任翠翠 ，李俊峰 ，呂佳佳 ，葉凱 ，劉子源 ，黃芊 ，竇建衛(wèi)

1.西安市第一醫(yī)院，陜西 西安 710002； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.邛崍?zhí)煦y制藥有限公司，四川 邛崍 611530； 4.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西 西安 710061；5.西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710021

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新增癌癥中，乳腺癌（11.7%）首次超過肺癌（11.4%）成為全球新確診人數(shù)最多的癌癥[1]。目前乳腺癌主要以手術(shù)為主，并配合放療、化療、免疫及內(nèi)分泌治療等[2-3]。中醫(yī)治療乳腺癌積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，《外科癥治全生集》記載陽和湯用于治療乳巖，乳巖歸于陰疽，屬陰證、寒證，病機(jī)主要為陰寒凝結(jié)，氣血凝滯，故提出以陽和湯加土貝母的方法治療乳腺癌[4]。近年來，關(guān)于陽和湯治療乳腺癌的臨床及基礎(chǔ)研究也屢見報(bào)道[5-7]，然其機(jī)制不甚明了。

研究發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞凋亡有關(guān)的STAT1/p53信號通路是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，陽和湯含藥血清可顯著抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞BT549增殖及遷移[9]。在此基礎(chǔ)上，本研究以STAT1/p53信號通路為切入點(diǎn)，觀察陽和湯含藥血清對BT549細(xì)胞形態(tài)、凋亡和周期的影響，探討陽和湯治療三陰性乳腺癌的具體作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用和后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞

SPF級雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)過程遵守西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)指導(dǎo)原則與要求。人三陰性乳腺癌細(xì)胞BT549，購自上海晶都生物技術(shù)有限公司。

1.2 藥物及制備

陽和湯（熟地黃30 g，肉桂3 g，麻黃2 g，鹿角膠9 g，芥子6 g，姜炭2 g，甘草3 g，土貝母15 g），飲片購自北京同仁堂西安門店，經(jīng)西安交通大學(xué)藥學(xué)院竇建衛(wèi)副教授鑒定，符合2020年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。鹿角膠先加水1 000 mL煎煮1 h，再加入熟地黃、肉桂、芥子、姜炭、甘草、土貝母繼續(xù)煎煮30 min，后下麻黃，煎煮10 min，取濾液，藥渣加水600 mL再煎煮20 min，合并2次藥液，濃縮至原藥材濃度1.4 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?-氟尿嘧啶注射液，天津金耀，批號12020959，0.25 g/支。

1.3 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基（美國HyClone公司，貨號SH30809.01），胎牛血清（美國Gibco公司，批號M3851），胰酶、青霉素-鏈霉素雙抗（美國HyClone公司，批號分別為SH3004201、SV30010），信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）1抗體（美國CST公司，貨號#9176），STAT3抗體（武漢三鷹生物，貨號#10253），p53抗體（武漢三鷹生物，貨號#60283），Bax抗體（美國CST公司，貨號#89477），DAPI染色液（江蘇凱基生物，貨號KGA215），細(xì)胞周期檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（福州飛凈生物，批號分別為PH0539、PH0530）。

倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號BX53），電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號JY300C），細(xì)胞恒溫恒壓培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司，型號TC 2323），全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（美國Thermo Scientific公司，型號HT2型），低溫冰箱（青島海爾公司，型號BCD-458WDVMU1），超低溫冰箱（青島海爾，型號DW-40L278），離心機(jī)（德國Heraeus公司，型號Biofugeprimo R），流式細(xì)胞儀（美國BD公司，型號FACSCalibur）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 含藥血清制備

根據(jù)體質(zhì)量將大鼠隨機(jī)分為空白對照組、陽性藥組及陽和湯低、中、高劑量組，每組8只。陽和湯低、中、高劑量組按4.5、9、18 g/kg灌胃（相當(dāng)于臨床成人劑量的5、10、20倍），陽性藥組尾靜脈注射5-氟尿嘧啶注射液（0.125 g/5 mL）15 mg/kg，空白對照組和陽性藥組予蒸餾水灌胃，灌胃體積10 mL/kg，每日2次，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清，56 ℃水浴30 min滅活，分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將胎牛血清與RPMI-1640培養(yǎng)基以1∶9比例混合，再按總體積的1%加入雙抗搖勻，配制成完全培養(yǎng)基。BT549細(xì)胞復(fù)蘇或傳代后，每培養(yǎng)瓶（25 cm2）加完全培養(yǎng)基4 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為空白對照組、陽性藥組及陽和湯低、中、高劑量組，將大鼠血清分別加空白培養(yǎng)基稀釋，配制成10%含藥血清，用于干預(yù)細(xì)胞。

