梁富強(qiáng)，段姍姍，濮欣然，郭銳林，石嘉懌

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210023）

作為稻米加工過(guò)程的重要副產(chǎn)物，米糠不僅富含優(yōu)良蛋白質(zhì)，還含有具有多種生物活性的小分子物質(zhì)，如酚酸類化合物[1]。谷蛋白是米糠中主要的貯藏蛋白之一（含量可達(dá)22%[2]），不僅具有較高的必需氨基酸含量，還是多種生物活性肽的重要來(lái)源，如抗氧化肽[3]、降血壓肽[2]和降血糖肽[4]等，因此具有較高的營(yíng)養(yǎng)健康價(jià)值。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的不同，酚酸類化合物可以分為羥基苯甲酸和羥基肉桂酸兩大類，芥子酸（sinapic acid，SA）是米糠中一種常見的含量較高的羥基肉桂酸（分子結(jié)構(gòu)如圖1A所示）[5]。酚酸類物質(zhì)不僅具有良好的抗氧化活性，也能夠通過(guò)作用于不同的靶點(diǎn)發(fā)揮多種生物活性。因此，酚酸單體及其協(xié)同效應(yīng)被認(rèn)為是米糠及全谷物糙米具有多種健康效應(yīng)的重要原因[6]。冉玲等[7]的研究表明SA和阿魏酸的ABTS+自由基清除能力不僅強(qiáng)于咖啡酸，而且高于常見的內(nèi)源抗氧化劑谷胱甘肽。而與阿魏酸的結(jié)構(gòu)不同，SA分子結(jié)構(gòu)的苯環(huán)上有兩個(gè)甲氧基（圖1），研究發(fā)現(xiàn)這對(duì)于SA的生物活性具有重要影響。Yang等[8]發(fā)現(xiàn)SA的DPPH自由基清除能力明顯高于阿魏酸。Jeon等[9]的研究也表明SA對(duì)于紫外損傷人皮膚成纖維細(xì)胞的保護(hù)效果顯著優(yōu)于阿魏酸。因此，SA作為一種代表性的酚酸化合物近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注。

圖1 SA的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of SA

作為共存于食品體系中的小分子和生物大分子，酚酸和蛋白在加工、膳食和消化過(guò)程中非常容易發(fā)生共價(jià)結(jié)合。Dai等[10]的研究表明大米谷蛋白與原花青素在疏水相互作用的驅(qū)動(dòng)下發(fā)生非共價(jià)結(jié)合。研究表明這不僅能改變蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)功能特性，也會(huì)對(duì)小分子多酚的化學(xué)穩(wěn)定性、生物利用率及生物活性產(chǎn)生顯著影響[11?12]。小分子化合物與蛋白的結(jié)合位點(diǎn)及作用機(jī)制是決定其結(jié)合親和力及生物效應(yīng)的基礎(chǔ)[13]。然而，作為共存于米糠中的小分子和生物大分子，SA與米糠谷蛋白（rice bran glutelin，RBG）非共價(jià)相互結(jié)合的動(dòng)態(tài)行為及其分子機(jī)制仍不清楚。因此，研究擬采用光譜學(xué)方法結(jié)合同源模建、分子結(jié)合和分子動(dòng)力學(xué)模擬探究RGB和SA的結(jié)合行為及分子機(jī)制，以期為RGB-SA非共價(jià)復(fù)合物在食品營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用提供分子和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米糠 由南京遠(yuǎn)望富硒農(nóng)產(chǎn)品有限責(zé)任公司提供；芥子酸（純度>95%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲亞砜（純度≥96.0%） 北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉（純度≥96.0%） 上海麥克林生化科技股份有限公司；鹽酸（分析純） 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

磁力攪拌器 常州國(guó)華電器有限公司；FL-7000熒光分光光度計(jì)、U3900型紫外-可見光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RBG制備 參考實(shí)驗(yàn)室提取大米谷蛋白的方法[14]提取RBG：將脫脂米糠依次分離清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白后的殘?jiān)?，加?.05 mol/L NaOH提取谷蛋白，離心取上清（8000 r/min，15 min），調(diào)節(jié)pH至4.8，靜置沉淀。將沉淀物水洗至pH中性，凍干得到RBG提取物。采用凱氏定氮法測(cè)得RBG提取物中蛋白質(zhì)含量約為85.3%±2.6%。

