鄭 健，楊鎖柱，周艷萍，向泓銓，趙 津*

(1.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，云南玉溪 653100；2.玉溪華大高原農(nóng)業(yè)基因測序中心，云南玉溪 653100)

螺螄是一種軟體動物，隸屬田螺科(Viviparidae)螺螄屬(Margarya)，僅分布在我國云南省的高原湖泊中，為我國特有物種[1-2]。螺螄不僅是高原湖泊物種多樣性的重要組成部分，而且被列為《國家重點保護動物名錄》二級保護動物。除了在物種多樣性方面具有重要的生態(tài)地位外，螺螄在重金屬污染、水體有機污染等方面也有著獨特的生態(tài)指示功能[3-4]。滇池是云南省最大的高原淡水湖泊。王丑明等[5]2011年調查結果表明，滇池中的螺螄屬包括螺螄(Margaryamelanioides)、牟氏螺螄(M.monodi)、光肋螺螄(M.mansugi)、長螺螄(M.elongata)、 乳頂螺螄(M.tropidophora)等。其中，牟氏螺螄(Margaryamonodi)是螺螄屬中的一個特殊物種，僅分布在滇池。20世紀80年代以來水體污染、過度捕撈越來越嚴重，包含牟氏螺螄在內的螺螄種群數(shù)量急劇減少，2009年螺螄被世界自然保護聯(lián)盟列為極危物種。牟氏螺螄的種群變化不僅是螺螄屬物種多樣性變化的指征，而且是滇池水環(huán)境的重要指征。然而，目前對牟氏螺螄在內的螺螄屬生物的相關研究還相對較少，特別是對螺螄生存的微生物環(huán)境等方面缺乏了解。

近年來，隨著測序技術的進步，學者對人和其他動物腸道微生物的研究證實了腸道微生物對宿主健康、行為有著巨大的影響[6-7]。對于水生生物及軟體動物，腸道微生物同樣與它們的生存環(huán)境及健康密切相關[8-10]。腸道菌群作為螺螄體內微生物生態(tài)的一部分，其群落構建的機制及其對螺螄的影響尚不清楚。筆者通過使用3代全長擴增子測序技術對牟氏螺螄腸道菌群的16S rRNA基因進行高通量測序，比較野生和人工飼養(yǎng)牟氏螺螄腸道微生物組成和多樣性的差異，旨在揭示螺螄腸道菌群的形成機制，為螺螄的保護、馴養(yǎng)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品搜集2021年6月，從云南省昆明市的滇池水域采集并鑒定了8個活體牟氏螺螄。選取其中4個進行解剖，將其腸道內容物洗脫至5 mL無菌水中，-80 ℃下冷凍保存，作為野生組(W組)用于后續(xù)測序分析；其余4個牟氏螺螄放置在水箱中，使用25 ℃滇池水，以蒸煮后的海菜花和南瓜以及市售硅藻粉和螺旋藻粉為食物，在通氣條件下喂養(yǎng)2個月，然后進行解剖，作為飼養(yǎng)組(C)，取樣方法與W組相同。具體樣品信息見表1。

表1 采樣信息Table 1 The sample information

1.2 DNA提取及3代全長擴增子測序含有腸道內容物的液體混勻后，吸取250 μL，使用ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit進行總DNA提取。提取后的DNA使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，隨后使用Tecan F200進行核酸濃度檢測(PicoGreen染料法)。質量檢測合格的DNA使用引物對8F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行全長16S rRNA基因擴增。PCR程序如下：預變性98 ℃ 30 s，1個循環(huán)；98 ℃變性5 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，28個循環(huán)；72 ℃ 2 min，1個循環(huán)；4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物使用1% 瓊脂糖凝膠進行目的片段電泳檢測。檢測合格的樣品取目的條帶使用Zymoclean Gel Recovery Kit(D4008)進行回收，并使用Tecan F200定量；將所有樣品的待測產(chǎn)物等摩爾量混合后，使用Nanopore Ligation Sequencing Kit(SQK-LSK109)以及Nanopore Flow Cell Priming Kit(EXP-FLP002)構建測序文庫。最后，使用Nanopore GridION Mk1測序儀及MinION Flow Cell R9.4.1芯片，送至成都羅寧生物科技有限公司完成3代測序工作，單個樣本測序量保證3萬條以上。

