張瀚林， 余潔英， 田恩偉,2,3

(1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院， 廣東 廣州 510515 2.廣東省中藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510515 3.廣東省中藥制劑技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510515)

重癥肌無力(Myasthenia Gravis,MG)是一種當(dāng)神經(jīng)肌肉接頭進(jìn)行乙酰膽堿的傳遞時(shí)出現(xiàn)障礙而產(chǎn)生的自身免疫性疾病[1]。正常情況下，骨骼肌神經(jīng)肌肉接頭通過神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿介導(dǎo)完成興奮的傳遞，而當(dāng)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能出現(xiàn)異常，影響到神經(jīng)肌接頭的正常結(jié)構(gòu)和功能時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致MG的發(fā)生[2]。目前，MG在西醫(yī)臨床上的治療主要以膽堿酯酶抑制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物或手術(shù)治療。其中仍存在一些不足，如膽堿酯酶抑制劑雖能修復(fù)神經(jīng)突觸間傳遞不良的情形，但長(zhǎng)期大劑量的使用會(huì)降低藥效，且引起大量的不良反應(yīng)；免疫抑制劑雖能達(dá)到小劑量、好療效的效果，但僅僅能夠治標(biāo)，人體自身的免疫缺陷難以得到改善，且會(huì)有一定的不良反應(yīng)，而外科胸腺切除術(shù)，雖能緩解大多數(shù)患者的病情，但一方面手術(shù)自身存在風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)重癥肌無力有較大異質(zhì)性，一些患者不能貿(mào)然切除胸腺[3]。中醫(yī)在辨證重癥肌無力時(shí)，著力其癥狀表現(xiàn)，認(rèn)為病位在脾，病性為脾氣虛損，故治療重在補(bǔ)中益氣健脾[4]。以鄧鐵濤教授為代表的嶺南醫(yī)家治療重癥肌無力時(shí)，常黃芪與五指毛桃成對(duì)藥使用，如鄧?yán)系茏觿⑿”蠼淌谥委烳G以黃芪60g，五指毛桃60g為兩味主藥[5]；鄧中光教授在治療MG，68次開方時(shí)據(jù)統(tǒng)計(jì)常用的頻次居前的中藥依次為黃芪、升麻、柴胡、五指毛桃等[6]?？梢娢逯该抑委熤卦诩o力具有豐富的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，但是通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)于治療 MG的研究?jī)H局限于臨床研究和個(gè)案報(bào)道，缺乏機(jī)制的研究和探討。五指毛桃為?？崎艑僦参锎秩~榕Ficus hirta Vahl.的干燥根，多分布在我國(guó)東南部至西南部、亞洲南部至東南部[7]。其性平味甘，化學(xué)成分豐富，有補(bǔ)脾益氣、止咳平喘之效，在嶺南地區(qū)有廣泛的臨床使用，又名南芪，以補(bǔ)氣而不燥得名。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)，結(jié)合高通量組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)，篩選出了藥物的靶點(diǎn)信息，結(jié)合相關(guān)疾病的靶點(diǎn)信息，通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行其治療機(jī)制的探索。其能有效推動(dòng)對(duì)于藥物作用機(jī)制的了解[8]。本文結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)，借助數(shù)據(jù)庫(kù)獲得五指毛桃治療重癥肌無力的關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)，并為五指毛桃之后在臨床應(yīng)用方面的深入研究提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件:中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、David數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genome.jp/kegg/)、STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)、Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)、Cystoscape 3.9.0、GO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://geneontology.org/)、OMIM(https://omim.org/)、微生信網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)、SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swissadme.ch/)、Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/) 、PDB數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2五指毛桃主要化學(xué)成分的獲取:通過文獻(xiàn)檢索五指毛桃的化學(xué)成分，并結(jié)合中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)TCMSP、SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的化學(xué)成分。按以下方式進(jìn)行篩選：①通過文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)可以搜索得到的已有明確藥理活性的化合物；②具有明確結(jié)構(gòu)的化合物。③口服吸收利用度(oralbioavailability，OB)≥ 30%，藥物相似性(drug-likeness，DL)≥ 0.18進(jìn)行篩選。