1.2.2 熒光光譜測(cè)定 將0.2 g RBG溶解于50 mL磷酸鹽緩沖液中離心制備蛋白母液，與不同濃度的SA混合制備SA終濃度為0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 μmol/L的RBG-SA復(fù)合物體系。設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，狹縫為5 nm，熒光分光光度計(jì)發(fā)射波長(zhǎng)為300～500 nm范圍的熒光光譜。此外，將Δλ分別設(shè)定為15和60 nm，測(cè)定SA對(duì)RBG同步熒光光譜的影響。采用式（1）～式（4）計(jì)算SA猝滅RBG熒光的速率常數(shù)（Ksv）、猝滅常數(shù)（Kq）、結(jié)合常數(shù)（Ka）、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）及熱力學(xué)參數(shù)，包括焓變（?H），熵變（?S）和吉布斯自由能（?G）[15]。

式中：F0和F分別是SA加入前后RBG的熒光強(qiáng)度； τ0表示生物分子的熒光平均壽命（10?8s）；[Q]表示SA濃度；T表示開爾文溫度；R表示氣體常數(shù)（8.314 J/mol/K）。

1.2.3 RBG三維結(jié)構(gòu)同源模建 基于多模板同源模建的方法構(gòu)建RBG的三維結(jié)構(gòu)模型[16]。從Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）下載谷蛋白的氨基酸序列（P07728），利用BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）在線網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)以尋找適合的模板結(jié)構(gòu)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果選擇同源模建模板，采用Modeller 10.0軟件構(gòu)建RBG的三維結(jié)構(gòu)模型，通過(guò)PROCHECK程序（https://saves.mbi.ucla.edu/）評(píng)估模型質(zhì)量。

1.2.4 分子對(duì)接 為尋找小分子配體SA在RBG上所有可能的結(jié)合位點(diǎn)，將同源模建獲得的RBG三維結(jié)構(gòu)文件和小分子配體SA的三維結(jié)構(gòu)文件上傳到CB-dock2（https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php）進(jìn)行口袋搜索和分子對(duì)接[17]。通過(guò)Discovery Studio客戶端和Pymol可視化對(duì)接結(jié)果。

1.2.5 分子動(dòng)力學(xué)（Molecular dynamic，MD）模擬以分子對(duì)接獲得的5種結(jié)合構(gòu)象為初始結(jié)構(gòu)，采用Gromacs 2019.6軟件包參考實(shí)驗(yàn)室的方法[18]進(jìn)行MD模擬。6個(gè)模擬體系（單獨(dú)的RBG和5個(gè)RBGSA復(fù)合物）均采用立方體盒子，TIP3P水模型，力場(chǎng)為amber99sb-ildn。添加Na+和Cl?離子做為抗衡離子，以中和模擬體系電荷。首先采用最陡下降法對(duì)模擬體系進(jìn)行能量最小化，然后依次進(jìn)行100 ps等溫系綜和等溫等壓系綜下的限制性模擬以平衡體系，使體系的溫度和壓力分別達(dá)到298 K和1 bar。最后對(duì)平衡后的體系進(jìn)行100 ns的無(wú)限制動(dòng)力學(xué)模擬，時(shí)間步長(zhǎng)為2 fs。對(duì)模擬軌跡通過(guò)Gromacs 2019.6結(jié)合視覺分子動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行分析。采用分子力學(xué)泊松-玻爾茲曼比表面積（Molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area，MM-PBSA）方法計(jì)算SA與RBG的結(jié)合自由能。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)三次或以上，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±平均偏差表示。采用Origin 2018軟件繪圖，SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異顯著。使用chemoffice軟件繪制SA分子結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光猝滅及機(jī)制分析

