雍朝英，焦陽，戚迪，王導(dǎo)新

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400010

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由多種致病因素導(dǎo)致的，以頑固性低氧血癥為特征的臨床綜合征[1]。ALI和ARDS的重要病理特征之一是肺內(nèi)皮屏障損傷及其伴隨的肺水腫。盡管過去幾十年在ALI與ARDS的流行病學(xué)、病理生理學(xué)及發(fā)病機(jī)制方面取得了一些進(jìn)展[2]，但是其病死率仍居高不下[3]。因此，探索ALI與ARDS內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制和可能的治療方法具有重要意義[4]。內(nèi)皮細(xì)胞焦亡是ALI內(nèi)皮損傷的重要機(jī)制之一。既往研究在ALI和ARDS小鼠的肺中觀察到大量細(xì)胞焦亡[5]。盡管有少量證據(jù)提示Rho激酶(ROCK)抑制劑法舒地爾(fasudil，F(xiàn)S)可能具有一定的抗細(xì)胞凋亡和焦亡作用[6]，但其是否能保護(hù)ALI中血管內(nèi)皮細(xì)胞免受焦亡的影響尚不清楚。本研究觀察了法舒地爾對ALI小鼠的作用并探討其可能的機(jī)制，旨在為ALI與ARDS的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，體重20～25 g，購買并飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2018-0003]。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自武漢普諾賽公司。胎牛血清購自德國PAN生物公司。RPMI 1640購自美國Gibco公司。法舒地爾購自上海MCE公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、BCA試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)配膠試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔單克隆抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔、抗鼠IgG抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；鼠單克隆抗cleaved caspase-1、IL-1β抗體購自美國NOVUS公司；兔單克隆抗焦亡執(zhí)行蛋白Gasdermin D(GSDMD)、caspase-1抗體購自美國Abcam公司；兔單克隆抗NLRP3抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；兔單克隆抗ROCK1、ROCK2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組與處理 40只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組、ALI 組、FS組和ALI+FS組，每組10只。各組小鼠采用50 mg/kg戊巴比妥腹腔注射麻醉后，F(xiàn)S組和ALI+FS組小鼠分別腹腔注射10 mg/kg法舒地爾溶液，1 h后ALI組和ALI+FS組小鼠氣管插管滴注5 mg/kg LPS(總體積100 μl)，對照組和FS組小鼠氣管插管滴注100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)。于造模后24 h處死小鼠，收集標(biāo)本進(jìn)行各項(xiàng)檢測。動物實(shí)驗(yàn)方案得到了重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心倫理委員會的批準(zhǔn)[批準(zhǔn)文號：2022年科倫審(45)號]；實(shí)驗(yàn)過程符合國家及單位有關(guān)動物管理和使用的規(guī)定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HUVECs細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為4組：對照組、ALI組、FS組和ALI+FS組。對照組不做任何處理；ALI組用LPS(1 μg/ml)處理12 h，然后用ATP(5 mmol/L)處理1 h；ALI+FS組先用法舒地爾(30 mmol/L)處理1 h，然后用LPS(1 μg/ml)處理12 h，最后用ATP(5 mmol/L)處理1 h。FS組僅用法舒地爾(30 mmol/L)處理1 h。收集上述細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活性 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，測定各組HUVECs的細(xì)胞活性。

1.2.4 乳酸脫氫酶(LDH)釋放率檢測 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，測定各組HUVECs的LDH釋放率。

1.2.5 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)收集 小鼠麻醉后氣管插管，用1 ml PBS沖洗肺部3～5次以收集BALF。獲取的BALF以 1500 r/min在4 ℃條件下離心15 min，收集上清液-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 肺組織病理學(xué)觀察 取小鼠左肺，直接浸入 4%多聚甲醛中24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切成5～7 μm厚的切片，二甲苯脫蠟，蘇木精-伊紅(HE)染色。染色完成后，脫水封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.7 肺組織濕/干重比(wet to dry ratio，W/D)的測定 用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水洗凈右上肺，吸干水分，稱取濕重。然后將肺組織置于烤箱中，60 ℃干燥48 h至恒重后，稱取干重。計(jì)算肺組織的W/D值。

1.2.8 小鼠肺組織MPO活性測定 取小鼠肺組織，嚴(yán)格按照MPO檢測試劑盒說明書操作，測定各組小鼠肺組織的MPO活性。

1.2.9 ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-18和IL-1β水平 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，測定各組小鼠BALF和細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的水平。

