王佳妮，于凱雯，徐方旭，王升厚，王 澤*

(1.沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽 110034；2.沈陽師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧沈陽 110034)

氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)這一概念最早由衰老研究權(quán)威Sohal教授在1985年提出。正常情況下，生物體處于氧化與抗氧化的動態(tài)平衡狀態(tài)，受到有害刺激時(shí)，體內(nèi)的活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)或活性氮自由基(reactive nitrogen species, RNS)會大量產(chǎn)生和蓄積，進(jìn)而對生物大分子活性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生嚴(yán)重的破壞[1]，引起復(fù)雜的生理或病理損傷過程，如糖尿病、高血壓、肝病、癌癥等[2-4]。近年來，人工合成的抗氧化劑因其安全隱患備受爭議，如過量使用會引起致畸、癌變以及一些慢性疾病等危害，從天然生物資源中尋找有效的抗氧化物質(zhì)用于維持人體及動物健康成為新的研究焦點(diǎn)[5]。

蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(L.ex Fr.) Link.]分類學(xué)上屬麥角菌科、蟲草屬，是我國傳統(tǒng)的食藥兩用真菌。研究顯示，蛹蟲草具有豐富的、非營養(yǎng)素類的抗氧化活性成分，其體外抗氧化活性得到了較為廣泛的解讀[6-8]。其中，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是抗氧化酶系的重要組成成員，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用，蛹蟲草含有真核生物超氧化物歧化酶全部種類的同工酶Cu-SOD、Zn-SOD、Mn-SOD和 Fe-SOD[9]，且具有熱穩(wěn)定性高、酶活不受pH影響等優(yōu)勢[10]。此外，蛹蟲草黃色素對1,2-二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)、羥基自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)具有很好的清除效果，其黃色素YP1、YP2和YP3的抗氧化效果與抗氧化劑VC相當(dāng)。蟲草烯是一種分子量大小為263.115 8m/z的新型蛹蟲草黃色素，2 mg/mL蟲草烯的DPPH自由基清除活性與VC接近，可以提高老化HSF細(xì)胞的SOD、過氧化氫酶(CAT)活性，并降低丙二醛(MDA)水平[11]。此外，蛹蟲草多糖對DPPH自由基和羥自由基亦具有顯著的清除能力[12]。因此，該試驗(yàn)利用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)小鼠急性氧化損傷，評價(jià)日常服用蛹蟲草對機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，為蛹蟲草作為天然抗氧化類功能性食品的應(yīng)用潛質(zhì)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試材。SPF級KM小鼠，雌雄各半，體重18～20 g，于室溫(24±2)℃、濕度(55±5)%，自然光照條件下飼養(yǎng)，小鼠及維持鼠糧均購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。蛹蟲草子實(shí)體由沈陽師范大學(xué)功能性蛹蟲草省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室栽培提供，60 ℃烘干至恒重，粉碎機(jī)粉碎，過80目篩網(wǎng)，-20 ℃儲存?zhèn)溆?。灌胃前以蒸餾水配制成工作液使用。

1.1.2試劑。脂多糖(Sigma)、過氧化氫測試盒(分光光度法)、總抗氧化能力測試盒(ABTS法)、丙二醛測試盒(TBA法)、過氧化氫酶測試盒(ABTS法)，均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.1.3主要儀器。電子天平(上海精密儀器有限公司)；臺式低溫離心機(jī)(上海湘怡離心機(jī)儀器有限公司)；-80 ℃超低溫冰箱(日本SANYO公司)；酶標(biāo)儀(北京普天新橋技術(shù)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1LPS氧化應(yīng)激損傷模型的確立。KM小鼠隨機(jī)分為模型組和空白組，模型組腹腔注射0.5 mL/只LPS水溶液誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，分別為6 mg/kg LPS組、8 mg/kg LPS組、10 mg/kg LPS組(n=5)，空白組注射同等劑量無菌水。記錄小鼠被毛、精神、運(yùn)動和糞便情況，LPS注射前和注射24 h后小鼠體重記為W1和W2， LPS注射24 h后脫頸處死解剖，稱取小鼠肝臟、腎臟、脾臟、胸腺重量，分別計(jì)算臟器指數(shù)和失重率(QW)，計(jì)算方法如下：

臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/體重(g)×100%

QW=[W1(g)-W2(g)]/W1(g) ×100%

式中，f spk為復(fù)合地基承載力特征值，kPa；λ為單樁承載力發(fā)揮系數(shù)；m為面積置換率；R a為單樁承載力特征值，kN；A p為樁的截面積，m2；β為樁間土承載力發(fā)揮系數(shù)；f sk為處理后樁間土承載力特征值，kPa，應(yīng)按靜載荷試驗(yàn)確定，無試驗(yàn)資料時(shí)可取天然地基承載力特征值。

1.2.2蛹蟲草的氧化應(yīng)激保護(hù)作用。

1.2.2.1試驗(yàn)分組及處理。KM小鼠隨機(jī)分為空白組、對照組和試驗(yàn)組(n=30)，基于蛹蟲草推薦使用劑量標(biāo)準(zhǔn)0.03 g/kg，根據(jù)Meeh-Rubner公式得出小鼠基礎(chǔ)使用劑量為0.61 mg/g，試驗(yàn)組以0.5 mL/只蛹蟲草水溶液連續(xù)灌胃28 d；空白組和對照組灌胃同等劑量蒸餾水；對照組及試驗(yàn)組于最后一次灌胃1 h后，腹腔注射10 mg/kg LPS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷。

1.2.2.2小鼠基礎(chǔ)生理狀態(tài)的觀察。每日觀察記錄各組小鼠精神狀態(tài)、飲水量及進(jìn)食量。于LPS注射0、2、4、6、8 h，分別處死各組小鼠(n=6)，稱取肝臟、腎臟、脾臟、胸腺、全腦重量，PBS緩沖液清洗后，裝入EP管，-80 ℃冰箱凍存待用，并計(jì)算臟器指數(shù)。

1.2.2.3氧化應(yīng)激指標(biāo)的定量檢測。稱取肝臟、腎臟、腦組織0.5 g，加入9 倍體積0.9%的生理鹽水，冰上勻漿，4 ℃，12 000 r/min，離心5 min，收集組織液。按照各試劑盒說明書要求進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測，其中，采用考馬斯亮藍(lán)蛋白法測定各組織的總蛋白含量，比色法檢測各組織總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫(H2O2)含量，檢測波長為405 nm。硫代巴比妥酸法測定各組織的MDA含量，檢測波長為532 nm。紫外法測定各組織的CAT活性，檢測波長為405 nm。各檢測組均為3復(fù)孔。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS誘導(dǎo)的小鼠氧化應(yīng)激損傷LPS注射2 h后，各濃度組小鼠均出現(xiàn)不同程度的腹瀉情況，同時(shí)伴有扎堆、精神萎靡、嗜睡、呆臥懶動及豎毛現(xiàn)象，其中10 mg/kg LPS組異常狀況最為嚴(yán)重，至LPS注射后7 h恢復(fù)正常(圖1)。與對照組相比，10 mg/kg LPS引起小鼠肝臟指數(shù)明顯升高(P<0.05)(表1)，各試驗(yàn)組之間失重率(QW)差異不明顯(P>0.05)(表2)。

注：A.小鼠被毛情況；B.小鼠糞便改變。Note:A.Mouse hair condition;B.Change of mouse feces.圖1 LPS腹腔注射對小鼠基礎(chǔ)生理狀態(tài)的影響Fig.1 Effect of LPS abdominal injection on basic physiological status of mice

表1 LPS腹腔注射對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of LPS abdominal injection on mouse organ index 單位：%