1.3五指毛桃活性成分作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與轉(zhuǎn)換:將篩選出的化學(xué)成分通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP進(jìn)行預(yù)測(cè)，TCMSP未收錄或命名存在差異的化合物通過PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載SDF文件，通過Swiss Target Prediction進(jìn)行預(yù)測(cè)，將得到的靶點(diǎn)蛋白質(zhì)名字在Uniprot中進(jìn)行匹配，將其轉(zhuǎn)換為Gene Symbol，以便為后續(xù)篩選做準(zhǔn)備。

1.4五指毛桃治療重癥肌無力潛在作用靶點(diǎn)及注釋:將“重癥肌無力(Myasthenia Gravis)”作為關(guān)鍵詞輸入Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相關(guān)的人類基因，將得到的結(jié)果整合后得到相關(guān)疾病的靶點(diǎn)信息，再將獲得的靶點(diǎn)信息與五指毛桃活性成分的潛在靶點(diǎn)相比對(duì)，取交集并去重，最后得到五指毛桃治療重癥肌無力的靶點(diǎn)及蛋白信息。

1.5五指毛桃治療MG靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析:使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建五指毛桃靶蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，將蛋白種類設(shè)置為"Homo sapiens"、最低相互作用閾值設(shè)為"medium confidence"，其余參數(shù)均保持默認(rèn)操作。并通過CytoHubba插件中的Degree算法算出Degree值，以該值為參考，進(jìn)而獲得五指毛桃治療MG的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6基因本體生物學(xué)過程(Gene-ontology biology process，GO)功能富集分析:利用David數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO功能富集分析，以P值前10且P<0.01表示具有統(tǒng)計(jì)意義，并利用在線作圖工具進(jìn)行可視化。

1.7京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析:利用David生物信息注釋系統(tǒng)對(duì)核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG功能富集分析，以P<0.01表示具有統(tǒng)計(jì)意義。

1.8構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò):將篩選出的重要靶點(diǎn)蛋白、核心化合物及富集得到的信號(hào)通路導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件繪制成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

1.9分子對(duì)接模擬:從中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中將基因靶點(diǎn)以degree值高低進(jìn)行排序，以degree值的大小為篩選條件，選擇關(guān)鍵靶點(diǎn)與五指毛桃的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中下載五指毛桃活性成分化合物的sdf結(jié)構(gòu)的文件，導(dǎo)入到Chem3D 17.1軟件中調(diào)整活性成分的空間構(gòu)象，使其結(jié)合能達(dá)到最低，以利于后面模擬對(duì)接，并以mol2格式保存，經(jīng)AutoDockTools 1.5.7處理后將文件保存為pdbqt格式。從PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中下載目標(biāo)蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)，利用PyMOL 2.5.0將目標(biāo)蛋白中多余的水分子以及有機(jī)物除去，以PDB文件保存，再將目標(biāo)蛋白導(dǎo)入AutoDockTools-1.5.7加氫、分配電荷、添加原子類型后保存為pdbqt格式文件。利用AutoDock vina 1.2.0結(jié)合CMD指令進(jìn)行分子對(duì)接，用Pymol 2.5.0對(duì)得到的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1五指毛桃的化學(xué)成分篩選:文獻(xiàn)檢索獲得五指毛桃總化學(xué)成分108種，其中主要化合物香豆素類共11種，包含補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯等，黃酮類成分22種，包含芹菜素、木犀草素等，苯丙素類化合物15種，酚類化合物7種，萜類化合物12種，甾體類化合物11種包含β-谷甾醇、β-胡蘿卜苷等，以及25種其他類化合物。將獲得的108種成分通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP)，結(jié)合SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，篩選得到17種有效成分，為木犀草素、金合歡素、山柰酚、金合歡素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、水合橙皮內(nèi)酯、紫花前胡苷元、角鯊烯、β-谷甾醇、豆甾醇、齊墩果酸、柚皮素、環(huán)桑根皮素、大黃素、大黃素甲醚。