2.3 DAPI染色

取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔接種至6孔板，待細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，加入相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞，每孔加入DAPI染液100 μL，避光孵育10～15 min，棄去染色液，PBS漂洗，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種至6孔板中，每孔約1×106個(gè)，培養(yǎng)12 h后，棄去原培養(yǎng)基，血清饑餓法繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，棄去舊培養(yǎng)基，PBS洗滌，胰酶消化細(xì)胞1 min，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，PBS洗滌2次，1 200 r/min離心4.5 min，收集細(xì)胞，加入Binding Buffer 450 μL、Annexin V-FITC溶液5 μL、PI溶液10 μL充分混勻，室溫避光反應(yīng)10～15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板，每孔約1×106個(gè)，培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，棄去原培養(yǎng)基，血清饑餓法培養(yǎng)24 h，加入相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。PBS洗滌，胰酶消化細(xì)胞，1 200 r/min離心4.5 min，細(xì)胞用PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×106個(gè)/mL，取1 mL細(xì)胞懸液，1 200 r/min離心4.5 min，吸去上清液，沉淀用PBS 300 μL重懸，加入無水乙醇，4 ℃固定過夜，離心，棄固定液，用RNase A液100 μL重懸細(xì)胞，37 ℃水浴30 min，加PI溶液400 μL充分混勻，4 ℃避光放置30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

2.6 qRT-PCR檢測

將BT549細(xì)胞接種于6孔板，每孔約5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，棄去原培養(yǎng)基，血清饑餓法培養(yǎng)24 h，加入相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，取RNA 5 μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.7 Western blot檢測

細(xì)胞在25 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)12 h后，棄去原培養(yǎng)基，血清饑餓法繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，預(yù)冷PBS洗細(xì)胞1次，加入RIPA裂解工作液200 μL提取蛋白，冰上孵育5 min，收集細(xì)胞，4 ℃、12 000×g離心5 min，BCA法蛋白定量，加5×蛋白上樣緩沖液，沸水滅活5 min，凝膠電泳（90 V、30 min，120 V、2 h），轉(zhuǎn)膜（200 mA、1.5 h），血清封閉2 h，加STAT1、STAT3、p53、Bax一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加二抗（1∶10 000），孵育2 h，TBST洗滌，加發(fā)光劑避光反應(yīng)3 min，顯影儀顯影，Image J軟件檢測條帶灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 陽和湯對BT549細(xì)胞形態(tài)的影響

空白對照組BT549細(xì)胞胞核邊緣清晰、著色均勻；陽和湯低、中、高劑量組和陽性藥組BT-549細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞邊緣不規(guī)則、細(xì)胞核深染、凋亡小體等典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，且陽和湯高劑量組凋亡更明顯。見圖1。

圖1 各組BT549細(xì)胞形態(tài)（DAPI染色，×500）

4.2 陽和湯對BT549細(xì)胞凋亡的影響

與空白對照組比較，陽性藥組及陽和湯低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表2。

表2 各組BT549細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

表2 各組BT549細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

注：與空白對照組比較，**P<0.01

組別空白對照組陽性藥組陽和湯低劑量組陽和湯中劑量組陽和湯高劑量組n 6 6 6 6 6凋亡率4.85±0.53 21.48±1.52**7.88±0.67**12.65±0.61**17.52±0.90**

4.3 陽和湯對BT549細(xì)胞周期的影響

與空白對照組比較，陽性藥組及陽和湯低、中、高劑量組G0/G1期細(xì)胞比例增加，G2/M期細(xì)胞比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。見表3。

表3 各組BT549細(xì)胞周期分布比較（±s，%）

表3 各組BT549細(xì)胞周期分布比較（±s，%）

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別空白對照組陽性藥組陽和湯低劑量組陽和湯中劑量組陽和湯高劑量組n 6 6 6 6 6 G0/G1期47.11±4.12 72.38±6.25**55.26±5.09*65.91±5.95**69.87±5.81**S期16.15±2.12 13.12±2.66 12.61±2.08 15.03±2.16 13.48±1.98 G2/M期36.74±3.58 14.50±1.75**32.13±3.15*19.06±2.65**16.65±2.43**

4.4 陽和湯對BT549細(xì)胞信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1、p53 mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組比較，陽性藥組及陽和湯高劑量組細(xì)胞STAT1 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01），陽性藥組及陽和湯中、高劑量組細(xì)胞p53 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05，P<0.01）。見表4。

表4 各組BT549細(xì)胞STAT1、p53 mRNA表達(dá)比較（±s）

表4 各組BT549細(xì)胞STAT1、p53 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別空白對照組陽性藥組陽和湯低劑量組陽和湯中劑量組陽和湯高劑量組n 3 3 3 3 3 STAT1 1.00±0.00 2.72±0.34**1.48±0.09 1.54±0.38 2.19±0.32**p53 1.00±0.00 2.88±0.28**1.16±0.33 2.08±1.34*2.23±0.12**

