晏飛利，劉 丹，陳艾萌，呂向陽，馬 林

(1.四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學院，四川內(nèi)江641009；2.西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽621000)

研究表明，人體的衰老及諸多慢性疾病的發(fā)生均與體內(nèi)自由基水平的失衡有關(guān)[1-2]，而通過攝入外源性抗氧化劑以提高自身抗氧化能力無疑是有效預防措施之一。鑒于人工合成抗氧化劑，如2，6-二叔丁基對甲酚、丁基羥基茴香醚等存在潛在毒性，天然抗氧化劑的尋找和開發(fā)已成為科研工作者關(guān)注的熱門研究領(lǐng)域之一[3]。高等真菌種類多樣，資源豐富，具有食用、藥用、保健等價值[2，4]，許多學者已發(fā)現(xiàn)多種高等真菌提取物具有良好的抗氧化性能，如桑黃、樺褐孔菌、繡球菌等的提取物[5-7]。

迷宮栓孔菌[Trametesgibbosa(Pers.) Fr.]，隸屬多孔菌科(Polyporaceae)栓孔菌屬(Trametes)[8]，又稱褶孔栓菌、偏腫栓菌。迷宮栓孔菌能分解植物細胞壁中的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素，是重要的白腐真菌[9-10]，同時也是一類具有藥用保健價值的高等真菌，含有多糖、萜類、醇類和酚類等活性成分[11-13]。研究表明，迷宮栓孔菌子實體多糖具有血管保護和抗炎功效[14]，內(nèi)生木酶菌株具有抑菌作用[15]。張峰等[12]對分離的迷宮栓孔菌菌絲體的最適培養(yǎng)條件和子實體馴化栽培進行了研究，并測定栽培子實體的多糖抗氧化活性，表明提取的粗多糖對超氧陰離子和羥基自由基具有良好的清除效果；Johnsy等[16]研究發(fā)現(xiàn)迷宮栓孔菌甲醇提取物和水提取物具有一定的抗氧化和抗菌功效。當前，國內(nèi)對迷宮栓孔菌抗氧化活性的研究多集中于其多糖組分，對多酚的研究較少，對其不同溶劑提取物的抗氧化活性、抗氧化活性成分及其相關(guān)性的研究鮮見報道。該研究對迷宮栓孔菌子實體用水和60%乙醇進行提取，測定提取物的多酚和多糖含量，分析提取物的抗氧化活性大小，同時進行抗氧化活性與多酚及多糖含量的相關(guān)性分析，為迷宮栓孔菌的進一步開發(fā)利用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1研究對象。迷宮栓孔菌子實體，采自四川省綿陽市三臺縣，經(jīng)西南科技大學賀新生教授鑒定為迷宮栓孔菌[Trametesgibbosa(Pers.) Fr.]，在恒溫鼓風干燥箱60 ℃干燥，粉碎，過40目篩備用

1.1.2主要試劑。DPPH(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)，日本東京化成株式會社，純度>97%；福林酚試劑，國藥集團化學試劑有限公司；蒽酮、乙醇、三氯乙酸、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、磷酸二氫鈉、碳酸鈉、維生素C、葡萄糖、硫酸和沒食子酸均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器。RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；JP-010T型超聲儀，上海科導超聲儀公司；UV752紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1提取工藝。稱取粉碎后的迷宮栓孔菌子實體細粉，按照料液比1∶20加入水或60%乙醇，50 ℃溫度下超聲(功率150 W)提取3次，每次45 min，趁熱抽濾，合并3次濾液并于55 ℃下減壓濃縮得褐色浸膏，置于50 ℃烘箱中干燥24 h[17]，精密稱重浸膏重量，按公式(1)計算提取物得率。

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式中，M1表示提取物質(zhì)量(g)，M2表示干原料質(zhì)量(g)。

1.2.2多酚含量測定。采用福林酚法測定提取物的多酚含量[18]。以沒食子酸作為標準品，配制1 mg/mL的母液，分別移取母液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于試管，補足蒸餾水至1 mL，再加入1 mL稀釋1倍的福林酚試劑，振蕩 3 min，隨后加入1 mL 20%的Na2CO3溶液，充分混勻，30 ℃避光水浴30 min；以1 mL蒸餾水代替樣品反應(yīng)液調(diào)零，在725 nm波長處測定吸光度。2種提取物樣品亦取1 mL(1 mg/mL)代替沒食子酸標準液按同樣方法進行測定，重復3次。以計算得到的沒食子酸當量(mg/g)表示多酚含量。

1.2.3多糖含量測定。蒽酮-硫酸法測定提取物中的多糖含量[6]。以無水葡萄糖作為標準品，配制濃度為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的標準溶液。在試管中加入1 mL葡萄糖溶液，再加入5 mL濃度為1 mg/mL的蒽酮-硫酸試劑，沸水浴15 min，冷卻后放置10 min；以1 mL蒸餾水代替樣品反應(yīng)液調(diào)零，620 nm處測定吸光度。提取物樣品取1 mL(1 mg/mL)按同樣方法進行測定，重復3次。以計算得到的葡萄糖當量(mg/g)表示多糖含量。

