王 辰,楊婭富,李 立,逯金瑤,李嘉昊,李 波,3*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040；2.湖南省生物多樣性保護(hù)中心,湖南長(zhǎng)沙 410000；3.國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物檢測(cè)中心,黑龍江哈爾濱 150040)

穿山甲是哺乳綱(Mammalia)鱗甲目(Pholidota)穿山甲科(Manidae)動(dòng)物的統(tǒng)稱(chēng)?，F(xiàn)存3屬8種：穿山甲屬(Manis)的中華穿山甲(M.pentadactyla)、印度穿山甲(M.crassicaudata)、馬來(lái)穿山甲(M.javanica)和菲律賓穿山甲(M.culionensis)；地穿山甲屬(Smutsia)的南非穿山甲(S.temminckii)和大穿山甲(S.gigantea)；長(zhǎng)尾穿山甲屬(Phataginus)的樹(shù)穿山甲(P.tricuspis)和長(zhǎng)尾穿山甲(P.tetradactyla),分布于亞洲和非洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1-6]。

穿山甲因有食用和藥用價(jià)值而遭到人類(lèi)的亂捕濫獵，加之生境被破壞及外來(lái)物種入侵等因素,其野生種群數(shù)量急劇下降,甚至面臨滅絕[7-8]。2016年10月,CIETS締約國(guó)大會(huì)通過(guò)“所有8種穿山甲物種由附錄II 提升至附錄 I”的提案[9-10]。由此,為打擊穿山甲的非法貿(mào)易需要選擇合適的分子標(biāo)記、構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的物種鑒定方法。

線粒體基因組作為“擴(kuò)展條形碼”[11],常用于物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系評(píng)估[12-13]。該技術(shù)成本較為昂貴,不適合在穿山甲非法貿(mào)易頻發(fā)的東南亞和非洲國(guó)家推廣使用。線粒體細(xì)胞色素b(Cytochrome b,Cytb)基因進(jìn)化速率適中、含有豐富的遺傳信息、結(jié)構(gòu)清晰,被廣泛地應(yīng)用于物種鑒定[14]。目前,基于Cytb基因的穿山甲物種鑒定多是利用脊椎動(dòng)物或哺乳動(dòng)物通用引物,所擴(kuò)增的序列長(zhǎng)度長(zhǎng)短不一[15-18]。研究表明，利用穿山甲科特異引物可以有效排除非目標(biāo)物種的干擾[15],Cytb基因序列長(zhǎng)度變化可能影響鑒定結(jié)果的判讀[19]。由此,筆者依據(jù)Cytb基因設(shè)計(jì)了穿山甲科物種鑒定的特異引物,并評(píng)估4種長(zhǎng)度的Cytb基因序列對(duì)穿山甲物種鑒定的影響。

1 材料與方法

1.1 材料收集191份穿山甲樣品。其中,174份為已知馬來(lái)穿山甲樣本,包括128份肌肉樣,18份皮膚樣,12份糞便樣,7份毛發(fā)樣,9份鱗片樣,剩余17份樣本為未知穿山甲樣本,其中包括1份疑似穿山甲鱗片粉末(表1)。利用智人(Homosapiens,n=3)、貉(Nyctereutesprocyonoides,n=3)、朱頂雀(Acanthisflammea,n=3)、東北兔 (Lepusmandshuricus,n=1)、牛(Bostaurus,n=1)、虎(Pantheratigris,n=1)、家豬(Susscrofadomestica,n=1)的DNA作為非穿山甲物種對(duì)照樣本。上述樣本均來(lái)自國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物檢測(cè)中心樣本庫(kù)。樣品采集后于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。同時(shí),從NCBI上下載135條序列穿山甲物種(表1)和部分非穿山甲物種的Cytb基因同源序列用于引物設(shè)計(jì)和序列綜合分析。

1.2 方法

1.2.1DNA提取。穿山甲鱗片用75%乙醇清洗表面,經(jīng)滅菌去離子水清洗、風(fēng)干后剪取其表面殘留的皮膚組織或毛發(fā),或鉆取鱗片粉末。將皮膚、毛發(fā)及鱗片粉末分別裝入1.5 mL離心管。將肌肉樣剪碎后置于1.5 mL離心管。使用AxyPrepTM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit試劑盒(愛(ài)思進(jìn))提取肌肉、毛發(fā)、皮膚及鱗片的總DNA。另外,稱(chēng)取180～220 mg的糞便使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒(愛(ài)思進(jìn))提取總DNA。DNA提取步驟均參考試劑盒說(shuō)明書(shū),DNA原液存放于-20 ℃冰箱。