圖2A～圖2C顯示了不同濃度SA存在下RBG熒光光譜在三個(gè)溫度下的變化?？梢钥闯鯮BG在345 nm處有最大發(fā)生峰。隨著SA濃度的不斷增加，RBG的內(nèi)源熒光強(qiáng)度明顯下降。研究認(rèn)為這種熒光猝滅效應(yīng)可能是由于非共價(jià)結(jié)合形成了復(fù)合物，改變了蛋白中色氨酸和酪氨酸殘基的微環(huán)境[19]。

動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅是兩種常見的熒光猝滅機(jī)制，可以通過(guò)Stern-Volmer方程（圖2D）和結(jié)合參數(shù)（表1）判斷。三個(gè)溫度下Ksv隨著溫度的增大而增大，說(shuō)明存在動(dòng)態(tài)猝滅。然而，最小的猝滅速率（Kq=1.55×1012L/mol/s）遠(yuǎn)大于最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)（2.0×1010L/mol/s），表明SA對(duì)RBG的熒光淬滅主要是由于基態(tài)復(fù)合物的形成而不是動(dòng)態(tài)碰撞。因此，可以推斷SA對(duì)于RBG熒光淬滅主要是靜態(tài)猝滅。前人研究表明包括芥子酸與玉米醇溶蛋白結(jié)合的Kq也遠(yuǎn)大于最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，判斷猝滅類型為靜態(tài)猝滅[20]。Li等[21]的研究認(rèn)為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)于大米谷蛋白的熒光猝滅也屬于靜態(tài)猝滅。對(duì)于靜態(tài)猝滅，可以進(jìn)一步采用雙對(duì)數(shù)方程（圖2E）計(jì)算SA與RBG之間的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。由表1可以看出，SA與RBG的結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而增大，表明形成復(fù)合物的穩(wěn)定性與溫度正相關(guān)。與前人研究相比，SA與RBG的結(jié)合常數(shù)（298 K）大于SA與白菇魚肌球蛋白[22]及大米谷蛋白與沒食子酸[23]的結(jié)合常數(shù)。岳一珂[20]的研究也顯示大多數(shù)羥基肉桂酸與玉米醇溶蛋白的結(jié)合能力強(qiáng)于羥基苯甲酸?？梢酝茰y(cè)SA與RBG能夠發(fā)生非共價(jià)結(jié)合且表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合能力。

圖2 SA對(duì)RBG內(nèi)源熒光的猝滅機(jī)制Fig.2 Quenching mechanism of SA on RBG endogenous fluorescence

表1 SA與RBG相互作用的猝滅常數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Quenching parameters and thermodynamic parameters for SA-RBG interaction

氫鍵、范德華力、靜電和疏水相互作用是蛋白與多酚非共價(jià)結(jié)合的主要相互作用力。這些作用力類型可以通過(guò)熱力學(xué)參數(shù)來(lái)確定。根據(jù)前人理論，一般認(rèn)為，當(dāng)ΔS<0，ΔH<0時(shí)為氫鍵相互作用；ΔS>0，ΔH>0時(shí)為疏水相互作用；當(dāng)ΔS>0，ΔH<0時(shí)為靜電相互作用[24]。由表1可知，ΔG為負(fù)值，說(shuō)明SA與RBG的結(jié)合是自發(fā)行為；而ΔS和ΔH均大于0，表明RBG-SA非共價(jià)復(fù)合物的形成主要由疏水相互作用驅(qū)動(dòng)。Jia等[25]的研究表明SA與杏仁蛋白的非共價(jià)結(jié)合也主要是由疏水相互作用力驅(qū)動(dòng)的。