2.2五指毛桃化學(xué)成分潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選:將得到的17種化合物通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，少數(shù)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP)中沒有相關(guān)靶點(diǎn)的，則通過PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載的SDF文件通過Swiss Target Prediction網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到共計(jì)144個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，根據(jù)Cytoscape 3.9.0的插件CytoHubba計(jì)算Degree值，結(jié)果顯示，與靶點(diǎn)連接度較高的化合物為槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、大黃素、金合歡素以及佛手柑內(nèi)酯(Top 7)。而較為關(guān)鍵靶點(diǎn)為PTGS2、PTGS1、NCOA2、TOP2A、HSP90-1(Top 5)。

2.3五指毛桃“重癥肌無力(Myasthenia Gravis)”病癥相關(guān)靶點(diǎn):以"Myasthenia Gravis"關(guān)鍵詞在Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，在Genecard中找到了788個(gè)靶點(diǎn)，在OMIM中找到了64靶點(diǎn)，去除重復(fù)的50個(gè)靶點(diǎn)后，共獲得802個(gè)疾病相關(guān)基因。最終篩選出疾病相關(guān)靶點(diǎn)與五指毛桃有效化學(xué)成分靶點(diǎn)中的30個(gè)交集靶點(diǎn)(圖1)。

圖1 疾病與五指毛桃有效化學(xué)成分的交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.4蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心基因篩選結(jié)果分析:將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蛋白互作數(shù)據(jù)信息(圖2)，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蛋白互作數(shù)據(jù)信息(圖2)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并將得到的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件，計(jì)算Degree值(CytoHubba插件中的Degree算法)，選取在前8的靶點(diǎn)蛋白(表1)，即在PPI中發(fā)揮了關(guān)鍵作用的靶點(diǎn)蛋白。以Degree值為篩選條件，TNF(22)、IL6(21)、EGFR(21)、IL1B(20)、TP53(20)、JUN(20)、ESR1(20)、VEGFA(19)是網(wǎng)絡(luò)中Degree值較大的節(jié)點(diǎn)(圖3)，推測(cè)這些靶點(diǎn)可能為五指毛桃治療重癥肌無力的核心靶點(diǎn)。將這些靶點(diǎn)與化合物匹配，找出與這8個(gè)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的化合物總計(jì)8個(gè)，分別為木犀草素、金合歡素、山柰酚、槲皮素、水合橙皮內(nèi)酯、紫花前胡苷元、柚皮素、大黃素。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)

表1 關(guān)鍵靶點(diǎn)的Degree參數(shù)

圖3 8個(gè)核心靶點(diǎn)關(guān)系圖

2.5基因本體生物學(xué)過程(gene-ontology biology process，GO)功能富集分析結(jié)果:在GO功能富集分析中，共得到159條條目，其中生物過程(Biological Process，BP)占128個(gè)、分子功能(Molecular Function，MF)占10個(gè)、細(xì)胞組分(Cellular Component，CC)占21個(gè)。以P<0.01為篩選條件，得到的結(jié)果中生物過程條目主要涉及一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、ERK1/ERK2次級(jí)通路、DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖的正向調(diào)控、基因表達(dá)的正向調(diào)控、正調(diào)控的序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等生物過程；細(xì)胞組分(Cellular Component，CC)條目?jī)H涉及細(xì)胞外間隙、細(xì)胞表面、胞外區(qū)、分泌顆粒、薄膜；而分子功能(Molecular Function，MF)主要包括相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性、酶結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)異質(zhì)二聚體的活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)劑的活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能，將以上導(dǎo)入微生信網(wǎng)站作圖，如圖4所示。