1.2.10 Western blotting檢測ROCK1、ROCK2和焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 嚴(yán)格按照試劑盒說明書，使用含有PMSF的RIPA緩沖液從肺組織或細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白濃度。蛋白質(zhì)裂解物在 SDS-PAGE 凝膠上分離，然后電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，并在4 ℃下與抗 ROCK1、ROCK2、NLRP3、ASC、caspase-1、cleaved caspase-1、GSDMD、cleaved GSDMD、IL-1β和GAPDH 的一抗孵育過夜。隨后，將膜與二抗在室溫下孵育1 h，并使用 ChemiDoc Touch 成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯像。采用Image Lab軟件系統(tǒng)對蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

adc[0]=((float)AdcRegs.RESULT0)*3.0/65520.0+adclo; //讀取ADCINA0通道采樣結(jié)果

1.2.11 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞死亡率 用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒測定細(xì)胞死亡率。將HUVECs細(xì)胞重懸于500 μl結(jié)合緩沖液中，并與FITC標(biāo)記的Annexin V(5 μl)和PI(5 μl)室溫避光孵育15～20 min，然后用CytoFLEX流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞死亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對ALI小鼠肺組織病理損傷的影響 造模24 h后，HE染色結(jié)果顯示，對照組和FS組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡內(nèi)基本無出血，肺泡間隔不厚；與對照組比較，ALI 組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡內(nèi)可見明顯出血及炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔明顯增厚、水腫；與ALI組小鼠比較，ALI+FS組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞減輕，肺泡內(nèi)出血及炎癥細(xì)胞浸潤減少，肺泡間質(zhì)水腫減輕(圖1A)。

2.2 對ALI小鼠肺組織濕/干重比及肺泡灌洗液中總蛋白、總細(xì)胞數(shù)的影響 ALI 組小鼠肺組織濕/干重比明顯高于對照組(P＆lt;0.05)；經(jīng)法舒地爾預(yù)處理后，ALI+FS組小鼠肺組織濕/干重比明顯下降(P＆lt;0.05，圖1B)。與對照組比較，ALI組小鼠BALF中總細(xì)胞數(shù)和總蛋白濃度明顯升高(P＆lt;0.05)；與ALI 組比較，ALI+FS組BALF中總細(xì)胞數(shù)和總蛋白濃度均明顯下降(P＆lt;0.05，圖1C-D)。

2.3 對ALI小鼠肺組織MPO活性和BALF中炎性因子水平的影響 與對照組比較，ALI組小鼠肺組織MPO活性明顯升高(P＆lt;0.05)；與ALI 組比較，ALI+FS組小鼠的MPO活性明顯降低(P＆lt;0.05，圖1E)。ELISA法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，ALI 組小鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β水平均明顯升高(P＆lt;0.05)；與ALI組比較，ALI+FS組小鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β水平明顯降低(P＆lt;0.05，圖1F)。

圖1 法舒地爾對ALI小鼠肺組織病理損傷和炎癥反應(yīng)的影響(n=3)Fig.1 Effects of FS on pathologic damage and inflammation in lung tissue of ALI mice (n=3)

2.4 對ALI小鼠肺組織ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，ALI 組小鼠肺組織中ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)水平明顯增高(P＆lt;0.05)；與ALI組比較，ALI+FS組小鼠肺組織中ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＆lt;0.05，圖2A)。

2.5 對ALI小鼠肺組織焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 Western blotting檢測ALI小鼠肺組織中ROCK1、ROCK2及焦亡相關(guān)蛋白的相對表達(dá)水平(n=3)Fig.2 Expression levels of ROCK1, ROCK2 and pyroptosis-related proteins in lung tissue of ALI mice (Western blotting, n=3)

2.6 對HUVECs細(xì)胞活性、LDH釋放率及炎性因子水平的影響 CCK-8試驗(yàn)、LDH釋放率及流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，ALI組細(xì)胞活性明顯下降，LDH釋放率明顯增高，細(xì)胞死亡率明顯增高(P＆lt;0.05)；與ALI 組比較，ALI+FS組細(xì)胞活性明顯上升，LDH釋放率明顯降低，細(xì)胞死亡率明顯降低(P＆lt;0.05，圖3A-C)。ELISA法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，ALI組細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的水平明顯增高(P＆lt;0.05)；與ALI 組比較，ALI+FS組TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的水平明顯降低(P＆lt;0.05，圖3D)。

圖3 法舒地爾對HUVECs細(xì)胞活性和炎性因子水平的影響(n=3)Fig.3 The effect of FS on cell viability and Inflammatory factor levels in HUVECs (n=3)

2.7 對HUVECs細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，ALI 組細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、cleaved GSDMD和IL-1β表達(dá)水平均明顯增高(P＆lt;0.05)；與ALI組比較，ALI+FS組細(xì)胞中NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、cleaved GSDMD和 IL-1β表達(dá)水平均明顯降低(P＆lt;0.05，圖4)。

圖4 Western blotting檢測各組HUVECs中焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平(n=3)Fig.4 Expression levels of pyroptosis-related proteins in HUVECs (Western blotting, n=3)

3 討 論

焦亡是近年報(bào)告的一種不同于凋亡和壞死的炎性程序性細(xì)胞死亡方式，其特征是細(xì)胞腫脹、細(xì)胞溶解和胞質(zhì)內(nèi)容物釋放[7]。脂多糖或損傷性信號直接刺激可引起NLRP3炎癥小體和caspase-1的激活，導(dǎo)致焦亡執(zhí)行蛋白GSDMD的裂解和N-末端片段的釋放，在質(zhì)膜上形成孔道，從而觸發(fā)IL-1β的釋放和焦亡[8]。