2.2 同步熒光

同步熒光光譜可以表征蛋白中色氨酸和酪氨酸殘基微環(huán)境極性變化，可以進(jìn)一步反映SA對(duì)RBG構(gòu)象的影響。圖3A和圖3B分別顯示的是不同濃度SA存在下RBG中酪氨酸（Δλ=15 nm）和色氨酸（Δλ=60 nm）的同步熒光光譜變化?？梢园l(fā)現(xiàn)色氨酸（5069）的熒光強(qiáng)度明顯高于酪氨酸（1011），說(shuō)明RBG的內(nèi)源熒光主要由色氨酸貢獻(xiàn)，這與戴濤濤[23]的結(jié)果一致。隨著SA濃度的增加，RBG中的酪氨酸和色氨酸的熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)規(guī)律性下降的趨勢(shì)，可以發(fā)現(xiàn)最大發(fā)射峰的位置發(fā)生了輕微藍(lán)移，說(shuō)明SA的結(jié)合導(dǎo)致酪氨酸和色氨酸殘基所處微環(huán)境的疏水性有所增加。

圖3 SA對(duì)RBG同步熒光光譜的影響Fig.3 Effect of SA on the synchronous fluorescence spectra of RBG

2.3 分子對(duì)接結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明SA與RBG發(fā)生了非共價(jià)結(jié)合，然而僅通過(guò)實(shí)驗(yàn)的手段難以闡述受體蛋白識(shí)別小分子配體的過(guò)程、結(jié)合穩(wěn)定性及分子機(jī)制。近年來(lái)分子對(duì)接已經(jīng)成為研究受體和配體相互作用分子機(jī)制的重要手段。由于目前尚無(wú)RBG的晶體結(jié)構(gòu)，因此首先通過(guò)多模板同源模建的方法建立了其三維結(jié)構(gòu)。根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果中的相似性（>30%）選擇5WPW（51.36%）、5XTY（50.66%）、2E9Q（45.05%）、3QAC（44.52%）和6B4S（45.15%）五個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)作為模板進(jìn)行多模板同源模建，獲得RBG的三維結(jié)構(gòu)模型（圖4A）。拉氏圖分析（圖4B）顯示，沒有氨基酸殘基（0.0%）位于不允許區(qū)域（disallowed regions），90%以上的氨基酸殘基位于允許區(qū)域（allowed regions）和最佳區(qū)域（most favoured regions）。上述說(shuō)明得到的RBG三維結(jié)構(gòu)構(gòu)象合理，質(zhì)量較高，可用于后續(xù)研究[26]。

通過(guò)基于口袋搜索的分子對(duì)接可以發(fā)現(xiàn)RBG存在5個(gè)潛在的配體結(jié)合位點(diǎn)（圖4C），根據(jù)位點(diǎn)的三維坐標(biāo)依次命名為C1～C5位點(diǎn)。SA在這5個(gè)位點(diǎn)的分子對(duì)接打分均為負(fù)值（表2）表明SA能夠自發(fā)與RBG結(jié)合。很多研究一般根據(jù)分子對(duì)接打分選擇多酚與蛋白的結(jié)合構(gòu)象[27]。然而，這5個(gè)位點(diǎn)的對(duì)接打分非常接近，因此，僅依據(jù)分子對(duì)接結(jié)果無(wú)法確定SA在RBG上最可能的結(jié)合位點(diǎn)。近年來(lái)越來(lái)越多的研究認(rèn)識(shí)到分子對(duì)接只能提供蛋白和小分子配體的靜態(tài)結(jié)合模式，而無(wú)法分析兩者相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程和結(jié)合穩(wěn)定性[28]。MD模擬能夠從時(shí)間尺度和分子水平探究受體蛋白和小分子配體結(jié)合識(shí)別的穩(wěn)定性及動(dòng)態(tài)行為。因此，需要進(jìn)一步結(jié)合MD模擬以探究SA與RBG最可能的結(jié)合位點(diǎn)。

圖4 RBG三維結(jié)構(gòu)及其與SA的分子對(duì)接結(jié)果Fig.4 Three-dimensional structure of RBG and the molecular docking result between it and SA

表2 SA在RBG 5個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)的分子對(duì)接打分Table 2 Docking scores for SA at five potential binding sites of RBG

