謝菁， 周艷麗， 陳思思， 王繼春， 江洪

視黃醇結(jié)合蛋白1通過激活TAK1促進大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大*

謝菁， 周艷麗， 陳思思， 王繼春， 江洪△

（武漢大學人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢大學心血管病研究所，心血管病湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430000）

探究視黃醇結(jié)合蛋白1（retinol binding protein 1， Rbp1）在大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大中的功能和機制。本研究通過聯(lián)合分析基因表達數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus， GEO）中的小鼠心肌肥厚基因芯片數(shù)據(jù)，尋找在心肌肥厚發(fā)生過程中的關鍵調(diào)控因子，構(gòu)建該基因過表達及敲減腺病毒并感染大鼠乳鼠原代心肌細胞，利用血管緊張素II（angiotensin II， Ang II）誘導大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大模型，研究目的基因?qū)Υ笫笕槭笤募〖毎蚀蟮挠绊?，應用Western blot及RT-qPCR探究目的基因調(diào)控大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大的分子機制。在小鼠心肌肥厚心臟組織中的表達顯著上調(diào)（<0.01），體外細胞實驗顯示與對照組相比，過表達組的大鼠乳鼠原代心肌細胞面積顯著增大，心肌肥厚標志基因心鈉肽（atrial natriuretic peptide，）和肌球蛋白重鏈7（myosin heavy chain 7，）的表達顯著升高（<0.01），證實過表達能促進Ang II誘導的大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大；相反，敲減則能顯著抑制Ang II誘導的大鼠乳鼠原代心肌細胞面積增加和心肌肥厚標志物表達。機制研究顯示，過表達顯著激活轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1（transforming growth factor-β-activated kinase 1， TAK1）和P38（<0.01），應用TAK1抑制劑可阻斷過表達對Ang II誘導大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大的促進作用。Rbp1可通過激活TAK1信號通路促進Ang II誘導的大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大。

視黃醇結(jié)合蛋白1；大鼠乳鼠原代心肌細胞；心肌肥大；TAK1/P38信號通路

心力衰竭是心室充盈和（或）射血功能受損，心臟排血量不能滿足機體組織代謝需要的臨床綜合征，是臨床上心肌肥厚等多種心血管疾病的最終結(jié)局［1］。心肌肥厚是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的一個基本病理過程。眾多基礎研究提示，心肌肥厚是一個復雜的、眾多基因和信號通路參與的病理過程［2］，且目前臨床上缺乏有效藥物。因此，闡明心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找調(diào)節(jié)心肌肥厚的關鍵靶點具有重要意義。

視黃醇結(jié)合蛋白（retinol binding protein， Rbp）是人體內(nèi)視黃醇轉(zhuǎn)運蛋白，主要幫助肝臟中視黃醇的轉(zhuǎn)移，并協(xié)助視黃醇進行代謝、存儲、發(fā)揮作用，半衰期較短，能敏感的反映機體的疾病狀態(tài)［3］。既往研究提示Rbp1可驅(qū)動維生素A為活性代謝產(chǎn)物全反視黃酸（all--retinoic acid， ATRA），ATRA可調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡、分化及遷移［4-5］。此外，Rbp1還參與生物體內(nèi)多個生理過程如肥胖及血脂代謝異常等［6］，但Rbp1在心肌肥厚中的作用還未見報道。本項工作通過腺病毒感染大鼠乳鼠原代心肌細胞和PE誘導的大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大模型，探討Rbp1對大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大的影響。

材料和方法

1　主要試劑

BCA蛋白試劑盒（Thermo Scientific）； PVDF膜（Millipore）；抗Rbp1抗體（ABclonal）；抗TAK1單克隆抗體（Abcam）；p-P38單克隆抗體、P38多克隆抗體、p-TAK1單克隆抗體及GAPDH單克隆抗體（Cell Signaling Technology）；化學發(fā)光底物試劑（Bio-Rad）；Trizol總RNA提取試劑（Invitrogen）； cDNA轉(zhuǎn)錄合成試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix（Roche）；DMEM/F12培養(yǎng)液（Gibco）；胎牛血清（Gibco）；抗輔肌動蛋白α（α-actinin）抗體（Merck Millipore）；TAK1抑制劑NG52（MedChemExpress）；其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純；所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2　主要方法

