侯阿美 ，王肖莉 ，張意林 ，劉敏 ，梁雪寶 ，儲(chǔ)繼軍

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽 合肥 230038； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽 合肥 230031

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指妊娠早中期連續(xù)發(fā)生≥3次的自然流產(chǎn)[1]。近年來(lái)RSA發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，約占育齡期女性的1%～5%[2]。RSA常見(jiàn)病因包括遺傳因素、免疫異常、內(nèi)分泌紊亂、解剖異常等，但仍有部分患者不能確定其病因，即不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[3]。

腎主生殖，胞胎系于腎。中醫(yī)認(rèn)為，脾腎兩虛，胎元不固是RSA的基本病機(jī)。補(bǔ)腎安胎沖劑由壽胎丸化裁而來(lái)，具有補(bǔ)腎健脾、清熱安胎功效，兼能益氣養(yǎng)血。前期研究表明，補(bǔ)腎安胎沖劑可顯著降低RSA發(fā)生率[4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）與RSA密切相關(guān)，其可直接影響母胎界面血管生成，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎丟失[5-6]。課題組基于前期研究[7-10]，觀察補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清對(duì)RSA小鼠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞功能、VEGF及其受體VEGF-R1、VEGF-R2表達(dá)的影響，進(jìn)一步探索補(bǔ)腎安胎沖劑治療RSA的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性CBA/J小鼠18只，6～7周齡，體質(zhì)量（19±2）g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0008。雄性DBA/2、BALB/c小鼠各5只，6～7周齡，體質(zhì)量（19±2）g，SPF級(jí)雄性SD大鼠20只，6～7周齡，體質(zhì)量（200±10）g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（AHUCM-rats-2021078）。

1.2 藥物

補(bǔ)腎安胎沖劑由菟絲子10 g、桑寄生10 g、續(xù)斷10 g、熟地黃10 g、黃芪20 g、白術(shù)10 g、黨參10 g、黃芩10 g、白芍10 g、苧麻根10 g、墨旱蓮15 g組成，本實(shí)驗(yàn)所用為液體制劑，購(gòu)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，批號(hào)Z20200018000，每瓶120 mL（相當(dāng)于原藥材71 g）。

1.3 主要試劑與儀器

細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)BL114A），合肥Biosharp；原代上皮細(xì)胞培養(yǎng)基（貨號(hào)PriMed-iCell-001），阿聯(lián)酋iCell；胎牛血清（貨號(hào)04-001-1ACS），合肥Biosharp；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（貨號(hào)RR047A），日本TaKaRa；熒光染料（貨號(hào)E096-01B），蘇州Novoprotein；DEPC水（貨號(hào)D1007），上海Generay Biotech；VEGF抗體（貨號(hào)bs-1313R）、VEGFR1抗體（貨號(hào)bsm-52338R），北京Bioss；VEGFR2抗體（貨號(hào)ab39256），英國(guó)Abcam；GAPDH抗體、羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG（貨號(hào)分別為TA-08、ZB-2305、ZB-2301），北京中杉金橋。

流式細(xì)胞儀（型號(hào)CytoFLEX），美國(guó)BECKMAN公司；熒光定量PCR儀（型號(hào)PIKOREAL 96），美國(guó)Thermo Scientific公司；電泳儀（型號(hào)EPS300）、電泳槽（型號(hào)VE-180），上海天能科技有限公司；普通PCR儀（型號(hào)K960），杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；低速迷你離心機(jī)（型號(hào)LX 300），海門市其林貝爾儀器制造有限公司；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（型號(hào)JW-3021HR），安徽嘉文儀器裝備有限公司；微孔板迷你離心機(jī)（型號(hào)MINI-P25），杭州奧盛儀器有限公司；超微量分光光度計(jì)（型號(hào)OD1000+），南京五義科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

參照Clark經(jīng)典方法[11]，將雌性CBA/J小鼠分別與雄性DBA/2、BALB/c小鼠以2∶1合籠交配，得到RSA模型小鼠與正常妊娠小鼠，合籠后第2日開(kāi)始每天清晨檢查雌性小鼠陰道，見(jiàn)陰栓者計(jì)為妊娠第0日，否則繼續(xù)合籠飼養(yǎng)。妊娠15 d后，稱量小鼠體質(zhì)量，頸椎脫臼處死，取出完整子宮，分離胎盤，置于-80 ℃冰箱保存。

