閆佳偉，陳宗懋，李兆群，羅宗秀，邊磊，蔡曉明*，金珊

1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008

唾液是昆蟲生命活動不可或缺的一部分，它是由唾液腺產(chǎn)生并在口腔分泌的一種液體，主要分為水狀唾液（Watery saliva）和膠狀唾液（Gel saliva）兩種類型[1-2]。在昆蟲和寄主植物的相互作用中，昆蟲唾液作為兩者聯(lián)系的重要媒介，在昆蟲取食寄主植物的階段，特別是探測和攝食過程中起重要作用[3]。昆蟲分泌的唾液是一種混合物，它由多種具有生物活性的化合物組成，主要為蛋白質(zhì)和酶類。刺吸式口器的昆蟲在寄主植物的木質(zhì)部和韌皮部吸食汁液時會分泌水狀唾液，起到潤滑口器、攝取食物、解毒和突破植物防御等作用[4-8]。隨著多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些植食性昆蟲的唾液成分被逐漸探明[9]。研究發(fā)現(xiàn)，蚜蟲分泌的結(jié)構(gòu)蛋白和褐飛虱分泌的唾液鞘蛋白 NIShp是其順利取食的關(guān)鍵，此外還有唾液蛋白SHP、C002等[10-11]。然而，目前對一些昆蟲唾液成分和其功能的探索仍然有限，特別是昆蟲唾液中那些特有或廣泛存在的成分。

小貫小綠葉蟬（Empoasca onukii Matsuda）是我國茶園中最重要的刺吸式口器害蟲，其種群密度大、繁殖速度快且世代重疊嚴(yán)重，防治較為困難。葉蟬以口針穿刺細(xì)胞的方式取食茶茶葉葉肉和維管束薄壁細(xì)胞汁液[12-13]，主要為害茶樹的嫩梢或嫩莖部位，為害后會出現(xiàn)葉脈紅變、葉緣卷曲等癥狀，嚴(yán)重時茶樹芽葉會停滯生長，葉片呈現(xiàn)焦枯狀，又稱“葉蟬燒”（Hopperburn），嚴(yán)重影響了茶樹的正常生長，進而降低了茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計，葉蟬爆發(fā)時可導(dǎo)致當(dāng)季茶園減產(chǎn)50%左右[14]。近年來，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量技術(shù)對昆蟲特定部位蛋白數(shù)據(jù)分析挖掘已成為研究熱點之一。Zhang等[15]通過蛋白質(zhì)組學(xué)，分析了麥長管蚜（Sitobion avenae）唾液中的蛋白質(zhì)，共鑒定出了114種蛋白質(zhì)。Shao等[16]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析手段，分析小貫小綠葉蟬腸道消化酶，得到了7組共129個蛋白水解酶。Wu等[17]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對柑橘木虱（Diaphorina citri）的唾液和唾液腺進行了聯(lián)合分析，在唾液和唾液腺中分別鑒定出246種和483種蛋白質(zhì)。盡管如此，目前還未見小貫小綠葉蟬水狀唾液蛋白的研究報道。本研究以小貫小綠葉蟬成蟲為研究對象，收集其水狀唾液，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）分析法鑒定葉蟬水狀唾液中的蛋白質(zhì)，旨在為葉蟬分泌蛋白、取食和突破植物防御等研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

試驗所用的小貫小綠葉蟬成蟲于試驗前一天從浙江省杭州市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗茶園（龍井43品種）抓捕，于實驗室人工氣候室內(nèi)[溫度(25±2)℃，相對濕度(70±5)%，光周期L∶D=16∶8]，飼養(yǎng)在采集的龍井43茶枝上。