2.2 蛹蟲草的抗氧化應(yīng)激作用

2.2.1蛹蟲草對小鼠基礎(chǔ)生理狀態(tài)的影響。蛹蟲草灌胃28 d 未對各組小鼠精神、形態(tài)、行為、攝食飲水產(chǎn)生明顯影響(圖2)。LPS注射后8 h內(nèi)，空白組精神、行為、活動量正常，對照組于LPS注射2 h后出現(xiàn)精神低迷、活動量下降等現(xiàn)象，試驗(yàn)組相應(yīng)異?，F(xiàn)象明顯強(qiáng)于對照組。從表3可以看出，LPS注射后2～8 h,對照組小鼠肝臟指數(shù)出現(xiàn)持續(xù)性增大的趨勢，且明顯高于試驗(yàn)組(P<0.05)，至8 h，試驗(yàn)組肝臟指數(shù)接近空白組水平(P>0.05)；其他臟器指數(shù)各組間無明顯差異(P>0.05)。

表2 LPS腹腔注射對小鼠失重率的影響Table 2 Effect of LPS abdominal injection on the loss weight rate of mice

2.2.2蛹蟲草對小鼠抗氧化能力的影響。從表4～5可以看出，LPS注射后2～6 h，對照組和試驗(yàn)組小鼠肝臟、腎臟及腦組織T-AOC指數(shù)、CAT活性均檢測到不同程度的降低情況，且對照組降低幅度更大。至試驗(yàn)結(jié)束(8 h)，試驗(yàn)組小鼠各組織的T-AOC指數(shù)、CAT活性均已接近空白組水平(P>0.05)，但對照組T-AOC指數(shù)、CAT活性仍處于較低水平(P<0.05)。

2.2.3蛹蟲草對小鼠各組織H2O2和MDA含量的影響。從表6～7可以看出，LPS注射后2～6 h,與空白組相比，對照組小鼠肝臟、腎臟及腦組織中的H2O2和MDA含量均明顯升高(P<0.05)，LPS注射未引起對照組和試驗(yàn)組腦組織MDA含量的顯著性變化(P>0.05)。試驗(yàn)組肝臟、腎臟H2O2與MDA含量升高趨勢均較為平緩，且2～6 h均顯著低于對照組(P<0.05)。至試驗(yàn)結(jié)束(8 h)，對照組和試驗(yàn)組各組織的MDA含量已無明顯差異(P>0.05)。

圖2 各組小鼠日攝食量(a)和飲水量(b)變化情況Fig.2 Changes of daily food intake (a) and water intake (b) of mice in each group

表3 LPS注射對各組小鼠臟器指數(shù)的影響Table 3 Effect of LPS injection on the visceral index of mice in each group 單位：%

3 討論

氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種損傷，衰老和心臟病、阿爾茲海默癥等疾病的發(fā)生均與體內(nèi)過激的氧化應(yīng)激有關(guān)[13]。LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌重要的內(nèi)毒素，高劑量LPS會引起機(jī)體短暫的氧化應(yīng)激反應(yīng)，以胃腸應(yīng)激癥狀較為明顯，經(jīng)常被作為動物氧化應(yīng)激反應(yīng)的外部評價(jià)指標(biāo)[14]。該試驗(yàn)采用6、8、10 mg/kg 3個(gè)濃度的LPS腹腔注射，以確定LPS誘導(dǎo)小鼠氧化應(yīng)激損傷的最佳劑量。研究結(jié)果顯示，6～10 mg/kg的LPS注射劑量均能成功誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)腹瀉、精神萎靡、活動量減少以及豎毛等癥狀，與穆盛田等[15]的研究結(jié)果相一致，但10 mg/kg LPS組小鼠腹瀉最為嚴(yán)重，活動量減少及豎毛現(xiàn)象直至7 h后逐漸恢復(fù)正常，同時(shí)，該組小鼠肝臟指數(shù)升高明顯(P<0.05)。因此，該試驗(yàn)采用10 mg/kg的LPS注射劑量構(gòu)建小鼠氧化應(yīng)激損傷。

表4 LPS注射對各組小鼠T-AOC指數(shù)的影響Table 4 Effect of LPS injection on T-AOC index of each group of mice 單位：U/mg