1.2.4DPPH自由基清除活性測定。采用文獻[19]的方法測定迷宮栓孔菌提取物對DPPH自由基的清除效果。用無水乙醇將DPPH配制成0.2 mmol/L的溶液備用。在3 mL濃度為0.2 mmol/L DPPH溶液中分別加入水提取物溶液、60%乙醇提取物溶液或維生素C溶液1 mL，混勻后28 ℃水浴30 min，立即在517 nm波長處檢測吸光度(A1)；取1 mL蒸餾水代替樣品溶液，測得空白吸光度(A0)；以3 mL蒸餾水代替DPPH溶液，測得試劑吸光度(A2)。按公式(2)計算清除率。

(2)

1.2.5鐵離子還原能力測定。鐵離子還原能力測定參照Malakottabary等[13]的方法并略作修改。在試管中加入1 mL不同濃度(0.5～2.5 mg/mL)的提取物樣品溶液、1 mL 濃度為0.2 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)、1 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃水浴30 min；冷卻后加入1 mL 10%的三氯乙酸、0.2 mL現(xiàn)配的0.1%三氯化鐵溶液，搖勻，靜置10 min；以蒸餾水調(diào)零，在700 nm波長處測吸光度。以維生素C作為對照品，以吸光度表示鐵離子還原能力強弱，吸光度越大，鐵離子還原能力越強。

1.2.6超氧陰離子自由基清除活性測定。參照盧航等[20]的方法檢測迷宮栓孔菌提取物對超氧陰離子自由基的清除活性。在試管中加入5 mL濃度為0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)，25 ℃水浴20 min；加入1 mL不同濃度(1～5 mg/mL)的樣品溶液和0.5 mL濃度為3 mmol/L鄰苯三酚溶液，搖勻，25 ℃水浴5 min；最后加入1 mL濃度為5 mol/L HCl終止反應(yīng)，并搖勻，反應(yīng)3 min；以蒸餾水調(diào)零，在波長420 nm處測定吸光度(A1)。以1 mL蒸餾水代替樣液測得空白吸光度(A0)。以0.5 mL蒸餾水代替鄰苯三酚溶液測得樣品本底吸光度(A2)。以維生素C作為對照品，按公式(3)計算清除率。

(3)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析該研究的試驗結(jié)果數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準差，使用Graphpad Prism 6.0進行統(tǒng)計學分析并作圖，采用t檢驗進行組間方差分析，P<0.05認為具有顯著差異。以2種提取物各濃度下抗氧化指標平均值與抗氧化物質(zhì)含量平均值為分析對象，采用SPSS 17.0進行Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線及回歸方程經(jīng)分析(圖1)，沒食子酸在0～0.05 mg/mL線性關(guān)系良好，標準曲線的回歸方程為y=21.057x+0.018 9(R2=0.997 0)；葡萄糖在0～0.10 mg/mL線性關(guān)系良好，標準曲線的回歸方程為y=6.251 4x+0.007(R2=0.998 5)。

圖1 沒食子酸(a)和葡萄糖(b)標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid(a) and glucose(b)

2.2 不同溶劑的提取物得率及多酚和多糖含量不同提取溶劑具有不同的提取效果，提取成分也有所差異。水和60%乙醇提取的迷宮栓孔菌子實體得率及其多酚和多糖含量如表1所示。試驗結(jié)果表明，水提取物得率高達10.60%，明顯高于60%乙醇提取物得率；水提取物多酚含量為(46.44±0.46) mg/g，明顯高于60%乙醇提取物的多酚含量；60%乙醇提取物的多糖含量為(185.83±12.45)mg/g，明顯高于水提取物的多糖含量。

2.3 對DPPH自由基的清除能力從圖2可以看出，在0.5～2.5 mg/mL，迷宮栓孔菌水提取物對DPPH自由基表現(xiàn)出良好的清除能力，與維生素C在0.02～0.10 mg/mL的清除效果接近，迷宮栓孔菌水提取物濃度在2.5 mg/mL時清除率達(94.58±1.51)%；60%乙醇提取物的清除能力顯著低于水提取物(P<0.05)，在2.5 mg/mL時清除率為(51.51±2.63)%，相當于0.04 mg/mL維生素C的清除能力。

表1 提取物的得率、多酚和多糖含量Table 1 Yield of extracts，polyphenol and polysaccharide contents

注：*P<0.05。圖2 維生素C(a)和迷宮栓孔菌提取物(b)對DPPH自由基的清除能力Fig.2 Scavenging capacity of DPPH radical by VC(a) and T.gibbosa extracts(b)