1.2 水狀唾液收集

小貫小綠葉蟬的唾液收集方法采用雙層Parafilm膜夾營養(yǎng)液法（圖1）。將Parafilm膜剪成6 cm×6 cm的小方塊，用75%酒精浸泡過夜后在超凈工作臺內(nèi)取出、晾干，并在紫外燈下照射滅菌1 h。第1層膜用雙手拉住其兩側(cè)，在酒精燈旁稍微加熱，然后慢慢向兩邊拉伸，直至膜逐漸變薄透明時，小心將膜覆蓋在玻璃管（玻璃管內(nèi)徑5 cm，高10 cm，兩端開口）管口上，壓實。用10 mL無菌注射器（Φ=0.2 μm）吸取2 mL 10%蔗糖溶液，用針頭式水系過濾膜過濾后滴加到Parafilm膜的中央位置。然后在蔗糖溶液上覆蓋第2層膜，操作同第1層膜，使兩層膜緊密接觸，適當(dāng)擠壓營養(yǎng)液使其在兩層膜間鋪滿，并避免產(chǎn)生氣泡；再在第2層膜上覆蓋一層較厚的 Parafilm膜，起到保護作用。將50頭饑餓處理后（饑餓2 h）葉蟬成蟲從玻璃管另一端放入，并在管口上覆蓋濕潤的透氣紗布，用橡皮筋綁緊。依據(jù)上述方法制作3個相同的唾液收集裝置，然后將收集裝置放入人工氣候室中[溫度(25±2)℃，相對濕度(70±5)%，光周期L∶D=16∶8]。待葉蟬取食24 h后，使用10 mL無菌注射器針頭穿過Parafilm膜上，緩慢吸出含有唾液的蔗糖溶液，將其轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中，液氮預(yù)冷后儲存在-80℃超低溫冰箱。試驗共收集了5 000頭葉蟬成蟲所取食過的蔗糖溶液。

圖1 小貫小綠葉蟬成蟲水狀唾液收集裝置Fig.1 Device for watery saliva collection of E.onukii adults

1.3 唾液蛋白質(zhì)提取和肽段酶解

取適量樣品，并加入等量的SDT（4%SDS，100 mmol·L-1Tris/HCl pH7.6，0.1 mol·L-1DTT）裂解液，超聲（100 W，工作10 s，間歇10 s，循環(huán)10次），沸水浴10 min后，14 000 g離心10 min，保留上清液；取 20 μL的上清液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），結(jié)束后染色。采用BCA法對純化后的水狀唾液蛋白質(zhì)進行定量，結(jié)束后分裝蛋白質(zhì)樣品，于-80℃超低溫冰箱保存。

FASP酶解法（Filter-aided sample preparation）酶解蛋白，取上述濃縮提純的唾液蛋白，采用C18Cartridge對肽段進行脫鹽處理，肽段凍干后加入40 μL 0.1%甲酸溶液復(fù)溶，最終對肽段進行定量（OD280）。詳細(xì)方法參考文獻[18]。

1.4 LC-MS/MS質(zhì)譜分析

按照上述定量結(jié)果，取適量酶解后產(chǎn)物，通過LC-MS/MS分析樣品。本試驗中蛋白分析鑒定工作由上海中科新生命生物科技有限公司完成。

樣品分析采用HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進行分離。流動相A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。95%的A相用作平衡色譜柱。樣品首先進樣到色譜柱（Thermo scientific EASY column，2 cm×100 μm，5 μm-C18），再經(jīng)分析柱（Thermo scientific EASY column，75 μm×100 mm，3 μm，C18）分離檢測，流速為300 nL·min-1。液相梯度洗脫流程為0～50 min，B相0%～35%；50～55 min，B相 35%～100%；55～60 min，B相100%。

質(zhì)譜參數(shù)及其設(shè)置如下：檢測方式為正離子模式，母離子掃描范圍為300～1 800 m/z，一級質(zhì)譜分辨率為70 000（m/z 200，質(zhì)荷比=200），自動增益目標(biāo)值為3e6，一級最大注入時間為50 ms，多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比為每次全掃描（Full scan）后采集20個碎片圖譜（MS2 scan），二級質(zhì)譜分辨率為17 500（m/z 200，質(zhì)荷比=200），微掃描為1，隔離窗口為2 m/z，二級最大注入時間為60 ms，MS2激活類型為高能誘導(dǎo)解離，歸一碰撞能量為27 eV，動態(tài)排除60.0 s，最小填充比為0.1%。

1.5 小貫小綠葉蟬唾液蛋白的鑒定

通過MaxQuant軟件，對原始文件（Raw file）進行數(shù)據(jù)庫檢索分析。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對選擇葉蟬科（Cicadellidae）UniProt數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org）和飛虱科（Delphacidae）UniProt數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org）。