2.1生物信息學分析借助R包GEOquery （Davis and Meltzer， 2007）從美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information， NCBI）的GEO數(shù)據(jù)庫下載對應數(shù)據(jù)集的原始數(shù)據(jù)及芯片探針對應的基因名稱注釋文件，隨后使用R包寡核苷酸（Carvalho and Irizarry， 2010）中的函數(shù)（read.celfiles）讀取芯片原始數(shù)據(jù)，并使用RMA（Robust Multiarray Average）算法對原始數(shù)據(jù)進行背景校正，使用分位數(shù)方法進行樣本間的標準化，運用統(tǒng)計學方法將前面得到的熒光強度值從探針水平匯總到探針組水平，再將匯總后的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為以2為底的對數(shù)，經(jīng)過RMA函數(shù)運算得到標準化后的探針表達量矩陣，根據(jù)得到的注釋文件，對探針組名稱進行基因名稱注釋，最終得到基因的表達量矩陣。計算不同組別之間基因的表達差異，根據(jù)基因表達量差異，去除重復的基因，保留重復基因中差異最大的一個。使用檢驗對不同組進行統(tǒng)計學檢驗，依據(jù)倍數(shù)多少和值確定差異基因。

2.2大鼠乳鼠原代心肌細胞的分離和培養(yǎng)選1～2日齡SD大鼠乳鼠［湖北省實驗動物研究中心，許可證號：SCXK（鄂）2020-0018］，大鼠乳鼠原代心肌細胞分離培養(yǎng)方法參照如前所述［8］，具體方法簡述如下：取SD大鼠乳鼠心臟剝離血管成分，剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，加入0.125%胰蛋白酶進行消化，加入DMEM/F12培養(yǎng)液［含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和0.1 mmol/L 5-溴脫氧尿苷（抑制成纖維細胞生長）］培養(yǎng)24 h差時貼壁，分離大鼠乳鼠原代心肌細胞后，使用腺病毒感染大鼠乳鼠原代心肌細胞，6 h后更換為無血清培養(yǎng)液進行饑餓處理12 h，然后加入1 μmol/L Ang II刺激48 h，對照加入等量的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline， PBS），整個細胞培養(yǎng)在37.0 ℃、5% CO2條件下進行。

2.3大鼠乳鼠原代心肌細胞α-actinin免疫熒光染色大鼠乳鼠原代心肌細胞免疫熒光染色方法參照如前所述［7］，具體方法簡述如下：大鼠乳鼠原代心肌細胞經(jīng)Ang II刺激培養(yǎng)48 h后，加入4%甲醛固定30 min，再加入0.1% Triton X-100透化后加入10%牛血清白蛋白室溫下封閉，加入α-actinin抗體（1∶100稀釋）孵育，隨后加入Ⅱ抗［驢抗鼠IgG （H+L）， Invitrogen， 1∶200稀釋）及DAPI（染核），使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量大鼠乳鼠原代心肌細胞的表面積。

2.4RT-qPCR檢測RT-qPCR的方法參照文獻［7］，具體簡述如下：取小鼠心臟左心室組織（來自武漢大學李紅良教授饋贈）或大鼠乳鼠原代心肌細胞樣本加入Trizol試劑提取總RNA，使用cDNA轉(zhuǎn)錄合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，隨后在一定體系下加入SYBR Green PCR Master Mix在RT-qPCR儀中檢測待測基因的表達量，同時以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，）為內(nèi)參基因，所使用的引物序列見表1。

表1　RT-qPCR引物序列

2.5Western blot實驗Western blot的方法參照如前所述［8］，具體簡述如下：收集處理過的大鼠乳鼠原代心肌細胞樣本并加入RIPA裂解液進行裂解，充分裂解后離心，取上清為總蛋白，使用BCA蛋白試劑盒進行定量，上樣相同質(zhì)量總蛋白于10% SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，隨后放入5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，TBST清洗PVDF膜3次，每次5 min，加入Ⅰ抗4 ℃孵育過夜。TBST清洗，加入對應種屬的Ⅱ抗（Jackson ImmunoResearch）室溫孵育1 h。用化學發(fā)光底物顯色，伯樂凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDoc XRS+）收集信號。使用Image Lab（Version5.1）軟件分析結(jié)果。