表5 LPS注射對各組小鼠CAT活性的影響Table 5 Effect of LPS injection on CAT activity of each group of mice 單位：U/mg

表6 LPS注射對各組小鼠H2O2含量的影響Table 6 Effect of LPS injection on H2O2 content of each group of mice 單位：mmol/g

表7 LPS注射對各組小鼠MDA含量的影響Table 7 Effect of LPS injection on MDA content of each group of mice 單位：nmol/mg

蛹蟲草作為一種藥用真菌，含有豐富的抗氧化生物活性成分，由此該試驗(yàn)通過檢測小鼠主要器官組織中氧化應(yīng)激因子的含量和活力，探究蛹蟲草的體內(nèi)抗氧化應(yīng)激保護(hù)作用。在注射LPS后2～8 h，對照組小鼠肝臟指數(shù)增大明顯(P<0.05)，這與楊毅等[16]的研究結(jié)果一致，同時(shí)，試驗(yàn)組肝臟指數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)。CAT是機(jī)體典型的抗氧化酶，可拮抗機(jī)體產(chǎn)生過量的H2O2，T-AOC指數(shù)顯示了機(jī)體的總抗氧化酶活力，抗氧化物系統(tǒng)功能狀態(tài)，其含量與細(xì)胞抗氧化能力呈正相關(guān)。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，LPS注射后4～6 h，試驗(yàn)組各組織的T-AOC指數(shù)、CAT活性均高于對照組(P<0.05)，至試驗(yàn)結(jié)束(8 h)，試驗(yàn)組T-AOC指數(shù)、CAT活性已恢復(fù)至空白組水平，但對照組T-AOC指數(shù)、CAT活性仍顯著低于其他兩組(P<0.05)。說明日常服用蛹蟲草能夠強(qiáng)化機(jī)體應(yīng)對急性氧化應(yīng)激刺激的能力，有助于機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀態(tài)的恢復(fù)，對肝臟的保護(hù)作用最為明顯。

MDA是膜脂過氧化的終產(chǎn)物之一，MDA含量能間接考察細(xì)胞受到脅迫嚴(yán)重程度，是反映機(jī)體抗氧化潛在能力的重要參數(shù)[17]。H2O2由ROS轉(zhuǎn)化而來，組織中H2O2含量升高可直接對各器官組織造成傷害[18]。LPS注射引起對照組肝臟、腎臟、腦組織中的MDA和H2O2含量明顯增加，說明小鼠肝臟和腎臟是應(yīng)對LPS氧化應(yīng)激較為敏感的器官。阮佼[19]的研究結(jié)果證實(shí)，LPS可導(dǎo)致小鼠肝臟、腎臟、腦、肺、空腸等組織中MDA含量增高，CAT、SOD等抗氧化酶活性降低。張明亮等[20]研究表明，蛹蟲草的黃色素成分具有很好地清除自由基活性的作用。該研究發(fā)現(xiàn)，LPS注射后2～6 h，試驗(yàn)組各組織中的MDA和H2O2含量上升趨勢較為平緩，說明日常服用蛹蟲草可以增強(qiáng)機(jī)體對MDA和H2O2的清除能力，縮短機(jī)體自由基系統(tǒng)恢復(fù)平衡的時(shí)間，避免機(jī)體遭受更為嚴(yán)重的氧化應(yīng)激攻擊。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是生物體內(nèi)遭遇外部不良物質(zhì)刺激最常見的應(yīng)答方式，過激的氧化應(yīng)激反應(yīng)則會造成機(jī)體意想不到的氧化損傷。該試驗(yàn)以小鼠LPS氧化應(yīng)激模型評價(jià)了蛹蟲草的體內(nèi)抗氧化損傷能力，研究結(jié)果顯示，短時(shí)間服用蛹蟲草可以增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化平衡狀態(tài)，該試驗(yàn)為蛹蟲草抗氧化活性的研究和應(yīng)用提供了新的科學(xué)依據(jù)。