1.3 數(shù)據(jù)分析原始Fast5序列使用Guppy軟件進行堿基解析(base calling)，獲得Fastq格式的序列文件。Fastq文件使用qcat進行樣品拆分。對拆分后的數(shù)據(jù)進行質量控制，保留序列平均質量 >Q10、長度1 300～1 600 bp的序列。使用Kraken2軟件結合SILVA數(shù)據(jù)庫v138對質量控制后的序列進行物種注釋，并合并每個物種的序列數(shù)目，構建物種豐度表(OTU表)。隨機選取每個物種內的一條序列作為代表性序列，使用MUSCLE進行多重比對，隨后使用FastTree構建Maximum-likelihood系統(tǒng)發(fā)育樹。

使用R語言V4.1.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。使用vegan包函數(shù)diversity計算樣品的α多樣性指數(shù)Chao1和Simpson。α多樣性的組間Kruskal-Wallis秩和檢驗使用kruskal.test函數(shù)。使用GUniFrac包分別計算Weighted(豐度加權)UniFrac和Unweighted(非豐度加權)UniFrac β多樣性矩陣。NMDS(非度量多維尺度)分析使用vegan包中的metaMDS函數(shù)。β多樣性矩陣的組間ANOSIM分析使用vegan包中的anosim函數(shù)進行。random forest差異物種分析使用random forest包。

2 結果與分析

2.1 野生和飼養(yǎng)牟氏螺螄的腸道菌群群落組成從群落組成角度，該研究重點關注了門水平和種水平的群落組成及組間差異。從門水平來看，野生組和飼養(yǎng)組的主要物種組成差異不大(圖1)。相對豐度在1%以上的門為Proteobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes。從種水平來看，主要使用韋恩圖分析了組間獨有和共有物種的組成情況。2組間共有物種670個，這些物種占總體物種豐度的96.97%。 W組獨有物種為262個、C組獨有物種為159個，分別占總體物種豐度的1.93%和1.10%。由此可見，野生和飼養(yǎng)牟氏螺螄的微生物組成總體區(qū)別不大，雖然2組存在多種稀有物種，但占比極低。由此可見，野生牟氏螺螄在人工飼養(yǎng)馴化過程中，核心腸道菌群保持了相對的魯棒性。

圖1 野生(W組)和人工飼養(yǎng)(C組)牟氏螺螄門水平(A)和種水平(B)組成分析Fig.1 The composition analysis of M. monodi at phylum level(A)and species level(B)in wild group (W) and culture group (C)

2.2 野生和飼養(yǎng)牟氏螺螄的腸道菌群多樣性差異群落多樣性分別從α多樣性和β多樣性2個角度進行了分析。α多樣性表征的是樣品的多樣性指標，圖2分別展示了Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)的多樣性結果?？傮w來看，2個α多樣性指數(shù)都表現(xiàn)出W組比C組有著更高的多樣性。其中Chao1指數(shù)W組和C組間存在顯著差異(P<0.05)。Simpson指數(shù)雖然2組間存在一定差異，但2組間差異不顯著。究其原因，Chao1指數(shù)對稀有物種較Simpson指數(shù)有更多的加權。由此可見，從α多樣性角度來看，W組和C組間的差異更多地體現(xiàn)在稀有物種的丟失導致的群落豐富度和均勻度的降低。

組間的多樣性差異使用β多樣性來表征，這里采用基于UniFrac距離矩陣的β多樣性NMDS排序分析(圖3)?；诩訖嗟腢niFrac距離的NMDS分析(圖3A)中，W組和C組并沒有出現(xiàn)明顯的分隔；基于非加權的UniFrac距離的NMDS分析(圖3B)中，W組和C組存在明顯的各自成簇趨勢。基于2種UniFrac距離矩陣的ANOSIM的定量差異統(tǒng)計分析也證實了這一結果：加權的UniFrac組間ANOSIM分析結果中r=0.281 3、P=0.135，表示不存在顯著差異；非加權的UniFrac組間ANOSIM分析結果中r=0.708 3、P=0.031，P<0.05表示存在顯著差異。這表明群落構建的組間差異主要是由于物種組成的變化而不是物種豐度的變化造成的。

圖2 野生(W組)和人工飼養(yǎng)(C組)牟氏螺螄腸道菌群α多樣性比較Fig.2 Alpha diversity comparison of intestinal flora in M. monodi between wild group(W) and culture group(C)

注：A.Weighted UniFrac；B.Unweighted UniFrac。圖3 基于UniFrac距離的NMDS排序圖Fig.3 NMDS ranking based on UniFrac distance