2.6載體構(gòu)建載體構(gòu)建的方法參照如前所述［7］，具體簡述如下：將基因亞克隆到巨細胞病毒啟動子控制下的復制缺陷型腺病毒（adenovirus，Ad）載體中并用于過表達，以表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）為對照。攜帶靶向的短發(fā)夾RNA（short-hairpin RNA，shRNA）的復制缺陷型腺病毒載體用于敲減（sh）表達，同時以對照shRNA腺病毒作為對照（shCT）。腺病毒以50個顆粒/細胞的感染復數(shù)（multiplicity of infection， MOI）感染大鼠乳鼠原代心肌細胞24 h，隨后進行檢測鑒定。過表達及敲減引物為：

Ad-Rat-F：GGCTAGCGATATCGGATCCGCCA-CCATGCCTGTGGACTTCAACGG；Ad-Rat-R： CGT-CCTTGTAATCACTAGTGTGTACTTTCTTAAACACTTG-CTTGCAG；Adsh-Rat-F： CCGGGGTACTGGAAGATGCTGAGCACTCGAGTGCTCAGCATCTTCCAGTACCTTTTTG；Adsh-Rat-R：AATTCAAAAAGGTACTGGAAGATGCTGAGCACTCGAGTGCTCAGCA-TCTTCCAGTACC。

2.7TAK1的抑制劑（inhibitor of TAK1， iTAK1）處理大鼠乳鼠原代心肌細胞對應的腺病毒分別感染大鼠乳鼠原代心肌細胞后，加入2.5×10-6mol/L二甲基亞砜（DMSO）溶解的iTAK1-NG52，對照組加入等量DMSO，與此同時再加入1×10-6mol/L Ang II刺激48 h后收集大鼠乳鼠原代心肌細胞樣本進行檢測。

3　統(tǒng)計學處理

本課題所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計均采用均數(shù)±標準差（mean±SD）的形式，兩組間數(shù)據(jù)比較使用雙尾檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析，并使用檢驗（假定方差齊）或（假定方差不齊）校正。SPSS（Statistical Package for the Social Sciences）25.0 軟件分析數(shù)據(jù)，<0.05為有統(tǒng)計學差異。

結(jié)果

1　Rbp1表達水平在小鼠心肌肥厚中顯著上調(diào)

本研究通過生物信息學分析5個小鼠主動脈縮窄手術誘導的小鼠心肌肥厚模型基因芯片數(shù)據(jù)庫，樣本情況詳見表2，根據(jù)<0.05與Fold change>1.5篩選上調(diào)差異基因，<0.05與Fold change<0.667篩選下調(diào)差異基因，分別獲得102、218、293、410和98個差異表達基因，見圖1A；聯(lián)合分析后，獲得11個在4個及以上芯片數(shù)據(jù)庫結(jié)果中均顯著改變的差異基因，見圖1B；其中和在心肌肥厚中的功能未知，見圖1C；隨后，應用RT-qPCR檢測對照假手術（sham）和主動脈結(jié)扎（aortic banding， AB）手術4周的小鼠心臟組織中上述差異基因的表達，結(jié)果顯示與sham組比較，在AB組中的表達改變最為顯著（<0.01），見圖1D。

表2　小鼠心肌肥厚相關GEO數(shù)據(jù)庫

Figure 1.　Combined analysis of mouse cardiac hypertrophy microarray data to search for the key regulatory genes in the process of cardiac hypertrophy. A： the number of differentially expressed genes in each cardiac hypertrophy microarray data from GEO database； B： Venn diagram of 5 cardiac hypertrophy microarray data from GEO database； C： heat map of genes significantly changed in more than 4 cardiac hypertrophy microarray data； D： relative mRNA expression of target genes in heart of cardiac hypertrophy mice after sham or aortic banding （AB） surgery for 4 weeks. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs sham group.

2　Rbp1敲減抑制Ang II誘導的大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，敲減組Rbp1蛋白水平顯著下調(diào)，證實敲減成功，見圖2A；α-actinin免疫熒光染色及RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，敲減能顯著抑制大鼠乳鼠原代心肌細胞表面積增大（<0.01），并顯著下調(diào)肥大標志基因和的表達（<0.01），見圖2B、2C。

Figure 2.　Knockdown of Rbp1 inhibited Ang II-induced primary neonatal rat cardiomyocyte hypertrophy. A： the protein level of Rbp1 in primary neonatal rat cardiomyocytes with knockdown of Rbp1（AdshRbp1） and control primary neonatal rat cardiomyocytes （AdshCT） groups； B： representative immunofluorescence images of anti-α-actinin staining and its statistical results in the indicated groups （scale bar=20 μm）； C： relative mRNA levels of Anp and Myh7 in the indicated groups. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs AdshCT PBS group； ##P<0.01 vs AdshCT Ang II group.