2.4 SA與RBG最可能結(jié)合位點(diǎn)的確定

為了確定SA的RBG最可能的結(jié)合位點(diǎn)，以分子對(duì)接得到的5種結(jié)合構(gòu)象為起始結(jié)構(gòu)進(jìn)行了MD模擬。均方根位移（root mean square deviation，RMSD）是衡量模擬體系是否達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)的重要指標(biāo)，小分子配體的RMSD能夠反映其在結(jié)合口袋中運(yùn)動(dòng)的穩(wěn)定性[29]。MD過(guò)程中RBG蛋白骨架的RMSD的變化如圖5A所示，可以發(fā)現(xiàn)在配體SA不存在（RBG）和存在（pro_C1-pro_C5）的情況下，蛋白骨架的RMSD值10 ns后均能達(dá)到平衡狀態(tài)（0.2～0.3 nm之間），說(shuō)明MD過(guò)程中蛋白R(shí)BG能夠很快達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。五個(gè)結(jié)合位點(diǎn)MD過(guò)程中配體SA的RMSD變化情況和運(yùn)動(dòng)軌跡如圖5B～圖5F所示。由圖5F可以發(fā)現(xiàn)，60 ns后配體SA的RMSD發(fā)生了急劇升高，進(jìn)一步結(jié)合其MD過(guò)程中的運(yùn)動(dòng)軌跡可以發(fā)現(xiàn)SA在60 ns后脫離了蛋白結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明SA不能穩(wěn)定結(jié)合在位點(diǎn)C5。而結(jié)合在位點(diǎn)C1～C4時(shí)，根據(jù)圖5B～圖5E可以看出，雖然在MD過(guò)程中配體SA的RMSD也都產(chǎn)生了一定的波動(dòng)，但是結(jié)合SA整個(gè)運(yùn)動(dòng)軌跡可以看出其均未脫離，這表明SA能夠穩(wěn)定結(jié)合在RBG上除C5外的4個(gè)位點(diǎn)。

圖5 RMSD曲線及結(jié)合自由能Fig.5 RMSD plots and binding free energy

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，SA與RBG的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n接近1，因此，為了確定小分子配體SA在RBG上這個(gè)最可能的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步采用MM-PBSA的方法計(jì)算了SA在C1～C4四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合自由能。如圖5G所示，SA結(jié)合在剩余四個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合自由能值分別為?43.99、?61.15、?25.75和?26.44 kJ/mol。結(jié)合自由能均為負(fù)值說(shuō)明SA與RBG的結(jié)合是自發(fā)行為，這與實(shí)驗(yàn)獲得的熱力學(xué)參數(shù)和分子對(duì)接結(jié)果一致[30]。SA在C2位點(diǎn)的結(jié)合自由能顯著低于其他位點(diǎn)（P<0.05），表明在這一位點(diǎn)的親和力最強(qiáng)。同時(shí)，圖5C顯示在結(jié)合位點(diǎn)C2，35 ns后小分子配體SA的RMSD值穩(wěn)定在約0.8 nm。因此，根據(jù)結(jié)合自由能和RMSD變化情況可以推測(cè)位點(diǎn)C2是SA與RBG最可能的結(jié)合位點(diǎn)。與前人的研究比較可以發(fā)現(xiàn)，SA在RBG上的結(jié)合位點(diǎn)不同于原花青素[10]、沒食子酸[31]和表沒食子兒茶素沒食子酸酯[32]的結(jié)合位點(diǎn)。這一方面可能是由于前人研究采用靜態(tài)的分子對(duì)接分析三種多酚與RBG的相互作用，沒有考慮結(jié)合的動(dòng)態(tài)過(guò)程；另一方面配體SA的分子結(jié)構(gòu)與這三種多酚類物質(zhì)不同，也可能導(dǎo)致結(jié)合位點(diǎn)存在明顯差異。因此，多酚類化合物與RBG非共價(jià)相互作用的構(gòu)效關(guān)系仍需深入研究。

