程開鑫，楊凱欣，鄧雅元，黎欣，劉恩貝，王玉春,2*，呂務(wù)云*

1.浙江農(nóng)林大學(xué)茶學(xué)與茶文化學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國家茶樹改良中心/農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008

茶樹（Camellia sinensis）是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，廣泛種植于全世界多個(gè)國家和地區(qū)[1-2]。病原菌侵染造成的葉部病害通常會(huì)影響茶樹的生長以及茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[3-5]。由炭疽菌屬（Colletotrichum）真菌引起的茶樹葉枯類病害是茶園常見病害之一。病原菌通常從幼嫩葉片背面的氣孔等自然孔口侵入茶樹，潛伏期達(dá)1～2周[6]。在侵染早期，被侵染葉片上出現(xiàn)深綠色、水漬狀病斑，之后逐漸發(fā)展為較大的棕色病斑，并且病斑聚集[6-7]。侵染后期，病斑邊緣褪色，病斑上產(chǎn)生密集的黑色點(diǎn)狀分生孢子盤，產(chǎn)生的分生孢子可促進(jìn)病害的傳播[6,8]。此外，炭疽菌也可通過采摘、修剪或風(fēng)雨形成的傷口侵入茶樹葉片[7]。

炭疽菌屬真菌種類繁多，分布于世界各地，是為害多種植物的病原真菌，通過多基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)結(jié)合形態(tài)特征作為炭疽菌種類的鑒定方法已得到全世界的認(rèn)可[9]。前人已對(duì)茶樹炭疽菌的物種多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。Orrock等[10]將分離自美國茶園發(fā)病茶樹上的炭疽菌鑒定為山茶炭疽菌（Colletotrichum camelliae）。貢長怡等[11]收集了我國12個(gè)省份茶區(qū)的茶樹炭疽病病葉，分離得到57株菌株，經(jīng)過多位點(diǎn)序列和聚類分析發(fā)現(xiàn)，山茶炭疽菌和果生炭疽菌（C.fructicola）分離頻率較高。Liu等[6]通過收集我國7個(gè)省份茶樹樣品，分離鑒定了11種炭疽菌，認(rèn)為山茶炭疽菌（C.camelliae）是我國茶樹炭疽菌的優(yōu)勢(shì)種，提出利用ApMat（Apn2-Mat1-2）和GS（Glutamine synthetase）基因構(gòu)建的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，可以準(zhǔn)確區(qū)分膠孢炭疽菌復(fù)合種（C.gloeosporioides complex）的大部分種類。Wang等[12]對(duì)收集自全國13個(gè)省份茶樹病葉進(jìn)行分離，鑒定明確了山茶炭疽菌是我國茶樹炭疽病優(yōu)勢(shì)病原菌之一，并對(duì)其形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了詳細(xì)描述，但對(duì)于該炭疽菌的致病性及防治方法未深入分析。當(dāng)前，噴施化學(xué)藥劑仍然是防治茶樹病害的主要手段。王國君等[13]分析了4種殺菌劑對(duì)茶樹炭疽病的田間防治效果，發(fā)現(xiàn)25%吡唑醚菌酯乳油效果最好。He等[14]進(jìn)一步測(cè)試了95%吡唑醚菌酯對(duì)4種炭疽菌的藥效，發(fā)現(xiàn)其對(duì)山茶炭疽菌抑菌有效中濃度（EC50）為0.27 μg·mL-1。貢長怡[15]測(cè)定了山茶炭疽菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯、甲基硫菌靈和百菌清4種藥劑的敏感性，發(fā)現(xiàn)山茶炭疽菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑敏感性較高，EC50分布在0.058 4～0.498 4 μg·mL-1。由于我國茶樹品種多、分布廣，可能造成不同寄主來源的山茶炭疽菌在遺傳進(jìn)化關(guān)系、致病力等方面存在差異，并且殺菌劑對(duì)不同來源的菌株是否有差異尚不清楚。