3　Rbp1過表達促進Ang II誘導的大鼠乳鼠原代心肌細胞的肥大

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達組Rbp1蛋白表達水平顯著上調(diào)，證實Rbp1過表達成功，見圖3A；α-actinin免疫熒光染色及RT-qPCR檢測結(jié)果表明，過表達顯著促進了大鼠乳鼠原代心肌細胞表面積大小及肥大標志基因和的表達（<0.01），見圖3B、C。

Figure 3.　Overexpression of Rbp1 promoted Ang II-induced primary neonatal rat cardiomyocyte hypertrophy. A： the protein level of Rbp1 in primary neonatal rat cardiomyocytes overexpressing Rbp1 （AdRbp1） and control primary neonatal rat cardiomyocytes （AdGFP） groups； B： representative immunofluorescence images of anti-α-actinin staining and its statistical results in the indicated groups （scale bar=20 μm）； C： relative mRNA levels of Anp and Myh7 in the indicated groups. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs AdGFP PBS group； ##P<0.01 vs AdGFP Ang II group.

4　Rbp1顯著激活TAK1-P38信號通路

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，敲減顯著抑制了AngII誘導引起的TAK1和P38的活性升高（<0.01），而過表達則顯著促進了TAK1和P38活性（<0.01），見圖4。

Figure 4.　Rbp1 activated TAK1/P38 signaling pathway in primary neonatal rat cardiomyocytes. The protein levels of p-TAK1， TAK1， p-P38 and P38 were detected after Rbp1 knockdown （A） or overexpression （B）. Mean±SD. n=3. ##P<0.01 vs AdshCT Ang II group； **P<0.01 vs AdGFP Ang II group.

5　TAK1抑制劑阻斷Rbp1對大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大的促進作用

Western blot檢測、α-actinin免疫熒光染色和RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，NG52顯著抑制TAK1和下游P38活性，見圖5A；并且NG52顯著抑制了過表達誘導的大鼠乳鼠原代心肌細胞表面積增加（<0.01），同時還顯著下調(diào)肥大標志基因和的表達（<0.01），見圖5B、C。

Figure 5.　Inhibition of TAK1 activity blocked the promotional effect of Rbp1 overexpression on Ang II-induced primary neonatal rat cardiomyocytes hypertrophy. A： the protein levels of Rbp1， p-TAK1， TAK1， p-P38 and P38 in Ang II-stimulated AdRbp1 and AdGFP with TAK1 inhibitor （iTAK1） or DMSO as control （CT） in primary neonatal rat cardiomyocytes； B： representative immunofluorescence images of anti-α-actinin staining and its statistical results in the indicated groups （scale bar=20 μm）； C： relative mRNA levels of Anp and Myh7 in the indicated groups. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs AdGFP CT Ang II group； ##P<0.01 vs AdRbp1 CT Ang II group.

討論

據(jù)報道，細胞內(nèi)的多種信號通路如MAPK、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B， PI3K/AKT）、鈣調(diào)磷酸酶（calcineurin）/活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T-cells， NFAT）等參與心肌肥厚的調(diào)控［10-12］。這些信號通路在刺激信號的傳導下，調(diào)控細胞核中的基因轉(zhuǎn)錄、線粒體功能、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和炎癥應答等大量分子事件，進而調(diào)控心肌細胞中大量蛋白質(zhì)合成和成纖維細胞表型轉(zhuǎn)換［13-14］。Rbp是人體內(nèi)視黃醇轉(zhuǎn)運蛋白家族，包含6個家族成員，以往研究表明Rbp4通過激活Toll樣受體4（toll-like receptor 4， TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88， MyD88）炎癥通路可以促進胰島素抵抗和心肌細胞肥大，血清中Rbp4的增加與高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病有密切聯(lián)系［15］，提示Rbp家族可能參與心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。研究報道Rbp1影響細胞分化和腫瘤進展［16］，但是Rbp1在心肌肥厚中的功能并不清楚。本研究通過生物信息學方法聯(lián)合分析小鼠心肌肥厚數(shù)據(jù)庫，觀察在數(shù)據(jù)庫中的表達顯著升高，并在心肌肥厚小鼠心臟組織中得到驗證。應用Ang II刺激大鼠乳鼠原代心肌細胞構(gòu)建體外大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大模型［17-18］，并通過腺病毒在大鼠乳鼠原代心肌細胞中敲減或過表達后證實Rbp1能促進Ang II誘導的大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大。