2.2 胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞分離培養(yǎng)

采用改良密度梯度離心法對(duì)原代胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分離，將得到的單細(xì)胞懸液用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清制備

SD大鼠隨機(jī)分為空白血清組和含藥血清組，每組10只，含藥血清組以補(bǔ)腎安胎沖劑11.7 g/（kg·d）灌胃（按體表面積法計(jì)算，相當(dāng)于成人等效劑量3倍），空白血清組予等量蒸餾水灌胃，灌胃體積0.2 mL/10 g，每日2次，連續(xù)7 d。末次灌胃2 h后，腹腔注射10%異戊巴比妥鈉（100 mg/kg）麻醉大鼠，無(wú)菌條件下腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心20 min，取上層血清，滅活，除菌，置于-80 ℃冰箱保存。

2.4 含藥血清最佳濃度和作用時(shí)間篩選

將RSA小鼠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞以1.0×105個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，將細(xì)胞分為對(duì)照組和1.25%、2.5%、5%、10%、20%、40%含藥血清組，每組3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入20%空白血清，其余各組加入對(duì)應(yīng)濃度的補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清，同時(shí)設(shè)置空白組調(diào)零，置于培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)12、24、48、72 h，每孔加入CCK8溶液10 μL繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)量各孔吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞增殖活力。細(xì)胞增殖活力=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）÷（對(duì)照組OD值-空白組OD值）。

2.5 細(xì)胞分組及給藥

設(shè)置正常對(duì)照組（正常妊娠小鼠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞+20%空白血清）、模型組（RSA小鼠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞+20%空白血清）和補(bǔ)腎安胎沖劑組（RSA小鼠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞+20%補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清），每組3個(gè)復(fù)孔，分別加入相應(yīng)血清培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

2.6 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，接種至96孔板，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

將細(xì)胞以1.0×106個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞，胰蛋白酶消化，2 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸洗滌后吸去上清，用預(yù)冷乙醇1 mL混勻，4 ℃固定，離心，棄上清，預(yù)冷PBS洗2次，離心，沉淀加入0.5 mL染色液（含25 μL碘化丙啶、10 μL RNaseA）重懸，混勻后置于37 ℃避光孵育0.5 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各周期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

2.8 RT-qPCR檢測(cè)

收集胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，將其作為熒光定量模板，進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃、20 s，60 ℃、1 min，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.9 Western blot檢測(cè)

收集胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，加入RIPA裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，按1∶4加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱、冷卻至室溫后，上樣至加樣孔，電泳、轉(zhuǎn)膜后，Western洗滌液洗膜5 min，加5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2、GAPDH一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，PBST洗滌，加入二抗（1∶20 000），室溫孵育2 h，洗膜，ECL曝光，凝膠成像系統(tǒng)成像，用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 含藥血清最佳濃度和作用時(shí)間篩選結(jié)果

當(dāng)補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清濃度為20%、作用時(shí)間48 h時(shí)，細(xì)胞增殖活力最高，其后隨血清濃度、培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞增殖活力有下降趨勢(shì)，故選擇20%含藥血清培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

圖1 補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清最佳濃度和最佳作用時(shí)間篩選

4.2 補(bǔ)腎安胎沖劑對(duì)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖活力的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖活力明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎安胎沖劑組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖活力明顯升高（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖活力比較（±s）

表2 各組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖活力比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別正常對(duì)照組模型組補(bǔ)腎安胎沖劑組n 3 3 3增殖活力1.00±0.00 0.51±0.00*0.74±0.01#

4.3 補(bǔ)腎安胎沖劑對(duì)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞S期細(xì)胞比例明顯減少，G2/M期細(xì)胞比例明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎安胎沖劑組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞S期細(xì)胞比例明顯增加，G2/M期細(xì)胞比例明顯減少（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞周期比較（±s，%）

表3 各組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞周期比較（±s，%）

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別正常對(duì)照組模型組補(bǔ)腎安胎沖劑組n 3 3 3 G0/G1期63.25±0.13 42.40±0.61*51.90±0.76#S期8.95±0.13 1.93±0.65*5.36±0.57#G2/M期27.80±0.18 55.67±0.05*42.74±0.26#

4.4 補(bǔ)腎安胎沖劑對(duì)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎安胎沖劑組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA表達(dá)比較（±s）