因此，本研究廣泛收集了我國茶葉主產(chǎn)區(qū)山茶炭疽菌菌株，并對(duì)其地理分布、致病性及其對(duì)吡唑醚菌酯的敏感性進(jìn)行系統(tǒng)分析，旨在為茶樹葉部病害的防治提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

茶樹病葉分別于2014—2022年采集自安徽、貴州、河南、湖南、江蘇、江西、陜西、四川、西藏、云南、浙江、廣東、重慶13個(gè)省份多個(gè)茶區(qū)的不同茶樹品種，用于致病性分析的國家級(jí)茶樹良種龍井43（LJ43）采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶園。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離與純化

采用單孢分離法分離病原菌[16]。用消毒后的接菌環(huán)將病葉上的分生孢子堆刮下，懸浮于無菌水中。將分生孢子懸浮液稀釋至適當(dāng)濃度后涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)過夜。待菌絲長出后，將單個(gè)孢子萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲轉(zhuǎn)移到新的PDA平板上，繼續(xù)純化培養(yǎng)。分離純化后的菌株轉(zhuǎn)移至PDA斜面后4 ℃保存。

1.2.2 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

菌株在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，用滅菌后的打孔器（直徑5 mm）在菌落邊緣打孔，然后轉(zhuǎn)移至新的PDA平板中央，25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測(cè)量并記錄菌落直徑，觀察菌落在PDA平板上的顏色及氣生菌絲生長情況，并拍攝菌落形態(tài)。將5～10個(gè)直徑5 mm的菌餅接種至100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB）中，在28 ℃、180 r·min-1搖床中培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生分生孢子。使用SOPTOP-CX40RFL顯微鏡觀察分生孢子形態(tài)，并拍照記錄。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3 DNA提取及PCR擴(kuò)增

菌落培養(yǎng)5 d后，采用Ezup柱式真菌基因組DNA純化試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取病原菌菌絲基因組DNA，并存儲(chǔ)于-20 ℃。PCR擴(kuò)增ApMat和ITS基因片段[17]。PCR引物AMF1為5'-TCATTCTACG TATGTGCCCG-3'，AMR1為5'-CCAGAAATA CACCGAACTTGC-3'；ITS-1F 為5'-CTTGGT CATTTAGAGGAAGTAA-3'，ITS-4 為5'-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3'。PCR反應(yīng)體系：25 μL 2×Taq Master Mix，1 μL 10 μmol·L-1上游引物，1 μL 10 μmol·L-1下游引物，22 μL ddH2O和1 μL基因組DNA。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行電泳檢測(cè)，將目的條帶樣品送至杭州有康生物科技有限公司進(jìn)行純化測(cè)序。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

所有菌株的基因序列在 NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)。采用MAFFT v.7進(jìn)行多序列比對(duì)[18]，使用MEGA v.6軟件進(jìn)行手動(dòng)校正[19]。利用FastTree軟件以Maximum Likelihood方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。

1.2.5 致病性測(cè)定

以5年生茶樹LJ43為材料，選取當(dāng)年生枝條芽下第三、四葉進(jìn)行接種處理。將健康完整的葉片進(jìn)行表面消毒后，在葉片正面葉脈左右兩側(cè)的葉片表皮上輕劃 4道平行傷口作為接種點(diǎn)。使用5 mm滅菌打孔器，對(duì)PDA培養(yǎng)基上28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d的菌落進(jìn)行打孔，菌餅置于葉片的兩處接種點(diǎn)上，對(duì)照用相同大小的無菌瓊脂塊處理，每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)。接種后置于人工氣候培養(yǎng)箱中，28 ℃黑暗保濕培養(yǎng)3 d，觀察發(fā)病情況并統(tǒng)計(jì)病斑大小。最后，重新對(duì)病斑進(jìn)行分離培養(yǎng)，并與原始接種菌株的形態(tài)特征進(jìn)行比較。