上述基于多樣性的分析結果表明，野生和飼養(yǎng)牟氏螺螄的腸道微生物存在差異。這一差異是由于稀有菌群在馴化飼養(yǎng)過程中的丟失造成的。由于飼養(yǎng)過程中主要是食物產(chǎn)生了變化，因此推測造成這一結果的原因有2個：一是由于在飼養(yǎng)過程中食物是經(jīng)過高溫滅菌的，所以食物所攜帶的微生物變少，飼養(yǎng)螺螄失去了來自食物的微生物在其腸道中的持續(xù)定殖，因此腸道微生物呈現(xiàn)多樣性降低的過程。二是食物種類的變化對宿主腸道微生物有較大的影響。食物的類型會顯著影響宿主腸道微生物的多樣性，例如Bolnick等[11]研究發(fā)現(xiàn)三刺魚和河鱸的腸道微生物多樣性與食物的多樣性呈負相關，而牟氏螺螄的食物多樣性降低帶來了腸道菌群多樣性的降低。

2.3 野生和飼養(yǎng)牟氏螺螄的腸道菌群差異物種分析從組成和多樣性角度來看，W組和C組間的差異主要是由于低豐度物種的丟失造成的。該研究使用基于隨機森林的機器學習方法來鑒定存在組間差異的物種(圖4)，平均基尼指數(shù)下降度(Mean Decrease Gini)越大，說明該物種對組間差異的貢獻度越大。該研究共篩選出12個存在組間差異的物種(P<0.05)，其中10個為相對豐度均低于1%的低豐度物種，其余2個物種的相對豐度也低于5%。這一結果進一步驗證了多樣性研究的結論。12個物種中8個物種在培養(yǎng)過程中被富集(C組相對豐度大于W組)，分別為Streptococcusinfantarius、Ottowiasp.oral taxon 894、Pseudomonassilesiensis、Pseudomonasprotegens、Bacteroidesfragilis、Pseudomonassyringae、Actinobacilluspleuropneumoniae以及Bartonellasp.Raccoon 60。4個在培養(yǎng)過程中被選擇性過濾的物種分別為Mycoplasmamobile、Variovoraxsp.PMC12、Stenotrophomonasmaltophilia、Sphingomonassp.LK11。無論是富集還是被過濾掉的差異微生物，絕大多數(shù)都屬于變形菌門。這些微生物也是環(huán)境中常見的物種，通常分布在人、動植物的生存環(huán)境中，很多是宿主的病原菌[12-14]。

組間差異物種中，M.mobile相對于其他差異物種而言比較特殊。雖然該菌在野生組中的平均相對豐度很低(0.27%)，但在人工飼養(yǎng)過程中直接消失。該菌是1987年首次被報道從魚腸道中分離得到的一種病原菌[15]。North等[16]通過高通量測序的方法發(fā)現(xiàn)了一種未分類的Mycoplasmasp.，該物種以極低的豐度存在于Biomphalariaglabrata、Cipangopaludinajaponica等田螺科物種的腸道中。Mycoplasmasp.是一類寄生在細胞間的微生物，其與軟體動物的結合能力被認為與動物唾液酸的殘留有關[17-18]。由于該研究采用3代測序技術測定了全長16S rRNA基因，因此在前人研究的基礎上進一步確定了在牟氏螺螄中這一微生物為M.mobile。由于M.mobile在野生和人工飼養(yǎng)牟氏螺螄內的分布特點，其可以作為區(qū)分牟氏螺螄來源的指征菌。綜上所述，差異物種分析驗證了多樣性分析結果，低豐度的稀有物種是造成組間差異的重要原因。同時，筆者發(fā)現(xiàn)M.mobile在人工馴化飼養(yǎng)的過程中會完全消失，可以作為區(qū)分野生和飼養(yǎng)牟氏螺螄的指征微生物。

注：A.Weighted UniFrac；B.Unweighted UniFrac。圖4 基于隨機森林方法的組間差異物種分析Fig.4 Differential species analysis between different groups based on random forest method

3 結論

牟氏螺螄作為滇池特有的螺螄屬物種和極危物種，具有很高的研究價值。該研究首次通過使用3代全長16S rRNA基因高通量測序，對野生和飼養(yǎng)牟氏螺螄的腸道微生物進行了比較。該研究發(fā)現(xiàn)野生和飼養(yǎng)牟氏螺螄腸道的核心菌群相似性很高，主要由Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes等門組成。多樣性和差異物種分析表明，占總體物種豐度較小的稀有物種在人工飼養(yǎng)過程中的丟失是造成牟氏螺螄腸道菌群組間差異的主要原因。此外，M.mobile可以作為野生和飼養(yǎng)牟氏螺螄的指征菌，在飼養(yǎng)過程中該菌會消失。筆者首次報道了牟氏螺螄在野生和人工飼養(yǎng)過程中腸道微生物的組成及多樣性的變化，為牟氏螺螄的保護和繁育提供了一定的理論依據(jù)。