圖4 GO分析富集圖

2.6京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopediaof genes and genomes，KEGG)通路富集分析:KEGG通路富集分析共富集出55條信號(hào)通路，根據(jù)P<0.01進(jìn)行篩選，得到31條信號(hào)通路。對(duì)這31條條目進(jìn)行整合分析，發(fā)現(xiàn)其中主要涉及三大類：在抗炎方面發(fā)揮作用的信號(hào)通路、與免疫系統(tǒng)相關(guān)，提高免疫能力的信號(hào)通路以及癌癥相關(guān)的信號(hào)通路。其中富集出的通路最多歸于免疫系統(tǒng)方面，共計(jì)13條，如單純皰疹感染、南美錐蟲病(美洲錐蟲病)、甲型流感、瘧疾、沙門氏菌感染、麻疹等。第二大類為抗炎通路，共有11條，如：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病(IBD)、乙型肝炎以及toll樣受體信號(hào)通路、T磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(PI3K-Akt)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路等。癌癥相關(guān)的信號(hào)通路最少，僅占6條，分為癌癥相關(guān)的途徑，如癌癥中的蛋白多糖的合成代謝，非酒精性脂肪肝(NAFLD)，和一些具體癌癥：膀胱癌、胰腺癌；以及一條與基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的雌激素信號(hào)通路。見圖5。

圖5 KEGG通路富集分析

2.7構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò):將8個(gè)靶點(diǎn)蛋白、8個(gè)化合物及31條信號(hào)通路導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件繪制“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)(圖7)。以化合物、靶點(diǎn)蛋白、信號(hào)通路的連接度為參考，木犀草素、槲皮素連接度值顯著高于其他6個(gè)化合物，推測(cè)二者為五指毛桃治療MG的核心活性成分；TNF、IL6、IL1B、JUN四個(gè)與抗炎作用關(guān)系密切的靶點(diǎn)與化合物、信號(hào)通路皆有較高的連接度，推測(cè)這四個(gè)靶點(diǎn)能在五指毛桃治療MG過程中發(fā)揮一定與抗炎相關(guān)的作用；31條通路中有14條通路連接度高于其他17條通路的連接度，整合統(tǒng)計(jì)，8條為抗炎相關(guān)通路，4條為免疫系統(tǒng)相關(guān)通路，2條為與癌癥相關(guān)通路，因此，推測(cè)五指毛桃可能通過發(fā)揮抗炎、提高自身免疫能力等功能作用治療MG。見圖6。

圖6 靶點(diǎn)-化合物-信號(hào)通路圖

2.8分子對(duì)接結(jié)果:在蛋白互作圖中，以Degree值為參考篩選出的8個(gè)靶點(diǎn)：TNF、IL6、EGFR、IL1B、TP53、JUN、ESR1、VEGFA，匹配其所對(duì)應(yīng)的化合物。以上述8個(gè)靶點(diǎn)、8個(gè)化合物作分子對(duì)接，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲得靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的所需文件，做刪除有機(jī)物、水分子及加氫分配電荷處理。通過PyMOL 2.5.0進(jìn)行預(yù)處理，使用AutoDock Vina 1.2.0結(jié)合CMD命令符進(jìn)行分子對(duì)接，得到分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果，如表2所示。通過分子對(duì)接得到共21個(gè)“靶點(diǎn)蛋白-活性分子”，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行判斷[13]，大部分化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合都具有較好的活性，如木犀草素和靶點(diǎn)JUN的結(jié)合(-5.4)、金合歡素和靶點(diǎn)TP53的結(jié)合(-6.1)、大黃素與靶點(diǎn)IL1B的結(jié)合(-6.3)等。一些化合物和靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，如木犀草素與靶點(diǎn)IL6(-7.3)、EGFR(-8.2)、TNF(-9.1)的結(jié)合；山柰酚和靶點(diǎn)TNF的結(jié)合(-8.8)；懈皮素與靶點(diǎn)JUN(-7.2)、TNF(-7.4)、IL6(-7.5)、EGFR(-8.4)的結(jié)合；紫花前胡苷元和靶點(diǎn)ESR1的結(jié)合(-8.6)；大黃素與靶點(diǎn)TP53(-7.4)、TNF(-9.1)的結(jié)合；柚皮素與靶點(diǎn)ESR1(-8.6)的結(jié)合。

表2 五指毛桃有效活性成分與對(duì)應(yīng)核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接