1.2.6 殺菌劑敏感性測(cè)定

試驗(yàn)采用吡唑醚菌酯懸浮劑[有效成分含量為25%，安道麥安邦（江蘇）有限公司]作為處理藥劑。根據(jù)He等[14]報(bào)道，有效成分含量為95%的吡唑醚菌酯懸浮劑對(duì)山茶炭疽菌的EC50為0.27 μg·mL-1，為保證有效成分一致，將本試驗(yàn)使用的供試藥劑25%吡唑醚菌酯用量換算為同等EC50后，質(zhì)量濃度為0.284 μg·mL-1。各菌株在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，用滅菌后的打孔器（直徑9 mm）在菌落邊緣打孔，新鮮菌餅轉(zhuǎn)移至含有0.284 μg·mL-1吡唑醚菌酯和100 mg·L-1水楊酸羥肟酸（SHAM）的PDA平板中央，以不含有任何藥劑的PDA平板作為對(duì)照，25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲相對(duì)生長抑制率。相對(duì)抑菌率計(jì)算方法為：相對(duì)抑菌率=(C-T)/(C-d)×100%，其中C為對(duì)照處理菌落直徑，mm；T為藥劑處理菌落直徑，mm；d為菌餅大小（9 mm）。使用0.284 μg·mL-1吡唑醚菌酯處理菌株的分生孢子，以不含吡唑醚菌酯的分生孢子懸浮液為對(duì)照，觀察并統(tǒng)計(jì)分生孢子的萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，利用SPSS軟件單因素方差分析進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)，使用Photoshop CS4進(jìn)行圖像處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

通過對(duì)采自中國13個(gè)省份茶區(qū)的不同茶樹品種病葉進(jìn)行病原菌分離，共獲得65株山茶炭疽菌菌株（表1），對(duì)ApMat和ITS基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，篩選的65株菌株全部與已鑒定并發(fā)表的山茶炭疽菌（C.camelliae）聚類為一族，表明收集的菌株均為山茶炭疽菌（圖1）。

圖1 基于ApMat和ITS聯(lián)合構(gòu)建的山茶炭疽菌多基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of C.camelliae based on the ApMat and ITS sequences

表1 菌株采集信息Table 1 Collection information of all isolates

2.2 形態(tài)學(xué)特征分析

65株菌株在PDA平板上的菌落共有形態(tài)表現(xiàn)為呈白色，氣生菌絲致密，絨毛狀，中央凸起，邊緣清晰；背面中央顏色深，四周顏色較淺，灰白色至微黃色（圖2）；菌核、剛毛未見；分生孢子透明，圓柱狀，兩端鈍圓（圖3）。

圖2 65個(gè)山茶炭疽菌菌株的菌落特征Fig.2 Colony characteristics of all isolates C.camelliae

圖3 山茶炭疽菌菌株的分生孢子形態(tài)Fig.3 Morphological characteristics of C.camelliae conidia

根據(jù)菌落背面的顏色，可將所有菌株分為兩組，組1表現(xiàn)為背面顏色灰白色或中央帶有黑色，包含YCW272、YCW284、YCW304、YCW698、YCW735、YCW1250、YCW1315、YCW1331、YCW1334、YCW1382、YCW1378、YCW1387和YCW1424等13個(gè)菌株；組2表現(xiàn)為背面顏色微黃色，包含其余的52個(gè)菌株。此外，菌株YCW272、YCW698、YCW1204、YCW1250、YCW1315、YCW1340 和YCW2134的菌落形態(tài)與其他菌株稍有差異，即圍繞中央產(chǎn)生一圈大小不一、更致密的白色菌絲（圖2）。各菌株在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，各菌落之間菌落直徑存在差異，平均直徑為6.10 cm，其中 YCW1378生長最慢，菌落平均直徑為3.49 cm；YCW1331生長最快，菌落平均直徑為7.85 cm（表 2）。