表1 穿山甲科試驗(yàn)樣本及GenBank來(lái)源序列信息Table 1 Experimental samples and sequence information downloaded from GenBank for pangolin

1.2.2引物設(shè)計(jì)。利用Primer PREMIER 6.0軟件基于馬來(lái)穿山甲Cytb全序列設(shè)計(jì)穿山甲科特異PCR引物。引物搜尋參數(shù)包括：熔解溫度(Tm)為60 ℃、引物長(zhǎng)度(Length)為18～30 bp、擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度(amplication length)為70～200 bp,余下參數(shù)為默認(rèn)值。使用MEGA 5.0中的BLAST程序篩選滿足設(shè)計(jì)原則的引物,參考的非穿山甲物種的同源序列包括：兔形目的穴兔(Oryctolaguscuniculus,HQ596486、KT626640)、食肉目的土狼(Canislatrans,KT447695～KT447698)和家犬(CanislupusfamiliarisGU249573、MH714782～MH714784、KJ660981、KJ660982)、翼手目的蝙蝠(Ardopsnichollsi,KJ024748～KJ024751)、偶蹄目的牛(Bostaurus,KT626620)、貧齒目的犰狳(Dasypusnovemcinctus,KU253494、KT626619、KT626620)和靈長(zhǎng)目的智人(Homosapiens,JN034134 ～JN034136)。

1.2.3PCR擴(kuò)增和測(cè)序。利用3對(duì)引物：L14724/H15149[26]、mcb398/mcb869[27]、DCW-F1/DCW-R1分別擴(kuò)增穿山甲科自有樣本(表1)Cytb基因部分序列。反應(yīng)體系均為50 μL：5 μL DNA模板,0.5 μL上、下引物,25 μL DNA 聚合酶(Transgen,北京),19 μL滅菌去離子水。PCR在PE9700型DNA擴(kuò)增儀(PE,美國(guó))進(jìn)行。L14724/H15149反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃/5 min(變性95 ℃/30 s,退火56 ℃/30 s,延伸72 ℃ 1 min),循環(huán)40次,延伸72 ℃ 5 min；mcb398/mcb869反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 5 min(變性94 ℃ 1 min,退火52 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s),循環(huán)35次,延伸72 ℃ 10 min； DCW-F1/DCW-R1反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 5 min,(變性94 ℃ 1 min,退火53 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s),循環(huán)35次,延伸72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至北京擎科生物技術(shù)有限公司哈爾濱分公司利用ABI3730XL DNA測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序。同時(shí)將DNA濃度 ≥25 ng/μL的樣本送至深圳華大基因科技有限公司,通過(guò)鳥(niǎo)槍法構(gòu)建文庫(kù),使用Illu mina HiSeq2500測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.4引物有效性測(cè)試。引物特異性測(cè)試使用NCBI/Primer-BLAST程序驗(yàn)證引物DCW-F1/DCW-R1與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中非目標(biāo)物種的結(jié)合情況。然后使用7個(gè)非穿山甲物種的DNA樣品進(jìn)行實(shí)證試驗(yàn)。最后開(kāi)展混合樣品試驗(yàn),將上述7個(gè)物種的DNA樣本按濃度均勻混合,再分別與3種不同類(lèi)型(肌肉、糞便和鱗片)的穿山甲物種DNA抽提液混合,濃度比為1∶1,分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序。

引物靈敏度測(cè)試在肌肉、毛發(fā)、組織、鱗片粉及糞便樣品中各取2個(gè)樣品,將DNA抽提液用滅菌去離子水從10 ng/μL依次稀釋至1.0、0.1 ng/μL和10、1 pg/μL,使用“1.2.3”中的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)。上述引物的有效性測(cè)試中單次的PCR中均包含陽(yáng)性對(duì)照(已知馬來(lái)穿山甲DNA)和陰性對(duì)照(滅菌去離子水)。