3 討 論

重癥肌無力(Myasthenia Gravis，MG)屬于中醫(yī)萎證范疇，因先天稟賦不足、后天失養(yǎng)，或因情志刺激、感受外邪、月經(jīng)來潮、體虛勞倦太過導(dǎo)致脾胃虛損，繼而累及五臟發(fā)病，病機(jī)以脾胃虛損為本[9]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其由遺傳、環(huán)境、自身免疫系統(tǒng)以及抗炎因子等因素誘發(fā)，而其中免疫、炎癥被認(rèn)為是導(dǎo)致MG的重要因素[10]。五指毛桃，為性味甘溫之補(bǔ)益藥，其補(bǔ)中提氣，滋益脾肺之功恰好符合諸多中醫(yī)學(xué)家治療MG的核心思路：補(bǔ)脾益氣。相關(guān)藥理學(xué)研究表明：五指毛桃能顯著提高環(huán)磷酞胺所致免疫功能低下小鼠碳粒廓清指數(shù)、胸腺和脾臟質(zhì)量指數(shù)及血清溶血素水平，揭五指毛桃能夠提高機(jī)體免疫力功能，對(duì)于導(dǎo)致MG的主要病因：脾胃虛損和自身免疫力缺陷都有良好治療效果[11]。

3.1潛在有效成分分析:本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步篩選出8個(gè)潛在活性成分，其中發(fā)揮關(guān)鍵作用的活性成分包括即木犀草素(Luteolin)，金合歡素(Acacetin)、山柰酚(Kaempferol)、柚皮素(Naringenin)、紫合橙皮內(nèi)酯(Meranzin Hydrate)、槲皮素(Quercetin)等。既往大量研究已證實(shí)上述活性成分具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)等功效。

研究表明木草犀素能通過與IL-10的正相關(guān)調(diào)控與IL-6、TNF-α的負(fù)相關(guān)調(diào)控從而發(fā)揮較強(qiáng)的抗炎作用[12]。柚皮素可以通過負(fù)相關(guān)調(diào)控IL-1β、IL-6和TNF-α基因，為脂多糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡提供幫助；金合歡素具有抗腫瘤入侵和遷移能力，在其作用下，IL-6，IL-8，細(xì)胞間黏附分子-1等抗炎因子活性都會(huì)顯著降低[13,14]。

槲皮素是一種天然存在的多酚類黃酮，實(shí)驗(yàn)表明槲皮素能抑制AGEs/RAGE/NF-κB炎癥通路，同時(shí)能抑制炎癥因子IL-1B、TNF的產(chǎn)生，并具有對(duì)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的抑制作用。山奈酚是一種結(jié)構(gòu)與懈皮素相似的生物類黃酮，具有抗炎和抗腫瘤特性。與槲皮素相似，同樣能降低促炎因子( IL-1B和TNF)的表達(dá)。

檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，除了對(duì)炎癥和免疫信號(hào)通路的調(diào)節(jié)外，部分關(guān)鍵活性成分還具有抑制膽堿酯酶(AChE)活性的作用[15]。眾所周知，抑制AChE的活性是治療神經(jīng)肌肉接頭突觸病變MG的重要環(huán)節(jié)，而后天合成的膽堿酯酶抑制劑為西醫(yī)治療MG的重要途徑之一，根據(jù)文獻(xiàn)記載，數(shù)百種天然化合物具有抗膽堿酯酶活性，例如∶生物堿、香豆素、黃酮類等等，但生物堿等化合物的毒性限制了它們?cè)卺t(yī)學(xué)治療中的廣泛使用，相比之下，黃酮類化合物不具有這種副作用，可用于疾病的長(zhǎng)期治療。

槲皮素可通過濃度依賴的方式作為乙酰膽堿酯酶(AchE)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，減少乙酰膽堿(Ach)的水解，從而增加了突觸間隙之間的Ach水平。高劑量的槲皮素可顯著降低帕金森病動(dòng)物模型中海馬勻漿的AChE 活性 。藥用金盞花提取物對(duì)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)具有廣泛的生物活性，對(duì)西伯利亞引入的 23 種品類的金盞花的研究發(fā)現(xiàn)，其中黃酮類化合物∶槲皮素和異鼠李素衍生物，均以糖苷的形式存在，與其他化合物比起來，顯示出最高的抗膽堿酯酶活性潛力，提示異鼠李素和槲皮素及其糖苷可被視為潛在的抗乙酰膽堿酯酶劑預(yù)防神經(jīng)退行性疾病。Jung M等用乙酸乙酯從藥用植物仙鶴草中提取出四種黃酮類化合物，而其中抑制AChE效果最好的是槲皮素。

