(xì)胞增殖情況 各組細(xì)胞干預(yù)完成后倒掉培養(yǎng)液，用PBS洗爬片3次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3次，0.2%Triton X-100室溫通透15 min，PBS洗3次，吸水紙吸干余液；山羊血清室溫封閉30～60 min，吸水紙吸掉封閉液，每孔滴加足量的Ⅰ抗(兔抗Ki-67單克隆抗體，1:200)并放入濕盒中4 ℃過夜。次日PS 洗滌3次，滴加稀釋好的熒光Ⅱ抗[山羊抗兔IgG(H+L)Cy3標(biāo)記的二抗，1:400]；此后開始全程避光，室溫37 ℃孵育1 h，滴加DAPI染色5 min，PBS洗3次，吸水紙吸干液體后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下采集圖像。

1.7 Western blotting 檢測細(xì)胞YAP、α-SMA等蛋白含量 各組提取蛋白后測定蛋白濃度，取20～40 μg蛋白樣品行電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉或胎牛血清中室溫封閉1 h。加入相應(yīng)Ⅰ抗(兔抗α-SMA多克隆抗體，1:10 000；兔抗Col Ⅰ多克隆抗體、兔抗Col Ⅲ多克隆抗體、兔抗YAP單克隆抗體，1:1000)，4 ℃過夜孵育。次日TBST緩沖液洗膜后再用二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，1:5000)常溫?fù)u床孵育1 h；再次 TBST 洗膜后使用 ECL 發(fā)光液顯色，ImageJ軟件分析結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以GraphPad Prism 8軟件制圖。計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠CFs的鑒定 光鏡下可見SD大鼠乳鼠的原代成纖維細(xì)胞呈多角形或梭形，貼壁生長(圖1A)。免疫熒光法鑒定結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的細(xì)胞確為CFs，其細(xì)胞質(zhì)Vimentin蛋白呈陽性(圖1B)。

圖1 大鼠心臟成纖維細(xì)胞的形態(tài)及鑒定Fig.1 Morphology and identification of cardiac fibroblasts of rat

2.2 高糖對大鼠CFs增殖、分化及膠原蛋白表達(dá)水平的影響 CCK-8法檢測不同濃度葡萄糖對CFs增殖活性(OD值)的影響，結(jié)果顯示，與5.5 mmol/L葡萄糖比較，其余高濃度葡萄糖均可促進(jìn)CFs增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(5.5 mmol/L：0.42±0.04；25.0 mmol/L：0.62±0.08；33.0 mmol/L：0.85±0.06；40.0 mmol/L：0.96±0.11；50.0 mmol/L：0.89±0.10；P＜0.05，圖2A)；其中，在葡萄糖濃度為40.0 mmol/L時，CFs的增殖效果最好。因此，實(shí)驗(yàn)中正常糖組(NG)采用5.5 mmol/L葡萄糖，高糖組(HG)采用40.0 mmol/L葡萄糖。Western blotting檢測結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組CFs中的α-SMA、ColⅠ、Col Ⅲ相對表達(dá)水平均明顯增高(1.43±0.98vs.0.93±0.06，1.80±0.09vs.1.08±0.09，1.43±0.09vs.0.88±0.10，P＜0.05，圖2B、圖2C)。

圖2 高糖對大鼠CFs的增殖、分化及膠原蛋白表達(dá)水平的影響Fig.2 Effect of high glucose on the proliferation, differentiation and collagen expression level of rat's CFs

2.3 高糖對大鼠CFs中YAP及CTGF表達(dá)水平的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組CFs中YAP蛋白相對表達(dá)水平明顯增高(1.93±0.15vs.1.17±0.09，P＜0.05，圖3A)，YAP的下游因子CTGF蛋白相對表達(dá)水平也明顯增高(1.80±0.18vs.1.23±0.16，P＜0.05，圖3B)。

圖3 高糖對大鼠CFs中YAP及CTGF蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of high glucose on the expression levels of YAP and CTGF proteins of rat's CFs