1.3 數(shù)據(jù)分析利用MegAlign將獲得的二代測(cè)序結(jié)果轉(zhuǎn)成Fasta格式,參考NCBI上的同源序列使用MEGA5.2[28]手工校對(duì)；利用SeqMan軟件拼接一代測(cè)序獲得的Cytb基因序列,并結(jié)合測(cè)序峰圖手工校對(duì)。利用DNASP V.6.0.70計(jì)算該研究所得序列的單倍型。使用MEGA5.2軟件中的clustalW對(duì)序列排序并校正,計(jì)算基于Kimura-2-Parameter雙參數(shù)(K2P)模型[29]的各穿山甲的種內(nèi)和種間遺傳距離,用boot-strap test 作1 000次置信度分析。使用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST工具,對(duì)所有序列進(jìn)行比對(duì),并進(jìn)行同源性分析比對(duì),以確定種屬。通過(guò)PhyloSuite V.1.2.2[30]基于最大似然法(mL)和貝葉斯法(BI)重建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。利用ModelFinder(選取BIC標(biāo)準(zhǔn),模型分別選擇IQ-TREE和Mrbayes)得到最佳分區(qū)方案和核苷酸替換模型。應(yīng)用IQ-TREE和Mrbayes分別重建 mL和BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(兔形目的穴兔同源序列為外群)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物有效性設(shè)計(jì)得到的引物 DCW-F1：5′- CCTATTCGCATACGCAATC-3′；DCW-R1：5′- AAGGATAGAGGCTACTTGTC-3′。該引物經(jīng)NCBI/Primer-BLAST程序檢索,與中華穿山甲同源序列的結(jié)合率為90.91% ～100%,其余7種穿山甲同源序列的結(jié)合率 ≥95%。實(shí)證試驗(yàn)表明，該引物未擴(kuò)增出任何非目標(biāo)物種條帶。所有混合樣品的擴(kuò)增子測(cè)序圖譜均為單一的可識(shí)別峰圖,所得序列與混合前試驗(yàn)所得序列一致。1份疑似穿山甲鱗片粉末經(jīng)引物mcb398/mcb869擴(kuò)增,測(cè)序圖譜為難以識(shí)別的混合峰圖；而經(jīng)引物DCW-F1/DCW-R1擴(kuò)增,得到單一、可識(shí)別測(cè)序峰圖。這些結(jié)果都說(shuō)明該引物具有較高的特異性。靈敏度測(cè)試電泳結(jié)果：肌肉樣DNA稀釋至10 pg/μL時(shí)有可見(jiàn)的電泳條帶；毛發(fā)和鱗片樣DNA可稀釋至0.1 ng/μL,皮膚和糞便樣DNA可稀釋至1 ng/μL(圖1)。這表明該P(yáng)CR系統(tǒng)的靈敏度足以檢測(cè)這5種不同類(lèi)型的樣品。

2.2 序列分析該研究自測(cè)4組Cytb基因序列的單倍型數(shù)量隨著序列長(zhǎng)度變短而減少。具體是：106條MJ-L(1 140 bp)中存在70個(gè)單倍型,160條MJ-M(762 bp)中存在69個(gè)單倍型,160條MJ-S(421 bp)中存在28個(gè)單倍型,60條MJ-DCW(211 bp)中存在19個(gè)單倍型。

4組序列中所有已知穿山甲樣本序列與馬來(lái)穿山甲同源序列的相似度均大于99%。除MJ-M中樣品PA-M-1、MJ-DCW中樣品MP-DCW-1與中華穿山甲同源序列的相似度略小于95%(94.88%、93.27%)；MJ-DCW中部分樣本與樹(shù)穿山甲同源序列的相似度略大于95%(95.73%),其余樣品與對(duì)應(yīng)的穿山甲同源序列的相似度均大于98%(表2)。其中，前3組序列(1 140、762、421 bp)與已知4種穿山甲同源序列的相似度值變化很小,但最短的MJ-DCW中除馬來(lái)穿山甲外,其余3種穿山甲同源序列的相似度有變小的趨勢(shì)。

MJ-L、MJ-M、MJ-DCW中種內(nèi)遺傳距離最大值和最小值分別來(lái)自樹(shù)穿山甲(0.113 6、0.117 4、0.149 4)和馬來(lái)穿山甲(0、0、0.004 8)； MJ-S中種內(nèi)遺傳距離最大值和最小值分別來(lái)自樹(shù)穿山甲(0.123 9)和中華穿山甲、馬來(lái)穿山甲(0)(表3)。南非穿山甲和大穿山甲的前3組序列中,種間遺傳距離最小值是種內(nèi)遺傳距離最大值的10倍以上；印度穿山甲和長(zhǎng)尾穿山甲的前3組序列中,該值為5～10倍；馬來(lái)穿山甲的MJ-DCW和樹(shù)穿山甲的MJ-S、MJ-DCW中種間遺傳距離最小值小于種內(nèi)遺傳距離最大值；其余種穿山甲的種間遺傳距離最小值是種內(nèi)遺傳距離最大值的1～5倍(圖2)。其中馬來(lái)穿山甲、大穿山甲和樹(shù)穿山甲的前3組序列中種內(nèi)遺傳距離無(wú)明顯變化,MJ-DCW中明顯變大,其余種穿山甲的4組序列變化很小；印度穿山甲/大穿山甲、印度穿山甲/長(zhǎng)尾穿山甲、中華穿山甲/馬來(lái)穿山甲、中華穿山甲/長(zhǎng)尾穿山甲、馬來(lái)穿山甲/長(zhǎng)尾穿山甲、馬來(lái)穿山甲/大穿山甲前3組序列的種間遺傳距離變化很小,MJ-DCW中明顯變??；南非穿山甲和長(zhǎng)尾穿山甲中,MJ-S顯著大于MJ-L、MJ-M；其余種穿山甲4組序列的種間遺傳距離變化很小。