2.5 SA與RBG的結(jié)合穩(wěn)定性及分子機(jī)制分析

蛋白質(zhì)回旋半徑（radius of gyrate，Rg）可以表征蛋白質(zhì)的密實(shí)度，值越大表示蛋白溶脹和結(jié)構(gòu)松弛[29]。圖6A可以看出，MD過(guò)程中單獨(dú)RBG和RBG-SA復(fù)合物的Rg平均值分別穩(wěn)定在約2.59和2.58 nm，說(shuō)明SA的結(jié)合對(duì)于RBG的密實(shí)度沒有明顯影響。均方根漲落（root mean square fluctuation，RMSF）能夠反映MD過(guò)程中單個(gè)氨基酸殘基的波動(dòng)情況。圖6B表明，配體SA存在的情況下RBG結(jié)構(gòu)中多數(shù)氨基酸殘基的波動(dòng)程度明顯降低至低于0.2 nm，說(shuō)明SA的結(jié)合增強(qiáng)了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。這也進(jìn)一步證實(shí)SA能夠穩(wěn)定結(jié)合在RBG的C2位點(diǎn)。

圖6 結(jié)合穩(wěn)定性及相互作用分子機(jī)制Fig.6 Binding stability analysis and the interaction molecular mechanism

為深入揭示SA與RBG相互作用的分子機(jī)制，進(jìn)一步將結(jié)合自由能分解到蛋白的每個(gè)氨基酸殘基。如圖6C所示，可以發(fā)現(xiàn)其中Ile131、Ile90、Gln261、Trp149、Tyr151和Tyr102 6個(gè)氨基酸殘基（<-2 kJ/mol）對(duì)兩者的結(jié)合自由能有重要貢獻(xiàn)，提示它們可能對(duì)于SA和RBG的結(jié)合穩(wěn)定性和親和力起著重要作用。SA與Trp149、Tyr151和Tyr102殘基的相互作用可能是實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)致RBG內(nèi)源熒光猝滅的重要原因。對(duì)MD最后一幀的結(jié)合構(gòu)象分析（圖6D）可以發(fā)現(xiàn)，SA的苯環(huán)和甲氧基可以通過(guò)π-烷基相互作用與Ile131、Ile90、Trp149、Tyr151及Tyr102形成疏水相互作用；還可以通過(guò)范德華力與Gln261接觸。有研究顯示SA的苯環(huán)和甲氧基可以通過(guò)π-σ、π-烷基和氫鍵與靶點(diǎn)蛋白的關(guān)鍵氨基酸殘基相互作用，從而發(fā)生特異性結(jié)合[33]。前人研究表明酚酸分子結(jié)構(gòu)中甲氧基的取代位置，如3位和5位，對(duì)提高其與蛋白的親和力強(qiáng)弱有重要影響[34]?？梢酝茰y(cè)SA的兩個(gè)甲氧基基團(tuán)對(duì)其與RBG的結(jié)合具有重要作用。本文的結(jié)果能夠?yàn)楹罄m(xù)探究酚酸與RBG相互作用的結(jié)構(gòu)-親和力關(guān)系及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)改造提供依據(jù)。

3 結(jié)論

本文通過(guò)熒光光譜結(jié)合同源模建、分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬研究了SA與RBG非共價(jià)相互作用及其動(dòng)態(tài)過(guò)程，解析了SA與RBG最可能的結(jié)合位點(diǎn)及相互作用的分子機(jī)制。結(jié)果表明SA與RBG通過(guò)疏水相互作用以約1:1的比例自發(fā)形成復(fù)合物，其結(jié)合導(dǎo)致RBG微環(huán)境和構(gòu)象的改變。分子模擬揭示了RBG上5個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)中，C2位點(diǎn)是最可能的結(jié)合位點(diǎn)，并進(jìn)一步揭示了SA在RBG的C2位點(diǎn)親和力高的關(guān)鍵氨基酸殘基和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本文深入探究了SA與RBG非共價(jià)結(jié)合的動(dòng)態(tài)過(guò)程和相互作用的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究酚酸類化合物與RBG非共價(jià)相互作用的構(gòu)效關(guān)系提供了新思路，為其復(fù)合物作為功能性食品配料的應(yīng)用開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。