2.4 VP對高糖誘導(dǎo)的大鼠CFs增殖、分化及膠原蛋白表達(dá)的影響 Ki-67免疫熒光染色結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組和HG+VP組CFs的Ki-67陽性率(%)均明顯增高(67.33±5.14vs.22.94±4.88，46.83±3.86vs.22.94±4.88，P＜0.05)；與HG組相 比，H G+V P 組C Fs 的K i-6 7 陽 性 率 明 顯 降 低(P＜0.05)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組和HG+VP組CFs的α-SMA相對表達(dá)水平明顯增高(1.71±0.12vs.1.00±0.03，1.27±0.06vs.1.00±0.03，P＜0.05)；與HG組相比，HG+VP組CFs的α-SMA相對表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。與NG組比較，HG組CFs的Col Ⅰ、Col Ⅲ相對表達(dá)水平均明顯增高(Col Ⅰ：3.03±0.17vs.1.05±0.11，P＜0.05；Col Ⅲ：1.82±0.18vs.1.14±0.19，P＜0.05)，HG+VP組CFs的Col Ⅰ相對表達(dá)水平明顯升高(2.05±0.23vs.1.05±0.11，P＜0.05)，而Col Ⅲ表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(1.10±0.12vs.1.14±0.19，P＞0.05)；與HG組比較，HG+VP組CFs的Col Ⅰ、Col Ⅲ相對表達(dá)水平均明顯降低(P＜0.05，圖4)。

圖4 VP對高糖誘導(dǎo)的大鼠CFs增殖、分化及膠原蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of verteporfin on the proliferation, differentiation and expression level of collagen proteins of rat's CFs induced by high glucose

2.5 VP對高糖誘導(dǎo)的大鼠CFs中CTGF蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組及HG+VP組CTGF蛋白相對表達(dá)水平均明顯升高(1.57±0.03vs.0.88±0.16，1.31±0.16vs.0.88±0.16，P＜0.05)；與HG組比較，HG+VP組CTGF蛋白相對表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05，圖5)。

圖5 VP對高糖誘導(dǎo)的大鼠CFs中CTGF蛋白表達(dá)的影響(Western blotting，n=4)Fig.5 Effect of verteporfin on the expression level of CTGF protein of rat's CFs induced by high glucose(Western blotting, n=4)

3 討 論

近年來，糖尿病在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率逐漸增高，2021年全球約有5.4億成年糖尿病患者，預(yù)計到2045年成年糖尿病患者數(shù)將增至7.8億[9]。心臟是糖尿病損害的主要靶器官之一，F(xiàn)ramingham研究顯示，男性糖尿病患者的心力衰竭發(fā)病率約為非糖尿病者的2.4倍，女性則約為5.0倍[10]。此外，研究顯示約1/3的心力衰竭住院患者存在糖尿病或者糖耐量受損，提示糖尿病與心力衰竭的高發(fā)生率和高病死率存在密切聯(lián)系[11]。DCM為糖尿病常見并發(fā)癥之一，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確，故而開展針對性研究并進(jìn)一步闡明其發(fā)病機(jī)制非常必要。

