李曉琴 ，馬棟 ，晉玲， ，溫雅 ，薛幸嬪 ，田怡 ，馬毅，

1.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000； 2.西北中藏藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000

板藍根為十字花科植物菘藍Isatis indigoticaFort.的干燥根，其性寒，味苦，歸心、胃經，具有清熱解毒、涼血利咽功效，主要含生物堿類、氨基酸類、有機酸類、木脂素類、核苷類等成分[1]。關于板藍根藥材品質，《中華本草》指出“以條長、粗大、體實者為佳”[2]。在實際生產過程中，一般將板藍根主根粗長者列為上品[3]。1984年頒布的《七十六種藥材商品規(guī)格標準》以“根呈圓柱形，長17 cm以上，蘆下2 cm，外直徑1 cm以上為一等品；根呈圓柱形，蘆下直徑0.5 cm以上為二等品”[4]劃分板藍根商品規(guī)格等級。2020年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）明確規(guī)定板藍根醇溶性浸出物不得少于25.0%、(R,S)-告依春不得少于0.020%[5]。在同一商品規(guī)格下，用于區(qū)分交易品種質量優(yōu)劣的標準為商品等級，而不同等級之間的板藍根存在著一定的質量差異[6]。在自然條件下，植物生長發(fā)育、器官形成及次生代謝產物積累與氣候因子密切相關[7]，不同氣候下生長的藥材其品質會有差異[8]。因此，明確藥用植物次生代謝產物合成和積累的主導氣候因子是保證藥材良好品質的關鍵。板藍根作為甘肅省大宗藥材之一，不同產地藥材外觀性狀與化學成分存在一定差異，然而鮮有其形、質與綜合環(huán)境因素相關性研究的報道。為此，本研究采用最大熵模型及Pearson相關性分析方法對不同產地板藍根表型性狀和活性成分與氣候因子的相關性進行研究，為板藍根的規(guī)范化種植及品質提升提供依據(jù)。

1 儀器、試藥與數(shù)據(jù)

LC-2040C 3D系列高效液相色譜儀，島津制作所；HH-4型水浴鍋，江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠；EX2202ZH/E型萬分之一分析天平、EX2202ZH/E型百分之一電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；RHP-100型多功能粉碎機，浙江永康市榮浩工貿有限公司。

(R,S)-告依春對照品（批號AF21050951，純度98%），成都埃法生物科技有限公司；磷酸、甲醇均為色譜純，無水乙醇為分析純，天津市大茂化學試劑廠；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司。板藍根藥材，于甘肅省36個不同產地采集，以“中國板藍根之鄉(xiāng)”民樂縣為重點采集地區(qū)。經甘肅中醫(yī)藥大學馬毅副教授鑒定，為十字花科菘藍Isatis indigoticaFort.的干燥根。2020年秋季采挖，除去泥沙，曬干保存。樣品產地見表1，樣點分布見圖1。

表1 板藍根藥材樣品產地

圖1 甘肅省板藍根樣點分布

綜合考慮板藍根種植情況，一般在每年4月栽播、10月底采收，故剔除11月至次年3月的氣候指標[9]，利用地理信息系統(tǒng)軟件ArcGIS10.2從全球氣候數(shù)據(jù)庫（http://www.worldclim.org/）提取并下載4－10月均溫（tavg）、降水量（prec）、輻射（srad）、水汽壓（vapr）共28個氣候因子數(shù)據(jù)。

2 方法與結果

2.1 根系性狀測定

每個樣地隨機選取處理好的10株健康樣株，測量并記錄其根長、根系直徑、根干質量。數(shù)值型數(shù)據(jù)取10株樣株的平均值。其中，根長為最長根長，根系直徑為根部最粗處直徑；根長均用直尺測量，根系直徑用游標卡尺測量，根干質量用百分之一電子天平稱量。

2.2 浸出物含量測定

參照2020年版《中國藥典》通則2201水溶性浸出物測定法的熱浸法測定。

2.3 (R,S)-告依春含量測定

參照2020年版《中國藥典》板藍根項下含量測定項規(guī)定方法測定。

2.3.1 色譜條件

采用Agilent HC-C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.02%磷酸水溶液（7∶93），流速0.6 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長245 nm，柱溫30 ℃。理論塔板數(shù)按(R,S)-告依春計不小于5 000。在此色譜條件下對照品有穩(wěn)定的指標成分峰且樣品峰分離度理想。