注：A1、A2為毛發(fā)樣；B1、B2為肌肉樣；C1、C2為皮膚樣；D1、D2為鱗片樣；E1、E2為糞便樣。DNA稀釋濃度為10 ng/μL至1 pg/μL；M.DL1200 Maker(1 200、900、700、500、300、100 bp)。Note:A1 and A2 are hair samples, B1 and B2 are muscle samples, C1 and C2 are skin samples, D1 and D2 are scale samples, and E1 and E2 are faecal samples.The diluted concentration of DNA is from 10 ng/μL to 1 pg/μL.M is the DL 1 200 marker (1 200，900，700，500，300，100 bp).圖1 靈敏度測(cè)試的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of sensitivity test

表2 BLAST比對(duì)結(jié)果Table 2 BLAST results

4組序列的ML和BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)均顯示出了支持良好的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖3)。穿山甲物種的分化節(jié)點(diǎn)具有較高的置信度(60% ～100%)(圖3～4)。MJ-L、MJ-M、MJ-S中8種穿山甲可被分為2個(gè)大支：中華穿山甲、菲律賓穿山甲、馬來(lái)穿山甲和印度穿山甲為一支,南非穿山甲、大穿山甲、長(zhǎng)尾穿山甲及樹(shù)穿山甲為一支。而MJ-DCW中8種穿山甲的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)發(fā)生改變,南非穿山甲和大穿山甲脫離非洲穿山甲分支并入亞洲穿山甲分支(圖4)。這表明隨著序列長(zhǎng)度變短,8種穿山甲的分支會(huì)逐漸合并。菲律賓穿山甲和MJ個(gè)體與已知馬來(lái)穿山甲聚為一支,PA-1 和MP-DCW-1與已知中華穿山甲聚為一支,PA-3 和SG-DCW-1、2與已知大穿山甲聚為一支,PA-6、10、11和 MT-DCW-1-7、SJ -2018-72-2、SJ-2018-72-3與已知樹(shù)穿山甲聚為一支。另外，有3條序列被證明分類(lèi)錯(cuò)誤：原標(biāo)注為中華穿山甲的JN411577應(yīng)為馬來(lái)穿山甲，原標(biāo)注為中華穿山甲的NC_016008應(yīng)為馬來(lái)穿山甲，原標(biāo)注為長(zhǎng)尾穿山甲的NC_004027應(yīng)為樹(shù)穿山甲。

表3 4組序列的種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離Table 3 The intra-d and inter-d based on 4 groups of sequences

注：CR.印度穿山甲,PE.中華穿山甲,JA.馬來(lái)穿山甲,GI.大穿山甲,TE.南非穿山甲,PH.長(zhǎng)尾穿山甲,TR.樹(shù)穿山甲。Note:CR.M.crassicaudata, PE.M.pentadactyla, JA.M.javanica, GI.S.gigantea, TE.S.tem minckii, PH.P.tetradactyla, TR.P.tricuspis.圖2 4組序列種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離差異分布Fig.2 Distributions of the intra-d and inter-d on 4 groups sequences

3 討論

3.1 引物有效性穿山甲物種鑒定中利用脊椎動(dòng)物或哺乳動(dòng)物通用引物包括F-/R-primer[15]、GVL14724/H15149[17-18]、L14724/H15149[20]、mcb398/mcb869[21]、 L15601/H15748[31],它們具有可識(shí)別物種范圍廣、適用性好的特點(diǎn) 。但上述通用引物難以鑒別混有其他非穿山甲物種的疑似檢材，部分引物因擴(kuò)增片段較長(zhǎng)，對(duì)檢材的質(zhì)量要求偏高。該研究所設(shè)計(jì)的穿山甲科特異引物DCW-F1/DCW-R1,通過(guò)實(shí)證試驗(yàn)、混合試驗(yàn)和盲測(cè)試驗(yàn)均得到與目標(biāo)片段一致的DNA序列,未產(chǎn)生非目標(biāo)物種條帶。這表明該引物能有效、特異性識(shí)別穿山甲科物種。同時(shí),穿山甲的非法貿(mào)易經(jīng)常涉及肌肉、皮膚、鱗片樣本,野外調(diào)查時(shí)可以收集非損傷性樣本(如糞便和毛發(fā))。上述涉案和野外調(diào)查收集樣本可能會(huì)存在不同程度降解,導(dǎo)致抽提的DNA質(zhì)量不佳[32]。新設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度僅為211 bp,靈敏度試驗(yàn)結(jié)果也證明其良好的適用性,可以滿足不同來(lái)源的5種類(lèi)型樣本。