表2 各菌株的菌落直徑Table 2 Colony diameter of all isolates

2.3 地理分布分析

本研究中，65個(gè)菌株有31個(gè)采集自浙江省，其中 24個(gè)菌株采集自杭州市，6個(gè)菌株采集自麗水市，1個(gè)菌株采集自紹興市。其余35個(gè)菌株采集自其他12個(gè)省份，表明山茶炭疽菌地理分布廣泛。

2.4 致病性分析

將65個(gè)菌株分別接種于茶樹LJ43離體葉片上進(jìn)行室內(nèi)致病性測(cè)試。結(jié)果表明，有傷處理?xiàng)l件下，所有菌株均能成功侵染葉片；接種24 h后，傷口處出現(xiàn)水漬狀病斑；侵染2 d后，葉片出現(xiàn)深褐色病斑，并隨著接種時(shí)間延長，病斑從接種點(diǎn)逐漸擴(kuò)展，在接種3 d后，病斑擴(kuò)展為圓形或不規(guī)則形，病斑周圍可見黃色至褐色水漬狀暈圈，發(fā)病癥狀與田間發(fā)病情況基本一致（圖4）。

菌株之間致病力存在顯著差異，其中YCW1180、YCW1331、YCW1382、YCW1387、YCW1419、YCW1443、YCW1451、YCW1453、YCW1454、YCW1461、YCW1613 和YCW2134等12個(gè)菌株侵染葉片形成的病斑較大，表明其致病力顯著強(qiáng)于其他菌株。菌株YCW1378侵染形成的病斑最小，平均直徑為3.29 mm，表明其致病力相對(duì)于其他菌株最弱（圖5）。

圖5 各菌株的病斑直徑Fig.5 Lesion diameter of all isolates

2.5 殺菌劑敏感性分析

參照He等[14]的研究結(jié)果，采用EC50為0.284 μg·mL-1的吡唑醚菌酯處理65個(gè)山茶炭疽菌菌株。結(jié)果表明，處理3 d后，吡唑醚菌酯對(duì)不同菌株的菌絲生長抑制率不同，平均菌絲生長抑制率為72.65%，其中YCW1436菌株的敏感性顯著低于其余菌株，菌絲生長抑制率為36.00%（圖6）。用吡唑醚菌酯處理分生孢子6 h后，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，處理后的分生孢子萌發(fā)率極顯著下降（P＜0.01），有些菌株的分生孢子甚至不萌發(fā)（圖7）。此外，吡唑醚菌酯對(duì)大部分菌株的菌絲生長抑制率高于70%，表明吡唑醚菌酯對(duì)山茶炭疽菌具有較高的抑菌活性。

圖6 25%吡唑醚菌酯（0.284 μg·mL-1）處理山茶炭疽菌3 d后的菌絲生長抑制率Fig.6 Inhibition rate of mycelial growth under the 25% pyraclostrobin (0.284 μg·mL-1) treatment for 3 d

圖7 25%吡唑醚菌酯（0.284 μg·mL-1）處理山茶炭疽菌分生孢子6 h后的萌發(fā)率Fig.7 Rate of conidial germination under the 25% pyraclostrobin (0.284 μg·mL-1) treatment for 6 h