既往研究認(rèn)為DCM的病變以心肌細(xì)胞肥大為主，但近年有研究指出，在糖尿病病理刺激下，CFs增殖與轉(zhuǎn)分化對于DCM心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后起著不可忽視的作用[12]。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar matrix，ECM)的合成和降解，CFs可在維持心臟正常結(jié)構(gòu)、功能及電信號的傳導(dǎo)等方面發(fā)揮作用。在生理情況下CFs通常為靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)存在病理刺激時，CFs可轉(zhuǎn)分化為CMFs，其增殖和分泌膠原蛋白的能力均明顯增強(qiáng)，此為CFs活化。在DCM中，CFs過度活化導(dǎo)致的心臟間質(zhì)纖維化可引起心臟僵硬度增加、心室舒張功能減退，最終導(dǎo)致糖尿病患者不可逆地出現(xiàn)心力衰竭甚至猝死[13]。然而，CFs的具體活化機(jī)制仍未明確，在臨床工作中尚缺乏有效的治療和預(yù)防措施。因此，深入探究CFs活化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子對于尋找抑制DCM心肌纖維化的有效措施具有重要意義。本研究以SD大鼠乳鼠的原代CFs為研究對象，在體外模擬糖尿病患者體內(nèi)的高血糖環(huán)境，觀察CFs增殖、轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物α-SMA和CFs分泌的細(xì)胞外基質(zhì)成分Col Ⅰ、ColⅢ的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，在高糖環(huán)境中，CFs增殖率增高、α-SMA表達(dá)上調(diào)、膠原蛋白分泌增加，提示存在成纖維細(xì)胞的活化，與既往文獻(xiàn)報道一致[14-16]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，YAP與成纖維細(xì)胞活化密切相關(guān)[17]。YAP是一種共轉(zhuǎn)錄因子，主要受Hippo信號通路調(diào)節(jié)；當(dāng)Hippo信號通路關(guān)閉時，YAP磷酸化水平降低，去磷酸化的YAP可進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而調(diào)控下游靶基因CTGF、Cyclin D1等的表達(dá)，起到調(diào)控器官大小、細(xì)胞增殖及凋亡等作用。研究顯示，心臟特異性YAP失活的小鼠發(fā)生心肌梗死后，由于缺乏纖維化應(yīng)答而導(dǎo)致心肌損傷加重[18]；相反，心臟過表達(dá)YAP可促進(jìn)小鼠心肌梗死后的心肌細(xì)胞再生，縮小梗死范圍，預(yù)后更好[19]。另外，YAP亦參與調(diào)控動脈損傷或動脈粥樣硬化等平滑肌相關(guān)疾病的病理過程。動脈損傷后血管平滑肌細(xì)胞YAP表達(dá)水平上調(diào)，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移；沉默YAP基因可阻斷血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移，改善血管內(nèi)膜增生[20]。Francisco等[21]發(fā)現(xiàn)，心肌梗死模型小鼠CFs中YAP表達(dá)增加，可促進(jìn)心肌梗死后CFs的增殖及轉(zhuǎn)分化。此外，有研究顯示糖尿病小鼠模型心臟YAP表達(dá)明顯上升[22]；糖尿病大鼠CFs內(nèi)的YAP可經(jīng)PRR-AMPK 或Lnc MALAT1/CREB途徑上調(diào)，參與DCM的氧化應(yīng)激或炎癥反應(yīng)，影響DCM心臟纖維化的發(fā)生發(fā)展[7-8]。然而，YAP調(diào)控CFs增殖及轉(zhuǎn)分化的具體機(jī)制尚不明確。在本研究中，模擬高糖環(huán)境處理細(xì)胞24 h后，CFs明顯活化，且其YAP蛋白及下游蛋白CTGF相對表達(dá)水平升高。CTGF為一種富含半胱氨酸的分泌肽，可在細(xì)胞增殖、遷移、分化中發(fā)揮重要作用，與多種器官的纖維化密切相關(guān)。有研究顯示，過表達(dá)YAP可通過上調(diào)CTGF的表達(dá)而促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖、分化及膠原沉積[23]。由此可見，在疾病進(jìn)展過程中YAP/CTGF信號通路可能起重要作用。為了進(jìn)一步探究YAP在DCM的CFs增殖、活化中所起的作用，本研究采用YAP抑制劑VP抑制YAP與轉(zhuǎn)錄因子TEAD的結(jié)合，結(jié)果顯示，經(jīng)VP抑制YAP的作用后，可減輕高糖誘導(dǎo)的CFs增殖與活化。本研究結(jié)果還顯示，抑制YAP后，高糖誘導(dǎo)的CTGF蛋白上調(diào)作用減弱，提示高糖可能是通過上調(diào)YAP并使其進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子TEAD結(jié)合，繼而上調(diào)促纖維化等基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)來促進(jìn)纖維化的。

本研究仍存在一定局限性。研究顯示YAP的活性除主要受Hippo通路調(diào)節(jié)外，還可受到轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、Wnt、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等其他信號通路的影響，提示YAP雖然可以一定程度地影響成纖維細(xì)胞活化，但可能只是心臟纖維化調(diào)控復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中的一個重要節(jié)點(diǎn)。就CFs活化而言，相關(guān)研究提示ECM成分、細(xì)胞微環(huán)境pH值、TGF-β可以通過調(diào)節(jié)YAP磷酸化來影響這一過程[24-27]。本研究中，盡管結(jié)果顯示高糖刺激下YAP參與了CFs的增殖及活化過程，但YAP在DCM CFs中的具體作用機(jī)制仍未確定。此外，本研究主要集中于體外實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果尚待在動物體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。本課題組正在建立糖尿病小鼠模型，以進(jìn)一步觀察YAP對糖尿病模型小鼠心臟的影響，進(jìn)而探索其可能的上下游作用機(jī)制。

綜上，本研究結(jié)果顯示，高糖可上調(diào)大鼠CFs中YAP的表達(dá)，促進(jìn)CTGF和α-SMA的表達(dá)，使CFs獲得更強(qiáng)的增殖能力，并分泌過多的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，造成胞外基質(zhì)的過度沉積，從而導(dǎo)致心臟纖維化的進(jìn)展。