蛋白質(zhì)搜庫參數(shù)設(shè)定如下：（1）酶為胰蛋白酶；缺失的裂解位點設(shè)為2；（2）固定修飾為Carbamidomethyl（C）；（3）動態(tài)修飾設(shè)定Oxidation（M）和Acety（Protein N-term）。數(shù)據(jù)庫檢索鑒定到的可信肽段和蛋白質(zhì)要通過設(shè)定的過濾參數(shù)FDR≤0.01。

1.6 小貫小綠葉蟬唾液蛋白的生物信息學(xué)分析

使用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行初步整理與分析，并用GraphPad Prism 8繪圖。采用Blast2Go（https://www.blast2go.com）軟件，通過基因本體（Gene ontology，GO）對所有鑒定到的唾液蛋白質(zhì)進行功能注釋。通過KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路數(shù)據(jù)庫對所有鑒定到的唾液蛋白進行KEGG信號通路分析。利用CELLO亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件，對所有鑒定到的唾液蛋白質(zhì)進行亞細(xì)胞定位分析。利用InterProScan結(jié)構(gòu)域預(yù)測軟件對所有鑒定到的唾液蛋白質(zhì)進行結(jié)構(gòu)域預(yù)測。利用CytoScape軟件，基于STRING或IntAct數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，對所有鑒定到的唾液蛋白質(zhì)構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 小貫小綠葉蟬唾液蛋白處理茶苗

選用一年半生健康、無蟲害的青心大冇茶樹盆栽苗進行分組處理，比較其癥狀表現(xiàn)的差異。機械損傷處理（T4）：用00#昆蟲針在芽下第二葉扎刺80針，造成葉片機械損傷，處理后用透氣尼龍網(wǎng)罩覆蓋。機械損傷+葉蟬水狀唾液蛋白處理（T1）：選取4盆機械損傷茶苗，將提取的葉蟬唾液蛋白（0.718 5 μg·μL-1）均勻地涂抹在機械損傷葉的葉片兩面，處理后用透氣尼龍網(wǎng)罩覆蓋。機械損傷+牛血清蛋白處理（T2）：選取4盆機械損傷茶苗，將牛血清蛋白（BSA標(biāo)準(zhǔn)品，上海吉至生化科技有限公司，1.00 μg·μL-1）均勻地涂抹在機械損傷葉的葉片兩面，處理后用透氣尼龍網(wǎng)罩覆蓋。葉蟬危害處理（T3）：選取健康的無蟲害茶苗4盆，分別用透氣尼龍網(wǎng)罩罩住，每盆放入30頭葉蟬成蟲。葉蟬水狀唾液蛋白處理（T5）：選取健康的無蟲害茶苗4盆，將提純的唾液蛋白均勻涂抹在健康葉片兩面，處理后用透氣尼龍網(wǎng)罩覆蓋。將處理后的茶苗放在相同的條件下[溫度(25±2)℃，相對濕度(70±5)%，光周期L∶D=16∶8]處理48 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉蟬唾液SDS-PAGE電泳結(jié)果

圖2為小貫小綠葉蟬濃縮后唾液蛋白的一維電泳圖，電泳結(jié)果顯示，葉蟬唾液蛋白分子量主要分布在30～100 kDa。

圖2 小貫小綠葉蟬成蟲水狀唾液蛋白分離電泳Fig.2 Electrophoresis of proteins in the watery saliva of E.onukii adults