3.2 序列分析與判別標(biāo)準(zhǔn)Cytb基因是研究種間和種內(nèi)遺傳分化程度的良好指標(biāo),常用于物種鑒定[33]。Cytb基因序列長(zhǎng)度變化可能影響鑒定結(jié)果的判讀[19],因此通常使用2種以上的序列分析方法(如BLAST比對(duì)法、遺傳距離法、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)法)開(kāi)展物種鑒定[34]。通常,BLAST比對(duì)法中當(dāng)待測(cè)樣本與已知單一物種同源序列相似度高于95%時(shí)可以判定為同一物種[35]。該研究只有2份樣本與已知中華穿山甲同源序列的相似度低于該鑒定標(biāo)準(zhǔn),這可能與已知中華穿山甲Cytb基因序列單倍型數(shù)量偏低有關(guān)。其實(shí)脊椎動(dòng)物物種鑒定中上述判別標(biāo)準(zhǔn)并不是唯一的[36]。鑒于多數(shù)樣本與相應(yīng)穿山甲物種同源序列相似度均高于98%,建議使用相似度98%作為穿山甲物種判別標(biāo)準(zhǔn)。

穿山甲科物種中除馬來(lái)穿山甲的MJ-DCW和樹(shù)穿山甲的MJ-S、MJ-DCW外，剩余的種間最小遺傳距離均大于種內(nèi)最大遺傳距離,符合遺傳距離法物種鑒定判別標(biāo)準(zhǔn)[37]。其中,不同種穿山甲、同種穿山甲的不同組序列間的樣本量差異較大,且隨著序列長(zhǎng)度變短,序列相似性變大,單倍型數(shù)量逐漸減少,物種間樣本量的不平衡會(huì)導(dǎo)致遺傳距離法結(jié)果不穩(wěn)定[38],使得穿山甲種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離數(shù)值差異較大。此外,樹(shù)穿山甲的種內(nèi)遺傳距離均遠(yuǎn)大于其他種穿山甲,高于0.05,且在MJ-S、MJ-DCW中種間最小遺傳距離大于種內(nèi)最大遺傳距離,這表明在樹(shù)穿山甲中極有可能存在亞種[39-41]或隱蔽物種[18]。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(BI樹(shù)和ML樹(shù))法鑒別物種的判別標(biāo)準(zhǔn)：同一物種的不同個(gè)體聚為單系分支[42]。該研究中4組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),待測(cè)樣品均與已知物種的同源序列分別聚為單系(除馬來(lái)穿山甲)。過(guò)去菲律賓穿山甲常被認(rèn)為是馬來(lái)穿山甲的亞種,分布區(qū)重疊因海平面上升導(dǎo)致其被地理隔離[3],馬來(lái)穿山甲種群具有較高的遺傳多樣性。且該研究中菲律賓穿山甲的樣本量較少,需要進(jìn)一步增加其Cytb基因單倍型,以確定它們之間的關(guān)系[26]。序列長(zhǎng)度發(fā)生改變時(shí)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)部分分支的置信度值，甚至整個(gè)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)都會(huì)產(chǎn)生一定差異[43]。前3組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)將亞洲穿山甲和非洲穿山甲分為獨(dú)立分支,這與線粒體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[11]結(jié)構(gòu)相同；而MJ-DCW構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)則與之不同；且4組序列隨著序列長(zhǎng)度變小,其各物種分支的置信度有變小的趨勢(shì)。 因此,利用系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)法鑒別物種時(shí)要考慮序列長(zhǎng)度對(duì)結(jié)果判讀的影響。

注：節(jié)點(diǎn)后驗(yàn)概率/自舉值從上至下依次為MJ-L、MJ-M、MJ-S；不包含外群。Note:The posterior probability/bootstrap value are MJ-L，MJ-M，MJ-S from top to bottom;out groups are not included in the phylogenetic tree.圖3 基于MJ-L構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on MJ-L

圖4 基于MJ-DCW構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(不包含外群)Fig.4 Phylogenetic tree based on MJ-DCW (exculded out groups)