2.3.2 對照品溶液制備

精密稱取(R,S)-告依春對照品1.00 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成濃度為40.0 μg/mL的(R,S)-告依春對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備

精密稱定板藍根藥材粉末（過4號篩）約1 g，置錐形瓶中，加水50 mL，稱定質量，煎煮2 h，放冷，再稱定質量，用水補足減失的質量，搖勻，靜置5 min，吸取上清液，16 000 r/min離心6 min，取上清液，即得。

2.3.4 線性關系考察

分別精密吸取40 μg/mL(R,S)-告依春對照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，注入高效液相色譜儀，以進樣量（μg）為自變量、峰面積（mAU）為因變量建立回歸方程：Y=3×106X+2 766.1（R2=0.999 8）。結果表明，(R,S)-告依春進樣量在0.02～0.8 μg范圍內線性關系良好。

2.3.5 精密度試驗

取上述40.0 μg/mL (R,S)-告依春對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測得(R,S)-告依春峰面積RSD=1.8%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性試驗

取板藍根樣品（B30）粉末（過4號篩）1 g，按“2.3.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件分別測定，計算(R,S)-告依春含量RSD=2.3%，表明該方法重復性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件，于0、2、4、6、8、10、12 h分別進樣，測定(R,S)-告依春峰面積，計算其RSD=0.5%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗

精密稱定已知含量的同一份板藍根樣品粉末共9份，每3份為一組，分別精密加入相當于樣品中含量80%、100%、120%的(R,S)-告依春對照品。按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，計算回收率。結果平均加樣回收率為99.24%，RSD=1.13%，見表2。

表2 (R,S)-告依春加樣回收率試驗結果

2.3.9 樣品含量測定

按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣，測定板藍根樣品中(R,S)-告依春含量。

2.4 復合常數(shù)構建

基于復合質量常數(shù)[10-11]，將36個產地板藍根的外觀性狀、浸出物含量及(R,S)-告依春含量相結合，計算復合質量常數(shù)，用于板藍根藥材質量評價。質量常數(shù)相對質量常數(shù)復合常數(shù)A+=式中，h為根長，c為待測含量，m為根干質量，L1為2020年版《中國藥典》含量測定指標性成分規(guī)定限量值，L2為2020年版《中國藥典》浸出物規(guī)定限量值。計算結果見圖2。

圖2 36個不同產地板藍根樣品評價參數(shù)

由圖2可知，36個產地板藍根藥材樣品根長為11.89～24.00 cm、根干質量為3.93～22.56 g、根系直徑為0.74～1.33 cm；醇浸出物平均含量為34.90%～56.44%；(R,S)-告依春含量為0.023 6%～0.122 5%，各組參數(shù)差異較大，表明不同產地氣候因子影響板藍根藥材品質?；趶秃腺|量常數(shù)，板藍根樣品質量以B15質量最佳，B25、B24、B12次之。

2.5 氣候因子提取與篩選

利用ArcGIS10.2軟件的空間分析模塊功能將28個氣候因子值提取至板藍根采集點，轉換數(shù)據(jù)；應用MaxEnt3.4.4軟件，使用刀切法（Jackknife）評價氣候因子的權重，隨機選取75%數(shù)據(jù)進行建模，通過25%數(shù)據(jù)作為測試數(shù)據(jù)進行驗證，經2次運算去除貢獻率為0的變量，板藍根生態(tài)分布模型均AUC>0.9，數(shù)據(jù)AUC=0.998，驗證數(shù)據(jù)AUC=0.998，表明模型精確度極好，可信度高。選取累計貢獻率>95%的生態(tài)因子，初步篩選出12個生態(tài)因子，見表3。

表3 影響板藍根品質的氣候因子貢獻率（%）

2.6 藥材品質與氣候因子相關性分析

采用雙變量相關性分析方法，以氣候因子參數(shù)作為自變量，化學成分含量為因變量。采用SPSS25.0軟件對其進行Pearson相關分析，明確與板藍根品質具有相關性的氣候因子，結果見圖3。

圖3 氣候因子與板藍根樣品評價參數(shù)Pearson相關性分析

在性狀方面，(R,S)-告依春含量與主根直徑呈極顯著負相關，與根干質量呈顯著負相關。氣候因子方面，根系直徑與10月輻射呈顯著正相關，與4、10月降水量呈顯著負相關；醇浸出物含量與4、10月均溫，7月水汽壓呈正相關；(R,S)-告依春含量與4、6、10月降水量及7月水汽壓呈顯著正相關，與8、9月降水量呈極顯著正相關，與8、9月輻射呈顯著負相關。