2.2 唾液蛋白的鑒定

利用LC-MS/MS對葉蟬唾液中的蛋白質(zhì)進行分析鑒定，利用UniProt公共數(shù)據(jù)庫中葉蟬科（Cicadellidae）和飛虱科（Delphacidae）的數(shù)據(jù)與本研究鑒定結(jié)果進行比對。如圖3所示，與葉蟬科比對，共鑒定107個肽段和92個蛋白質(zhì)；與飛虱科比對，共鑒定91個肽段和76個蛋白質(zhì)；本研究重點關(guān)注葉蟬科比對的唾液蛋白質(zhì)，根據(jù)唾液蛋白質(zhì)的功能注釋和結(jié)構(gòu)域，將鑒定到的92個蛋白質(zhì)按功能大致分為7類（表1）：（1）酶類，包括水解酶、合成酶、轉(zhuǎn)移酶、裂解酶、氧化還原酶、抑制酶、內(nèi)肽酶、脫氫酶、蛋白激酶、ATP合成酶和RNA聚合酶等；（2）轉(zhuǎn)運蛋白，包括離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白、質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白和跨膜轉(zhuǎn)運蛋白等；（3）離子結(jié)合蛋白，包括陽離子結(jié)合蛋白、鎂離子結(jié)合蛋白、鈣離子結(jié)合蛋白和鋅離子結(jié)合蛋白等；（4）DNA、RNA、蛋白質(zhì)、化合物、神經(jīng)遞質(zhì)、藥物和酶結(jié)合或調(diào)節(jié)蛋白等；（5）骨架蛋白，包括微管細(xì)胞骨架、細(xì)胞骨架蛋白和聚合細(xì)胞骨架纖維等；（6）其他或非酶蛋白，包括細(xì)胞器部分、熱休克蛋白、核糖體蛋白、線粒體蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、組蛋白和肌動蛋白等；（7）未表征蛋白質(zhì)。

表1 LC-MS/MS鑒定到的小貫小綠葉蟬成蟲水狀唾液蛋白質(zhì)Table 1 Waterysalivaryproteins of E.onukii adults identified by LC-MS/MS

續(xù)表1-2

續(xù)表1-3

圖3 葉蟬科與飛虱科的肽段總數(shù)和蛋白質(zhì)總數(shù)Fig.3 The total number of peptides and proteins of Cicadellidae and Delphacidae

2.3 GO功能注釋分析

為了明確蛋白質(zhì)在生物體中的功能、定位以及所參與的生物學(xué)途徑，我們通過基因本體（Gene ontology，GO）對檢測到的蛋白質(zhì)進行功能注釋。唾液蛋白GO功能注釋在第二水平主要分為3類：生物過程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）和細(xì)胞組分（Cellular component，CC）[19]。圖4是葉蟬科數(shù)據(jù)比對蛋白質(zhì)的結(jié)果，GO功能注釋分析表明，有59個蛋白質(zhì)富集在生物過程的9個小類中；有81個蛋白質(zhì)富集在分子功能的6個小類中；有70個蛋白質(zhì)富集在細(xì)胞組分的11個小類中。

圖4 小貫小綠葉蟬成蟲水狀唾液蛋白GO功能分類圖Fig.4 Gene ontology classification of water salivary proteins in E.onukii adults

對比葉蟬科數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，分子功能中注釋的蛋白質(zhì)數(shù)量最多，結(jié)合（Binding，GO:0005488）和催化活性（Catalytic activity，GO:0003824）是注釋蛋白質(zhì)較多的2個小類，分別有42個和29個蛋白質(zhì)；其次是細(xì)胞組分中注釋的蛋白質(zhì)，這個部分的注釋類別最多，有 11個小類，其中細(xì)胞部分（Cell part，GO:0044464）和細(xì)胞（Cell，GO:0005623）是注釋蛋白質(zhì)較多的兩個小類，均有15個；生物過程是注釋蛋白最少的一個大類，細(xì)胞過程（Cellular process，GO:0009987）和代謝過程（Metabolic process，GO:0008152）是其注釋蛋白質(zhì)數(shù)量較多的2個小類，分別有27個和20個。

2.4 KEGG通路分析

通過KEGG通路數(shù)據(jù)庫對鑒定到的蛋白質(zhì)進行解析注釋。本研究選取前20個蛋白質(zhì)所富集的KEGG途徑，以預(yù)測哪些通路中參與的蛋白質(zhì)數(shù)量最多（圖5）。葉蟬科比對結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)數(shù)目較多的通路為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）、脂肪酸延長（Fatty acid elongation）、氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、丙酸鹽代謝（Propanoate metabolism）、RNA降解（RNA degradation）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）和吞噬體（Phagosome）。