4.5 陽和湯對BT549細(xì)胞信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1/3、p53、Bax蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，陽性藥組及陽和湯低、中、高劑量細(xì)胞p53、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，STAT3蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）；陽性藥組及陽和湯中、高劑量組細(xì)胞STAT1蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見圖2、表5。

圖2 各組BT549細(xì)胞STAT1、STAT3、p53、Bax蛋白免疫印跡

表5 各組BT549細(xì)胞STAT1、STAT3、p53、Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組BT549細(xì)胞STAT1、STAT3、p53、Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別空白對照組陽性藥組陽和湯低劑量組陽和湯中劑量組陽和湯高劑量組n 3 3 3 3 3 STAT1 0.57±0.02 1.22±0.03**0.64±0.09 0.75±0.03**0.88±0.03**STAT3 1.24±0.04 0.39±0.03**0.62±0.04**0.45±0.03**0.40±0.03**p53 0.48±0.02 1.13±0.07**0.68±0.08*0.68±0.09*1.09±0.06**Bax 0.29±0.02 1.02±0.13**0.52±0.07*0.77±0.09**0.84±0.07**

5 討論

三陰性乳腺癌是乳腺癌中最具侵襲性的亞型，其特點(diǎn)是雌激素受體、孕激素受體和原癌基因HER-2呈陰性表達(dá)。雖然三陰性乳腺癌占全部乳腺癌患者的15%～20%，但因其對HER-2選擇性和內(nèi)分泌治療無效，缺乏特異性靶點(diǎn)，常規(guī)治療效果差。

隨著細(xì)胞和分子生物學(xué)的發(fā)展，乳腺癌的分子生物學(xué)機(jī)制研究已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)[10]。細(xì)胞凋亡是機(jī)體程序性地清除部分多余、對機(jī)體有害細(xì)胞的自我防御機(jī)制，細(xì)胞的異常增殖和分化，以及細(xì)胞凋亡異常都可影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[11-12]。STAT1是細(xì)胞內(nèi)信號樞紐的一員，影響細(xì)胞的正?；顒?dòng)功能，在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖與凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程及癌癥相關(guān)免疫編輯等過程中發(fā)揮重要作用[13]。p53是重要的轉(zhuǎn)錄因子，可抑制腫瘤細(xì)胞生長。野生型p53（wtp53）能夠阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、增加腫瘤對放化療的敏感性，被視為重要的腫瘤抑制基因。STAT1能與p53形成絡(luò)合物，在p53依賴的細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄活性，還可作為共活化劑增強(qiáng)p53介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄活性，從而加重DNA損傷和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。STAT1通過調(diào)節(jié)p53的腫瘤抑制功能，從而對腫瘤放療敏感性產(chǎn)生影響。STAT3是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，可激活癌基因，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。在乳腺癌中，wtp53借助其下游因子Bax、Bcl-2等引起線粒體外膜通透性改變，形成凋亡復(fù)合體，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[15]。

Bcl-2是一種癌基因，具有抑制凋亡作用[16]。Bax是最常見的促凋亡基因[15]，正常情況下，Bax位于胞質(zhì)，在受到凋亡信號刺激后，Bax會(huì)移位到線粒體膜，并形成Bax/Bcl-2二聚體，促使線粒體膜形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放[17]，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。激活的STAT1（白細(xì)胞介素、生長激素等激活）能促進(jìn)Bax/Bcl-2二聚體解體，加速Bax蛋白釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察陽和湯含藥血清對BT549細(xì)胞STAT1、STAT3及下游p53、Bax等關(guān)鍵凋亡蛋白表達(dá)的影響，探討陽和湯治療乳腺癌的潛在機(jī)制。

結(jié)果顯示，低、中、高劑量陽和湯含藥血清干預(yù)BT549細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞比例增加，G2/M期細(xì)胞比例降低，說明陽和湯可將BT549細(xì)胞的周期抑制在G0/G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。凋亡檢測中，隨著陽和湯含藥血清濃度增加，細(xì)胞凋亡率增加，表明陽和湯能誘導(dǎo)乳腺癌BT549細(xì)胞凋亡。通過Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，陽和湯各劑量組STAT1、p53、Bax表達(dá)升高，STAT3表達(dá)降低，表明陽和湯含藥血清可通過激活STAT1/p53信號通路及抑制STAT3，進(jìn)一步上調(diào)下游促凋亡蛋白Bax表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)采用血清藥理學(xué)方法，以STAT1/p53信號通路為切入點(diǎn)，研究陽和湯治療三陰性乳腺癌的分子機(jī)制，可為其臨床應(yīng)用和后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)支持。但三陰性乳腺癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多因素、多靶點(diǎn)的共同作用，對其機(jī)制的進(jìn)一步了解仍需后續(xù)深入研究。