MAPK信號通路參與病理性心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展，MAPK信號由MAP3K-MAP2K-MAPK級聯(lián)組成，TAK1是MAP3K家族的成員，廣泛參與細胞生命活動［19-20］。在刺激后，TAK1磷酸化并激活MAPKKs（MKK3/6、MKK4/7）和下游底物，包括P38、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）［21］，而P38激活可以刺激下游肥大基因的表達，促進心肌細胞肥大［22-23］。為了探討Rbp1是否通過影響MAPK通路進而調(diào)控大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大，本研究檢測TAK1和下游P38蛋白。結(jié)果顯示，過表達顯著激活TAK1以及下游P38。同時為了進一步驗證Rbp1對大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大的影響是否依賴于TAK1的激活，本研究使用TAK1的抑制劑NG52處理大鼠乳鼠原代心肌細胞，結(jié)果表明NG52可以逆轉(zhuǎn)Ang II刺激下Rbp1對大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大的影響，與此前TAK1及P38的相關報道一致［24-25］。本研究也存在不足，未在動物體內(nèi)研究Rbp1對心肌肥厚的調(diào)控作用，同時也未探究Rbp1調(diào)控TAK1活性的具體機制，這些科學問題有待在以后的研究中深入探討。

綜上所述，本項工作揭示了Rbp1在Ang II誘導的大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大模型中，通過激活MAPK信號通路中的TAK1和下游P38分子促進大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大。

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Retinol binding protein 1 promotes hypertrophy of primary neonatal rat cardiomyocytes via activating TAK1

XIE Jing， ZHOU Yanli， CHEN Sisi， WANG Jichun， JIANG Hong△

（，，，，，430000，）

To investigate of the function and mechanism of retinol binding protein 1 （Rbp1） in the hypertrophy of primary neonatal rat cardiomyocytes.The microarray data from Gene Expression Omnibus （GEO） database was analyzed to identify the key regulatory factors in the process of cardiac hypertrophy. In order to explore the function of the key gene in the hypertrophy induced by angiotensin II （Ang II）， overexpression and knockdown adenoviruses were constructed to infect primary neonatal rat cardiomyocytes. Western blot and RT-qPCR were used to explore the mechanism of the key gene regulating hypertrophy of primary neonatal rat cardiomyocytes.The expression ofwas significantly up-regulated （<0.01） in the heart of mouse cardiac hypertrophy models. Moreover，experimentsshowed that compared with control group， the area of primary neonatal rat cardiomyocytes and the expression of cardiac hypertrophy marker gene atrial natriuretic peptide （） and myosin heavy chain 7 （） was significantly increased in Rbp1 overexpression group， indicating that overexpression of Rbp1 promotes Ang II-induced primary neonatal rat cardiomyocytes hypertrophy. On the contrary， knockdown ofdramatically inhibited the increase in primary neonatal rat cardiomyocyte area and the expression of cardiac hypertrophy markers induced by Ang II. Overexpression ofactivated transforming growth factor-β-activated kinase 1 （TAK1） and its downstream target P38 （<0.01）. Treatment with TAK1 inhibitor blocked the effect ofoverexpression on Ang II-induced primary neonatal rat cardiomyocyte hypertrophy.The Rbp1 promotes Ang II-induced primary neonatal rat cardiomyocyte hypertrophy by activating the TAK1/P38 signaling pathway.

retinol binding protein 1； primary neonatal rat cardiomyocytes； cardiomyocyte hypertrophy； TAK1/P38 signaling pathway

R541.6； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.005

1000-4718（2023）02-0233-08

2022-09-02

2022-12-19

［基金項目］中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金青年教師資助項目（No. 2042019kf0093）

Tel： 027-88041911； E-mail： hongj0505@126.com

（責任編輯：宋延君，李淑媛）