在生物體內(nèi)，不同種類的蛋白質(zhì)相互協(xié)調(diào)并行使其生物學(xué)功能，我們在前一步研究的基礎(chǔ)上基于Pathway分析，有助于進一步了解其生物學(xué)功能富集不同層級的結(jié)果[20]。Pathway分析顯示，在葉蟬科比對的結(jié)果中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路上的蛋白質(zhì)最多（圖5），涉及的蛋白質(zhì)有熱休克蛋白83（A0A1B6FSZ4）和2個未表征蛋白質(zhì)（A0A1B6EU18、A0A1B6L8R6），未表征蛋白都具有一定的特征，本結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的2個未表征蛋白質(zhì)具有顯示區(qū)域和顯示蛋白質(zhì)盤繞線圈的特征。脂肪酸延長通路上涉及到超長鏈脂肪酸延伸蛋白質(zhì)（A0A1B6FUC0）和1個未表征蛋白（A0A1B6KZE3）。氧化磷酸化通路涉及到ATP合酶亞單位α（A0A1B6G670）和ATP合酶亞單位β（A0A1B6JZM5）。丙酸鹽代謝通路涉及CoA-連接酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)（A0A1B6F7H0）和1個未表征蛋白（A0A1B6KZE3）。RNA降解通路涉及到2個未表征蛋白（A0A1B6LLI5，A0A1B6GWG5）。HIF-1信號通路涉及MFS結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)（A0A1B6IBR0）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（A0A1B6ERY9）。吞噬體通路中涉及含微管蛋白C結(jié)構(gòu)域蛋白（A0A1B6JSL4）和肌動蛋白1（A0A125RA10）。其中還有其他比對到的通路，因涉及到人類疾病相關(guān)通路，與本研究樣本物種不相關(guān)，故未進行詳細(xì)說明。

圖5 小貫小綠葉蟬成蟲水狀唾液蛋白KEGG信號通路分析（Top20）Fig.5 KEGG pathway classification of watery salivary proteins in E.onukii adults (Top20)

2.5 唾液蛋白亞細(xì)胞定位分析

亞細(xì)胞器（Subcellular organelle）是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的微器官（如線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等），它們具有一定的形態(tài)和功能，不同的亞細(xì)胞器行使不同的功能，同時它們也是蛋白質(zhì)發(fā)揮不同作用的重要場所。本研究發(fā)現(xiàn)，葉蟬科數(shù)據(jù)定位結(jié)果顯示，唾液蛋白都主要集中在細(xì)胞核（Nuclear）、細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasmic）和線粒體（Mitochondrial）中，本研究所收集葉蟬唾液的蛋白質(zhì)大多來源于細(xì)胞核中（圖6）。

圖6 唾液蛋白亞細(xì)胞器定位Fig.6 Subcellular organelles localization of salivary proteins

2.6 唾液蛋白結(jié)構(gòu)域分析

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（Domain）是保持其結(jié)構(gòu)獨特性的最基本單元。在蛋白質(zhì)相互作用中往往以結(jié)構(gòu)域為單位，若其內(nèi)部氨基酸發(fā)生改變，可能引起蛋白質(zhì)關(guān)鍵性功能的變化。本研究對所有唾液蛋白進行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，選取前20個結(jié)構(gòu)域進行展示。與葉蟬科比對結(jié)果顯示，有3個結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)富集較多，分別是延伸因子Tu-GTP結(jié)構(gòu)域（Elongation factor Tu GTP binding domain）、延伸因子Tu結(jié)構(gòu)域2（Elongation factor Tu domain 2）和ATP合成酶 α/β家族，核苷酸結(jié)合域（ATP synthase alpha/beta family，nucleotide-binding domain）；這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域所涉及到的蛋白質(zhì)有ATP合酶亞單位β（A0A1B6JZM5）、ATP合酶亞單位α（A0A1B6G670）、ATP-synt_ab結(jié)構(gòu)域的蛋白（A0A1B6HPD6）、延伸因子Tu，線粒體（A0A1B6IN76、A0A1B6IN76、A0A1B6I8F3）、延伸因子-1α（Q9NJ26）、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶（A0A1B6HWC4）和非特征蛋白質(zhì)（A0A1B6J3L8）（圖7）。

圖7 唾液蛋白結(jié)構(gòu)域分析圖（Top20）Fig.7 Analysis of salivary protein domain (Top20)

