田 甜，嚴(yán) 晶，代 嬌

（曲靖醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，云南曲靖 655000）

糖尿病是最常見的以高血糖為特征的代謝性疾病，由內(nèi)源性胰島素分泌不足或作用缺陷引起。據(jù)估計(jì)，到2040 年全球范圍內(nèi)20～79 歲糖尿病患者將增至約6.42 億，比2015 年增加62%〔1〕，2 型糖尿病患者約占糖尿病患者的90%～95%。由于高血糖和胰島素抵抗綜合征，2 型糖尿病患者發(fā)生大血管和微血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)較高，如心血管疾病、糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）、糖尿病腎病和糖尿病神經(jīng)病變等〔2〕。高血糖會(huì)導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激增加，使神經(jīng)視網(wǎng)膜組織和微血管系統(tǒng)的適應(yīng)性受到炎癥攻擊，從而引發(fā)DR〔3〕。臨床上，DR 可根據(jù)嚴(yán)重程度分為非增殖型和增殖型。若處于非增殖型的DR 患者眼血管層存在病變，眼底可出現(xiàn)微血管瘤、出血、滲出或黃斑水腫等。增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）的特征是病理性視網(wǎng)膜新生血管形成和視網(wǎng)膜血管滲漏，嚴(yán)重者伴發(fā)新生血管性青光眼等并發(fā)癥導(dǎo)致視力喪失。DR 是20～74 歲成年人新發(fā)失明的最常見原因，早期診斷和有效的治療可以延遲DR 發(fā)生、進(jìn)展〔4〕。因此，識(shí)別與DR 嚴(yán)重程度相關(guān)的臨床診斷生物標(biāo)志物可能有利于DR 的早期檢測(cè)和管理。微RNA（microRNA，miRNA）是一種由21～23 個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子可通過靶向mRNA 的3'-非翻譯區(qū)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。越來越多的證據(jù)表明，miRNA 可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等細(xì)胞生物學(xué)過程來調(diào)節(jié)DR 進(jìn)展〔5〕。如miR-219-5p 通過肝受體同系物-1/Wnt 信號(hào)通路調(diào)控人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡改變DR 的發(fā)展；miR-152 可以通過靶向LIN28B 抑制視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中由高糖引起的血管生成。作為miRNA 家族的重要成員，miR-122 和miR-1281 被證明參與胃癌、肝癌及缺血性腦卒中等疾病的調(diào)控，且已被證實(shí)在糖耐量受損的患者中其表達(dá)水平顯著升高。目前關(guān)于miR-122 和miR-1281 是否在DR 中存在表達(dá)異常且是否與疾病嚴(yán)重程度存在關(guān)聯(lián)，尚不清楚。本研究通過對(duì)DR 患者外周血miR-1281 和miR-122 的變化情況，探討其與視網(wǎng)膜病變嚴(yán)重程度的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2020 年2 月至2021 年9 月在曲靖市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的2 型糖尿病患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)為符合世界衛(wèi)生組織公布的2 型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)者；排除標(biāo)準(zhǔn)為患有高血壓、冠心病、嚴(yán)重肺部疾病、嚴(yán)重肝腎疾病、嚴(yán)重感染或腫瘤者。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)最終納入患者127例，通過查看病歷資料收集患者的年齡、性別、體重指數(shù)（body mass index，BMI）和糖尿病病程。由2 名經(jīng)驗(yàn)豐富的眼科視網(wǎng)膜專家根據(jù)美國(guó)眼科協(xié)會(huì)制定的糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床實(shí)踐指南〔6〕對(duì)納入研究的糖尿病患者行視網(wǎng)膜病變?cè)u(píng)估，并基于眼底照片和熒光素眼底血管造影結(jié)果加以判斷。根據(jù)評(píng)估結(jié)果將患者分為3 組，其中，非DR 者55 例納入NDR 組、非PDR 者42 例納入NPDR 組、PDR 者30例納入PDR 組。選取同期健康人群40 例為對(duì)照組。本研究通過曲靖市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過，所有納入研究者簽署知情同意書。

1.2 樣本收集及處理收集空腹靜脈血，所有血樣在25 ℃、1 200 g 條件下離心10 min，分離血清并保存于-80 ℃冰箱中備用。使用miRNeasy Serum/Plasma 試劑盒（QIAGEN，批號(hào)：217184）分離總RNA，洗脫體積為14 μL。洗脫后，RNA 樣品儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)室資料使用日立7600 全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、糖化血紅蛋白（glycosylatedhemoglobin，HbA1c）、肌酐（creatinine，Cr）和血脂，血脂包括總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。使用羅氏Combase602 全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定空腹血清胰島素（fasting serum insulin，F(xiàn)INS）水平，通過HOMA-IR 指數(shù)評(píng)估胰島素抵抗水平〔7〕。HOMA-IR指數(shù)=FINS（μU/mL）×FBG（mmol/L）/22.5。