表4 各組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別正常對(duì)照組模型組補(bǔ)腎安胎沖劑組n 9 9 9 VEGF 1.00±0.07 0.44±0.06*0.59±0.02#VEGF-R1 1.00±0.05 0.48±0.06*0.73±0.04#VEGF-R2 1.00±0.07 0.45±0.05*0.60±0.01#

4.5 補(bǔ)腎安胎沖劑對(duì)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎安胎沖劑組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 各組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2蛋白免疫印跡

圖3 各組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2蛋白表達(dá)比較（±s，n=3）

5 討論

RSA是目前生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，中醫(yī)藥治療RSA具有明顯優(yōu)勢(shì)[12]。補(bǔ)腎安胎沖劑為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，以腎主生殖、胞胎系于腎為理論依據(jù)，由安胎名方壽胎丸化裁而來(lái)。方中君藥菟絲子、黨參先后天并補(bǔ)，菟絲子補(bǔ)腎益精，腎旺自可蔭胎，黨參補(bǔ)氣益血，且能健脾生津；熟地黃補(bǔ)腎填精益髓，加強(qiáng)補(bǔ)腎之功，續(xù)斷、桑寄生補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、固沖任，白術(shù)、黃芪健脾益氣，以上共為臣藥；白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰柔肝，墨旱蓮涼血止血、補(bǔ)益肝腎，黃芩、苧麻根清熱安胎，以防滋膩太過(guò)，為佐使藥。全方共奏補(bǔ)腎健脾、清熱安胎之功。該方治療RSA臨床效果顯著[4]，但其作用靶點(diǎn)與機(jī)制尚未完全闡明。

胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和凋亡的動(dòng)態(tài)平衡有益于妊娠的維持，病理妊娠的發(fā)生多與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞異常相關(guān)[13]。本研究CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清能明顯增強(qiáng)RSA小鼠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖活力，且在一定范圍內(nèi)隨著含藥血清濃度增加及給藥時(shí)間延長(zhǎng)作用增強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，模型組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞S期（DNA合成期）細(xì)胞比例顯著下降，細(xì)胞多停滯于G2/M期（P<0.05），而補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清干預(yù)后，S期細(xì)胞比例顯著升高，G2/M期細(xì)胞比例顯著下降（P<0.05），提示補(bǔ)腎安胎沖劑可促進(jìn)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞DNA合成，使細(xì)胞通過(guò)G2/M間期，促進(jìn)細(xì)胞活躍增殖。

研究發(fā)現(xiàn)，妊娠的不良結(jié)局與母胎界面血管形成異常相關(guān)[14]，蛻膜組織VEGF表達(dá)水平直接影響早期自然流產(chǎn)的妊娠結(jié)局。VEGF具有增加血管通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移等作用，通過(guò)與跨膜受體VEGF-R1、VEGF-R2等結(jié)合在胎盤及其功能形成過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[5]。Bagheri等[15]研究表明，與健康非妊娠及健康妊娠者相比，RSA非妊娠患者體內(nèi)VEGF-A和VEGF-C表達(dá)明顯降低，且與年齡、體質(zhì)量指數(shù)及流產(chǎn)次數(shù)呈負(fù)相關(guān)，并指出VEGF-A、VEGF-C低表達(dá)與RSA易感性之間密切關(guān)聯(lián)，可將其作為URSA患者流產(chǎn)發(fā)生的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。李偉莉等[16]用補(bǔ)腎安胎沖劑治療RSA患者，分別于治療前后檢測(cè)患者血清VEGF及可溶性受體-1（sFlt-1）表達(dá)，發(fā)現(xiàn)可使VEGF表達(dá)升高，sFlt-1表達(dá)降低，從而促進(jìn)胎盤血管新生。有研究表明，VEGF表達(dá)下降可能對(duì)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡造成不利影響[17]。本研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，模型組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05），而補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清干預(yù)后，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高（P<0.05），表明補(bǔ)腎安胎沖劑可上調(diào)VEGF及其受體VEGF-R1、VEGF-R2表達(dá)，介導(dǎo)母胎界面血管新生，提高妊娠成功率。

綜上所述，補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清能明顯增強(qiáng)RSA小鼠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖活力，同時(shí)顯著上調(diào)VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA及蛋白表達(dá)，促進(jìn)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞血管新生。