2.4 對鐵離子的還原能力抗氧化劑的鐵離子還原能力與其抗氧化活性呈正相關(guān)，對鐵離子還原能力越強，其抗氧化活性則越強[17]。測定結(jié)果表明(圖3)，迷宮栓孔菌水提取物具有較強的鐵離子還原能力，隨濃度的增加，還原能力增強較明顯，在0.5～2.5 mg/mL的還原能力與維生素C在0.02～0.10 mg/mL的還原能力相當；60%乙醇提取物還原能力相對于水提取物較弱，2.5 mg/mL 60%乙醇提取物的還原能力僅相當于0.02～0.04 mg/mL維生素C的還原能力。

注：*P<0.05。圖3 維生素C(a)和迷宮栓孔菌提取物(b)的鐵離子還原能力Fig.3 The reducing power of iron ion by VC(a) and T.gibbosa extracts(b)

2.5 對超氧陰離子自由基的清除能力從圖4可以看出，維生素C在0.02～0.04 mg/mL對超氧陰離子自由基的清除率較低，0.06 mg/mL及以上清除效果明顯增強，0.10 mg/mL時清除率達97.1%。在1～5 mg/mL，60%乙醇提取物對超氧陰離子自由基的清除效果隨濃度的增加不明顯，水提取物則相對更明顯，低濃度時60%乙醇提取物的清除率高于水提取物，而在高濃度時則水提取物的清除率更高。在樣品濃度為5 mg/mL時，水提取物清除率為35.25%±3.29%，相當于維生素C在0.04～0.06 mg/mL的清除效果，60%乙醇提取物的清除率為23.69%±4.46%?？傮w上，迷宮栓孔菌提取物對超氧陰離子自由基的清除能力相較于對DPPH自由基的清除能力和對鐵離子的還原能力較弱。

2.6 提取物多酚和多糖含量與抗氧化活性的關(guān)系Pearson相關(guān)性分析結(jié)果(表2)表明，迷宮栓孔菌水提取物和60%乙醇提取物的多酚和多糖含量與其DPPH自由基清除能力、鐵離子還原能力和超氧陰離子自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)均在0.9以上，呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，這與目前報道的高等真菌的多糖、多酚物質(zhì)是主要的抗氧化活性物質(zhì)結(jié)果相符[4，6]。

圖4 維生素C(a)和迷宮栓孔菌提取物(b)對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.4 Scavenging capacity of superoxide anion radical by VC(a) and T.gibbosa extracts(b)

表2 多酚和多糖含量與抗氧化活性的相關(guān)關(guān)系Table 2 The correlation of antioxidant activity with content of polyphenol and polysaccharide

3 討論與結(jié)論

該研究表明，迷宮栓孔菌子實體水提取物和60%乙醇提取物均具有較強的抗氧化活性，但在不同的抗氧化指標及強度上表現(xiàn)有所差異。2種提取物的DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力較好，超氧陰離子自由基清除能力次之。水提取物的DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力顯著高于60%乙醇提取物。水提取物的多酚含量較高，60%乙醇提取物的多糖含量較高。相關(guān)性分析顯示，2種提取物的3項抗氧化指標與其多酚和多糖含量均呈極顯著正相關(guān)。

綜合分析可知，水提取物的抗氧化能力強于60%乙醇提取物，相應(yīng)地，水提取物具有更高的多酚含量，這與薄荷、翠云草和藍莓葉等提取物的抗氧化活性研究中相似，水提取物中的多酚含量更高，從而具有更好的抗氧化能力[17，21-22]。表明酚類物質(zhì)是迷宮栓孔菌子實體的主要抗氧化活性物質(zhì)，多糖次之，這在桑黃的抗氧化活性研究中亦有報道[23]。

一般來說，多糖類物質(zhì)由于其分子中含有大量的極性基團，對水分子具有較強的親合力，但隨著其分子量的增大，其疏水性也隨之增大，因此分子量大、分支程度高的多糖在水中溶解度低[24]。迷宮栓孔菌子實體中的多糖可能多為分子量大、分支程度高的多糖，因此水提取物中多糖含量相較于60%乙醇提取物的更低。

由于抗氧化系統(tǒng)、機制、抗氧化劑及自由基的多樣性，同一抗氧化劑用不同的方法檢測結(jié)果可能不同[4，16]，這可能也是水提取物和60%乙醇提取物具有良好的DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力，但對超氧陰離子自由基的清除作用較弱的原因。

迷宮栓孔菌2種提取物的抗氧化活性與多酚和多糖的含量均有顯著的相關(guān)性，這與張峰等[12，25]的報道一致，說明多酚和多糖均為迷宮栓孔菌重要的抗氧化物質(zhì)。水提取物的多酚較多，60%乙醇提取物的多糖成分較多，后續(xù)可通過調(diào)整水和乙醇比例有針對性地提取不同抗氧化組分。

該研究在張峰等[12]和Johnsy等[16]的基礎(chǔ)上進一步豐富了迷宮栓孔菌的抗氧化活性研究，有利于迷宮栓孔菌的開發(fā)利用，但迷宮栓孔不同提取物的組分差異、體內(nèi)抗氧化活性和藥理活性研究還有待加強。