2.7 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

蛋白質(zhì)之間的相互作用是蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的重要方式之一。我們對鑒定到的唾液蛋白質(zhì)進行了蛋白與蛋白相互作用（Protein protein interaction，PPI）分析。結(jié)果表明，連接度在“10”以上的蛋白質(zhì)有5個，分別是延伸因子-1α（Q9NJ26）、ATP合酶亞單位α（A0A1B6G670）、ATP合酶亞單位β（A0A1B6JZM5）、熱休克蛋白83（A0A1B6FSZ4）和1個顯示盤繞線圈特征的未表征蛋白質(zhì)（圖8）。

圖8 唾液蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.8 Salivary protein interaction network

2.8 葉蟬唾液蛋白處理結(jié)果分析

從圖9可以看出，處理48 h后，不同處理組葉片呈現(xiàn)不同的變化。T3處理12 h時葉尖及其周圍的葉片邊緣稍微內(nèi)卷；24 h時大部分葉緣呈現(xiàn)內(nèi)卷狀態(tài)，葉脈開始紅變，葉片質(zhì)地更柔軟，葉色暗淡，葉緣附近出現(xiàn)黃化；48 h時葉片呈現(xiàn)出了重度危害狀態(tài)，葉片柔軟似萎凋狀，葉尖和葉緣重度內(nèi)卷，幼嫩的芽頭首先出現(xiàn)葉蟬燒狀，葉色暗淡并失去光澤，葉片正在向紅褐色轉(zhuǎn)變，其中芽下一葉較為明顯。T1處理與T3處理的葉片變化趨勢基本一致，但主要集中在機械損傷針口附近，12 h時針口損傷處的葉片開始紅變，葉緣稍卷曲；24 h時針口損傷處的面積增大，以針口為圓心逐漸向周圍擴散并紅變，葉尖呈現(xiàn)卷曲狀，葉色逐漸開始黃化；48 h時針口損傷附近的紅變程度進一步增大，相鄰較近的針口連成一片，針口附近的葉脈紅變，葉緣卷曲并呈現(xiàn)黃化狀態(tài)，葉片光澤稍顯暗淡。葉蟬唾液蛋白處理后的葉片表觀癥狀主要集中在處理葉上，其他未處理葉片無明顯變化。而T2、T4和T5處理葉片在12、24 h和48 h時葉片均未出現(xiàn)包含葉蟬燒狀在內(nèi)的蟲害癥狀，仍呈現(xiàn)挺立狀態(tài)且具有光澤，只是隨著時間的推移機械損傷口的面積逐漸增大，其原因可能與植物傷口愈合有關(guān)。

圖9 不同處理茶樹葉片變化Fig.9 Changes of tea leaves under different treatments

3 討論

刺吸式口器昆蟲以其獨特的針狀口器吸食寄主植物的汁液，其分泌的唾液是連接兩者之間的重要媒介。昆蟲分泌唾液有助于自身取食，唾液中的有效成分不僅可以幫助昆蟲穿刺植物表皮，還參與了自身消化與解毒等反應(yīng)，所以昆蟲唾液在昆蟲與植物的互作和協(xié)同進化中起到了關(guān)鍵性作用[21]。為了解小貫小綠葉蟬與茶樹之間的相互作用，我們利用LC-MS/MS對葉蟬的水狀唾液成分進行了分析，由于小貫小綠葉蟬還沒有蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，因此我們將鑒定到的水狀唾液蛋白與葉蟬科蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，共鑒定到92個蛋白質(zhì)，按不同功能將其分為7類，酶類的蛋白質(zhì)數(shù)量最多，其可能在葉蟬生命活動中具有重要作用。

目前有關(guān)刺吸式口器昆蟲水狀唾液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究大多集中于蚜蟲或飛虱上，關(guān)于葉蟬水狀唾液蛋白的研究較少。蚜蟲水狀唾液蛋白中發(fā)現(xiàn)含有延伸因子、核糖體蛋白和ATP合酶等蛋白質(zhì)，這幾種蛋白質(zhì)在本研究中也都有鑒別到[22]。有研究表明刺吸式昆蟲蝽類的唾液酶常包括淀粉酶、蛋白酶和轉(zhuǎn)化酵素酶等；在馬鈴薯葉蟬的唾液中也發(fā)現(xiàn)了具有類似淀粉酶一樣作用的酶，其主要功能是幫助昆蟲將食物消化[23-24]。本結(jié)果中雖然沒有鑒定到淀粉酶，但是鑒定到了甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH），該酶是糖酵解反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，所以推測該酶的主要作用是在葉蟬取食時與唾液一同分泌，參與食物消化[25]。此外，在代謝過程中鑒定到的硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶、含ATP合酶結(jié)構(gòu)域蛋白、含烯醇化酶 N結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)、含 MutL-C結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)、DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶、含RPOLD結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)、組蛋白H4、40S核糖體蛋白S8、超長鏈脂肪酸延伸蛋白質(zhì)、甲酰四氫葉酸脫氫酶、含Clp R結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)等，可能是為昆蟲自身代謝過程提供底物和能量的蛋白質(zhì)。