3 討論

葉部病害是威脅茶樹生長和茶葉產(chǎn)品質(zhì)量的主要影響因素之一[21]。山茶炭疽菌是造成茶樹葉枯類病害的優(yōu)勢(shì)病原菌[12]。自1899年，Massee從斯里蘭卡的茶樹上發(fā)現(xiàn)并記錄山茶炭疽菌以來[6,22]，除山茶屬植物以外，該菌種未在其他植物上有報(bào)道。Liu等[6]在前人研究基礎(chǔ)上，對(duì)山茶炭疽菌的分類學(xué)地位和形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了重新定義和描述。本研究通過多基因系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，從我國13個(gè)省份茶區(qū)不同茶樹品種病葉中收集鑒定了65株山茶炭疽菌菌株，其菌落特征總體為菌落平整、邊緣整齊、氣生菌絲白色、棉狀、稀疏，與前人報(bào)道的菌落形態(tài)特征基本一致[6,12]，進(jìn)一步根據(jù)菌落在PDA平板上形成的色素沉積差異，將山茶炭疽菌分為兩組，其中組1背面顏色灰白色，包含13個(gè)菌株；組2背面顏色微黃色，包含52個(gè)菌株。這種種內(nèi)不同菌株的菌落形態(tài)出現(xiàn)分化的現(xiàn)象，在其他植物病原真菌中已有報(bào)道[23-24]。朱名海[25]研究發(fā)現(xiàn)，分離自海南南繁區(qū)的60個(gè)稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀不完全一致。許娟[26]對(duì)采自安徽省23個(gè)地方的小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）的菌絲培養(yǎng)性狀、生長速率等生物學(xué)特征差異進(jìn)行了分析研究，發(fā)現(xiàn)23個(gè)地方的小麥赤霉病菌在PDA培養(yǎng)基上的顏色大致分為淺紅、紅色、深紅及紅中帶黃。本研究中山茶炭疽菌兩組內(nèi)的菌株采集自不同地區(qū)，其地理分布、茶樹品種和采集地氣候條件等環(huán)境因素不同，可能造成山茶炭疽菌具有豐富的遺傳多樣性，因此各菌株的生物學(xué)特性存在一定差異。

國家級(jí)茶樹良種LJ43選育自浙江龍井群體種，品質(zhì)優(yōu)良，適制多種名優(yōu)茶，是我國茶區(qū)主栽品種之一，但該品種對(duì)炭疽病表現(xiàn)為高感。近年來，隨著各地茶園的提升改造，伴隨著新品種的引進(jìn)，又增加了病原菌隨苗木遷移的傳播風(fēng)險(xiǎn)。本研究的致病性分析結(jié)果表明，來自不同茶區(qū)的山茶炭疽菌對(duì)LJ43的致病性存在顯著差異，在12個(gè)致病力較強(qiáng)的菌株中，有6個(gè)菌株分離自浙江，其他菌株來自重慶、貴州和四川。侵染和抵御侵染兩個(gè)過程對(duì)病原菌和寄主具有很強(qiáng)的相互選擇作用[27]。因此，我們推測(cè)共生茶樹品種的多樣性和較大的地理隔離，可能增強(qiáng)了分離自浙江省茶樹菌株的致病力。

吡唑醚菌酯已廣泛用于防治由炭疽菌引起的植物炭疽病，如辣椒、草莓、高粱和黃瓜等炭疽病防治[28-31]。本研究分析測(cè)定了山茶炭疽菌對(duì)吡唑醚菌酯的敏感性，在有效中濃度為0.284 μg·mL-1時(shí)，吡唑醚菌酯對(duì)大部分菌株的菌絲生長抑制率高于70%，表明吡唑醚菌酯對(duì)山茶炭疽菌具有較好的室內(nèi)抑菌效果。此外，吡唑醚菌酯可有效抑制分生孢子的萌發(fā)。王國君等[13]研究表明，吡唑醚菌酯對(duì)茶樹炭疽病田間防控效果優(yōu)于其他藥劑。梁碧元等[32]研究發(fā)現(xiàn)，25%吡唑醚菌酯對(duì)茶樹茶餅病也有著較好的防治效果。此外，吳慶麗等[33]發(fā)現(xiàn)，25%吡唑醚菌酯懸浮劑稀釋1 000倍施用后，對(duì)茶云紋葉枯病的防效達(dá)98%以上。因此，吡唑醚菌酯適用于茶樹葉部病害的防治。

綜上所述，本研究針對(duì)分離自中國13個(gè)省份茶區(qū)不同茶樹品種的65個(gè)山茶炭疽菌菌株形態(tài)特征和致病性進(jìn)行了分析，并詳細(xì)地分析了山茶炭疽菌不同菌株對(duì)吡唑醚菌酯的敏感性。研究結(jié)果進(jìn)一步明確了山茶炭疽菌生物學(xué)特性，為后續(xù)田間防治奠定了理論基礎(chǔ)。