3 討論

本研究在可控范圍內盡量保持樣品一致性，對甘肅省36個產地的板藍根根長、根系直徑、根干質量、醇浸出物含量、(R,S)-告依春含量進行測定，發(fā)現(xiàn)不同產地氣候因子下每組參數(shù)差異較大。其中以民樂縣順化鎮(zhèn)板藍根藥材復合質量常數(shù)最大，質量最佳，最適宜板藍根種植。但民樂縣13個樣地復合質量常數(shù)參差不齊（6.77～26.67），考慮板藍根肉質根的生長、成熟及(R,S)-告依春作為次生代謝產物對遺傳特性的影響外，很大程度上受生長環(huán)境、氣候、土壤等因素直接或間接影響。在經緯度等地理因子，光照[12]、溫度[13]、水分[14]等氣候因子和土壤肥力[15]等生態(tài)因子的綜合作用下，板藍根的生長發(fā)育過程受到調節(jié)，表現(xiàn)出各產地間藥材外觀性狀、活性成分含量均出現(xiàn)較大差異性。氣候因子是生態(tài)環(huán)境中的重要因子[16]，因此，深入探討氣候因子對藥用植物生長發(fā)育的影響，對于提高藥材品質及藥用植物生產規(guī)范化、現(xiàn)代化、規(guī)?；哂兄匾饬x。

MaxEnt3.4.4軟件基于最大熵原理，以物種分布和環(huán)境變量為基礎，利用數(shù)學模型統(tǒng)計分析熵最大時物種的分布狀態(tài)，在分布數(shù)據(jù)較少時，最大熵模型的預測結果比同類預測模型更精確[17]。本研究基于最大熵模型從28個氣候因子數(shù)據(jù)中提取對板藍根具有貢獻率的12個氣候因子，再對其與板藍根根部參數(shù)及活性成分進行Pearson相關性分析，結果顯示輻射及降水量是影響板藍根品質的關鍵因素。

板藍根的生長期可分為4個階段，依次是苗期（5－6月）、營養(yǎng)生長期（6－7月）、肉質根生長期（7－9月）、肉質根成熟期（9－10月）[18]。營養(yǎng)生長期是板藍根扎根生長的關鍵時期，這一時期太陽輻射量逐漸升高，地上部分快速增長，密度增大遮蓋地表，一定程度上減弱了地表蒸發(fā)，但該時期植株葉片蒸騰作用逐漸增強，同時大氣溫度較高，蒸發(fā)量大，需要足夠的水分來保證下一階段肉質根的正常生長，而8、9月降雨量達到全年最高，充分保證了肉質根的生長與成熟；根系進入肉質根成熟期后，根部開始迅速膨大，蒸騰作用也隨氣溫逐漸降低而逐漸減弱，植株的生長中心轉移，地上部將養(yǎng)分輸送到地下開始進行有效成分的積累，需水量也表現(xiàn)下降趨勢，降水量減少恰好符合這一需求；這一時期也是地下部分有效成分積累的關鍵時期，有效成分產量主要來自光合作用，太陽輻射卻在逐漸減少，不利于有效成分的積累，故表現(xiàn)出8、9月太陽輻射與(R,S)-告依春含量呈顯著負相關。此外，在地理因素上，本次調研區(qū)域內隨著地區(qū)的變化年均太陽輻射總量降低和降水量增加可以促進(R,S)-告依春含量的積累，表現(xiàn)為從西向東由河西地區(qū)向隴東地區(qū)推進，板藍根中(R,S)-告依春含量升高，從南向由隴南地區(qū)向隴中地區(qū)推進，板藍根中(R,S)-告依春含量升高；但河西地區(qū)的板藍根(R,S)-告依春含量相對較低，具體原因還需進一步實地調研和分析。

綜上所述，板藍根品質的形成與氣候因子密切相關。7－10月太陽輻射和降水量對板藍根的栽培有顯著影響，這與板藍根喜溫暖、怕水澇[19]的習性一致。此外，在實現(xiàn)板藍根藥材“優(yōu)形”和“優(yōu)質”的雙重條件下，還要關注其他栽培條件，有研究分析播種期與板藍根形態(tài)學特征、產量及質量均呈負相關[20]，提示在板藍根規(guī)范化種植過程中不僅要考慮選址，還要綜合考慮播種期等其他因素，以提高藥材品質。