因此，五指毛桃可能通過槲皮素、山奈酚、木犀草素、金合歡素等有效活性成分抗AChE活性、抗炎和調(diào)節(jié)免疫等作用靶向治療MG，同時(shí)也證實(shí)上述化合物有極大研究空間，為治療MG的藥物開發(fā)提供參考。

3.2關(guān)鍵靶點(diǎn)與信號(hào)通路分析:研究結(jié)果表明，五指毛桃治療MG的靶點(diǎn)主要集中在TNF、IL6、IL1B、TP53、JUN、ESR1等，通路主要富集在TNF、T細(xì)胞受體、Toll 樣受體(TLR)、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK等信號(hào)通路，這些靶點(diǎn)與通路之間存在著顯著的相互作用關(guān)系。

查閱文獻(xiàn)，ESR1靶點(diǎn)可能與介導(dǎo)胸腺瘤的MG相關(guān)[16]。ESR1為介導(dǎo)雌激素發(fā)揮生物學(xué)作用的核內(nèi)蛋白，而雌激素通過減少TNF、IL-6等抗炎細(xì)胞因子的合成和分泌可以作用于巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞，胸腺是雌激素作用于免疫系統(tǒng)的主要靶器官，且雌激素與胸腺內(nèi)的ER結(jié)合易導(dǎo)致MG胸腺的萎縮，相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明雌激素可通過雌激素受體達(dá)到對(duì)人體免疫系統(tǒng)的影響，也能推測(cè)雌激素可通過ESR1介導(dǎo)與胸腺有關(guān)的自身免疫疾病。此外，通過KEGG富集的癌癥中的蛋白多糖的合成代謝通路及胸腺癌通路也能與ESR1靶點(diǎn)介導(dǎo)的一系列影響形成對(duì)應(yīng)。

MAPK(原活化蛋白激酶)信號(hào)通路涉及觸發(fā)細(xì)胞反應(yīng)的環(huán)境和發(fā)育信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括存活、增殖、分化、炎癥和細(xì)胞凋亡。通常，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的MAPK 由三個(gè)不同的組組成，即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK)和p38激酶。其中p38a(MAPK14)可作為中心途徑通過對(duì)樹突狀細(xì)胞(DC)進(jìn)行編程以調(diào)節(jié)介導(dǎo)自身免疫的輔助T細(xì)胞的分化。而炎癥細(xì)胞因子如TNF、IL-6 和 IL-1B是MAPK14的原型激活劑，MAPK14的激活響應(yīng)病毒感染并可能調(diào)節(jié)病毒復(fù)制。

Toll樣受體(TLR)是一種膜結(jié)合受體，在炎癥因子釋放時(shí)，TLR能夠識(shí)別病原，激活自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗炎因子(TNF、IL-B等)，與先天及后天獲得性免疫都密切相關(guān)[17]。而現(xiàn)代研究表明，病毒感染與MG存在一定聯(lián)系。Heckmann JM等報(bào)道過17例人類免疫缺陷病毒(HIV)感染與MG并病的病例，WangY等也報(bào)道過1例HIV感染者在接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療治療后被診斷為MG，這也可能為在KEGG中富集到HIV等病毒感染通路的部分原因。此外Cavalcante P等發(fā)現(xiàn)先天免疫的關(guān)鍵激活劑TLR4在一些MG患者的胸腺中過度表達(dá)，且脊髓灰質(zhì)炎病毒感染的巨噬細(xì)胞存在于一些MG患者的胸腺中，表明病毒對(duì)于因胸腺誘發(fā)MG的患者有一定影響。

綜上所述五指毛桃可能通過介導(dǎo) TNF、IL6、IL1B、TP53、JUN、ESR1等關(guān)鍵靶點(diǎn)調(diào)控免疫應(yīng)答、炎癥、病毒感染等信號(hào)通路治療MG。