Rho蛋白及其下游效應(yīng)器ROCK參與多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞運(yùn)動、黏附、收縮和炎癥細(xì)胞遷移等[9]。法舒地爾是第一個被批準(zhǔn)用于臨床的ROCK抑制劑，主要用于預(yù)防和治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后的腦血管痙攣[10]。脂多糖或細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭陰性菌的外細(xì)胞壁成分和表面抗原[11]。已有研究顯示，脂多糖引起ROCK激活和通過活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生的病理性內(nèi)皮細(xì)胞激活及屏障功能障礙與ALI有關(guān)[12]；腹腔注射ROCK抑制劑Y-27632或法舒地爾對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠ALI具有一定的治療作用，可能是通過減少炎性細(xì)胞因子和中性粒細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞向肺組織遷移而實(shí)現(xiàn)的[13-14]。抑制ROCK可減輕肺部炎癥及恢復(fù)肺內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能，但其具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究觀察了法舒地爾對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠ALI的影響，結(jié)果顯示，法舒地爾可減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠ALI，包括肺水腫、出血和過度的炎性細(xì)胞聚集。此外，本研究結(jié)果還顯示，法舒地爾能在小鼠體內(nèi)和體外細(xì)胞水平抑制脂多糖誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活和焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。

炎癥是ALI進(jìn)展的關(guān)鍵，抑制炎性因子的釋放可能成為ALI的一種治療策略[15]。細(xì)胞焦亡是ALI 中關(guān)鍵炎癥介質(zhì)IL-1β釋放的一種被動機(jī)制，IL-1β可通過上調(diào)細(xì)胞表面的IL-1β受體表達(dá)進(jìn)一步放大炎癥[16]。本研究結(jié)果顯示，法舒地爾可抑制炎性因子TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的釋放，提示其可減輕小鼠ALI的肺組織炎癥反應(yīng)。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可參與ALI的進(jìn)展，內(nèi)皮屏障的廣泛破壞和炎癥導(dǎo)致內(nèi)皮通透性增加是ALI的重要發(fā)病機(jī)制之一[17]。本研究結(jié)果提示，法舒地爾可顯著降低內(nèi)皮屏障的通透性，表現(xiàn)為毛細(xì)血管滲漏減少，肺水腫減輕，BALF中總細(xì)胞數(shù)和總蛋白濃度降低。內(nèi)皮焦亡是ALI血管內(nèi)皮損傷的重要機(jī)制之一，可導(dǎo)致大量促炎細(xì)胞因子(如IL-1β和乳酸脫氫酶)釋放，破壞內(nèi)皮屏障，最終導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)和器官衰竭[18-19]。細(xì)胞焦亡的主要標(biāo)志是caspase-1和GSDMD的活化裂解。本研究結(jié)果顯示，脂多糖可在體內(nèi)外上調(diào)焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、cleaved GSDMD和IL-1β的表達(dá)，而法舒地爾處理后上述焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平均明顯降低，提示法舒地爾可能通過抑制細(xì)胞焦亡緩解ALI小鼠的肺損傷。

Rho蛋白和ROCK在細(xì)胞黏附、收縮、運(yùn)動和分裂中發(fā)揮重要作用[20]。ROCK的兩個主要亞型ROCK1和ROCK2具有相似的生理功能。Rho蛋白和ROCK的過度激活與脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷相關(guān)。因此，抑制ROCK的激活可能成為一種有效的ALI治療措施。本研究顯示，ROCK抑制劑法舒地爾可減輕脂多糖誘導(dǎo)的ALI和肺部炎癥。有研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射ROCK抑制劑Y-27632或法舒地爾可減輕盲腸結(jié)扎穿孔誘導(dǎo)的ALI[21]；在機(jī)械通氣相關(guān)的肺損傷、百草枯誘導(dǎo)的肺損傷以及轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中也有類似的發(fā)現(xiàn)[22-24]。結(jié)合本研究結(jié)果，提示法舒地爾用于改善脂多糖所致的ALI可能有效。但法舒地爾不能完全逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮損傷和肺損傷，可能與ALI復(fù)雜的病理生理機(jī)制及持續(xù)炎癥引起的繼發(fā)損傷有關(guān)。在以往的報(bào)道中，法舒地爾也不能完全拯救所有的ALI小鼠[25]。盡管多項(xiàng)研究顯示，ROCK抑制劑有可能用于治療ALI和ARDS[26-28]，但還需要進(jìn)一步的臨床研究驗(yàn)證其在ALI和ARDS中的有益作用。本研究尚存在以下不足：(1)僅進(jìn)行了法舒地爾單次給藥造模后24 h的形態(tài)學(xué)分析及指標(biāo)檢測，后續(xù)研究將對長期用藥后的生存情況及炎癥損傷進(jìn)行評估；(2)結(jié)果顯示法舒地爾可以減輕肺組織焦亡，但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究顯示，法舒地爾可減輕脂多糖誘導(dǎo)的ALI，該作用可能是通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞焦亡實(shí)現(xiàn)的。雖然法舒地爾對臨床ALI患者的作用還不明確，但有望成為ALI潛在的治療藥物。