Shao等[16]對小貫小綠葉蟬的唾液腺和腸道進行了轉(zhuǎn)錄組和蛋白組聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)半翅目昆蟲腸道中的主要消化酶是半胱氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶，這與前人研究結(jié)果一致[26]。而在本研究中并沒有鑒定到這兩種消化酶，分析其主要原因是本研究鑒定的是體外蛋白，而Shao等[16]主要研究的是體內(nèi)蛋白，其保存效果和蛋白質(zhì)活性都會高于體外。Wu等[27]研究認(rèn)為，葉蟬唾液中的鈣離子結(jié)合蛋白是介導(dǎo)病毒從昆蟲向水稻韌皮部傳播的載體，鈣離子結(jié)合蛋白減少，植物細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，進而產(chǎn)生大量愈傷組織和過氧化氫，導(dǎo)致葉蟬頻繁的刺探植物，增加了病毒傳播。值得注意的是，本研究中也發(fā)現(xiàn)了鈣離子結(jié)合蛋白，但是有關(guān)葉蟬唾液在茶樹中傳播病毒的報道尚未發(fā)現(xiàn)。我們推測小貫小綠葉蟬的頻繁刺探并分泌唾液蛋白的行為也可能會使茶樹產(chǎn)生大量愈傷組織或胼胝質(zhì)，這一作用可能與葉蟬燒形成有關(guān)。Backus等[28]分析認(rèn)為，葉蟬口針刺吸過程會引發(fā)了植物傷口的反應(yīng)，釋放的唾液能夠加劇這一反應(yīng)，進而形成葉蟬燒。本研究還發(fā)現(xiàn)了許多其他或非酶蛋白，其潛在功能還尚未挖掘，對于這些非特征蛋白質(zhì)還需進一步研究。

本研究將提取到的葉蟬唾液蛋白涂抹在機械損傷處理的茶樹葉片傷口處，48 h后葉片出現(xiàn)了類似葉蟬燒的癥狀，但局限于機械損傷的針口附近。單純的機械損傷、唾液蛋白和機械損傷+牛血清蛋白處理的茶樹葉片并未出現(xiàn)類似葉蟬燒的癥狀。機械損傷和機械損傷+牛血清蛋白處理僅造成了葉片局部壞死，這種情況與健康植株的創(chuàng)傷反應(yīng)較為一致[26]。而機械損傷+葉蟬唾液蛋白處理引起的葉片癥狀與葉蟬危害后的葉片癥狀相似，但是沒有葉蟬危害的程度嚴(yán)重，可能因為葉蟬取食是一個持續(xù)損傷的過程。與單純的機械損傷處理葉片相比，在葉片機械損傷處涂抹葉蟬唾液，會加重葉片的受害程度，可能由于葉蟬唾液中的某些物質(zhì)發(fā)揮作用，但具體是哪些物質(zhì)尚不清楚。后續(xù)將繼續(xù)挖掘相關(guān)蛋白質(zhì)，尋找出與葉蟬唾液中與葉片葉蟬燒形成相關(guān)的蛋白質(zhì)。

本研究首次獲得小貫小綠葉蟬水狀唾液蛋白的相關(guān)信息，鑒定到了多種已報到參與葉蟬生命歷程相關(guān)的蛋白質(zhì)，有些來源不確定或可能不是關(guān)鍵蛋白質(zhì)，但是它們在葉蟬的行為活動中可能發(fā)揮著舉足輕重的作用。本結(jié)果為進一步研究葉蟬與茶樹之間的互作關(guān)系提供了基礎(chǔ)信息。