1.4 miR-122 和miR-1281 的擴(kuò)增將提取的總RNA 在ABI 7500 PCR 儀中反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為10 μL。相關(guān)引物序列由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成。見表1。以每孔1 μL 的cDNA 為模板，U6 作為內(nèi)參，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒檢測(cè)miR-122 和miR-1281 的表達(dá)情況。每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃10 min 預(yù)變性；95 ℃10 s，60 ℃20 s，72 ℃10 s，40 個(gè)循環(huán)。miR-122 和miR-1281 的表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量。

表1 miR-122 和miR-1281 的引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（）表示，組間比較使用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用［n（%）］表示，組間比較使用單因素方差分析；使用Spearman 相關(guān)性分析法對(duì)miR-122、miR-1281 與其他指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；使用受試者操作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC 曲線）判斷miR-122 和miR-1281 的診斷性能。

2 結(jié)果

2.1 一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較從4 組人群的一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較結(jié)果可以看出，除FBG、HbA1c 和HOMA-IR 指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）外，其他指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。FBG、HbA1c 和HOMA-IR 指數(shù)水平隨著3組患者病情的加重而升高，其數(shù)值均為PDR 組高于NPDR 組，NPDR 組高于NDR 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

2.2 miR-122 和miR-1281 表達(dá)水平的比較與對(duì)照組比較，除NDR 組患者血清miR-122 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他組別患者血清miR-122和miR-1281 表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與NDR 組比較，NPDR 組和PDR 組患者血清miR-122 和miR-1281 表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PDR 組患者血清miR-122 和miR-1281 表達(dá)水平顯著高于NPDR 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組間血清miR-122 和miR-1281表達(dá)水平比較

2.3 miR-122 和miR-1281 水平與DR 患者臨床資料相關(guān)性分析相關(guān)性結(jié)果顯示，所有DR 患者（僅包含NPDR 組和PDR 組患者）血清miR-122 和miR-1281 與病程、HbA1c 和HOMA-IR 指數(shù)存在顯著正相關(guān)，與其他指標(biāo)的相關(guān)性不顯著。見表3。

表3 miR-122 和miR-1281 水平與DR 患者臨床資料相關(guān)性分析

2.4 血清miR-122 和miR-1281 的診斷性能將PDR 組作為疾病組，NDR 組和NPDR 組作為參照組，繪制血清miR-122 和miR-1281 的ROC 曲線。結(jié)果顯示，miR-122 和miR-1281 對(duì)于鑒別PDR 的診斷性能較好，曲線下面積（area under the curve，AUC）分別為0.81 和0.86。miR-122 的敏感性和特異度分別為0.80 和0.82；miR-1281 的敏感性和特異度分別為0.86 和0.71。見圖2。

圖2 血清miR-122 和miR-1281 的ROC 曲線圖

3 討論

DR 是糖尿病患者的主要并發(fā)癥，考慮到其對(duì)患者視力的嚴(yán)重影響以及治療策略的局限性，尋找DR 的潛在診療靶點(diǎn)至關(guān)重要。高血糖是DR 發(fā)病的主要原因，它可以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（retinal endothelial cell，REC）死亡。miRNA 被證明參與DR的調(diào)節(jié)，Martinez 等〔5〕報(bào)道DR 患者玻璃體液中miRNA 失調(diào)，表明miRNA 可能是DR 的生物標(biāo)志物。此外，一些miRNA 參與了REC 功能的調(diào)控，例如，miR-34a 在高糖誘導(dǎo)的REC 中可調(diào)節(jié)應(yīng)激相關(guān)的過早衰老〔8〕。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)一些miRNA 與DR 疾病進(jìn)展相關(guān)，在循環(huán)miRNA 分析研究中，miR-27b、miR-320a 和miR-126 的異常表達(dá)在1 型糖尿病和DR 患者中得到驗(yàn)證〔9〕。有研究〔10〕報(bào)道與非PDR 患者相比，miR-21、miR-181c 和miR-1179 在PDR 患者中顯著上調(diào)，而miR-3197 和miR-2116-5p 在伴隨DR 的糖尿病患者中水平更高。此外，使用RNA-Seq 方法發(fā)現(xiàn)miR-4448、miR-338-3p、miR-190a-5p、miR-485-5p 和miR-9-5p在DR 患者血清中亦出現(xiàn)了差異表達(dá)〔11〕。然而，有些研究結(jié)果存在差異，如有研究發(fā)現(xiàn)miR-320a 在DR中上調(diào)，而在另一研究中其水平則顯著下調(diào)〔12〕。這可能是因?yàn)樗x擇患者存在種族、年齡、納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的差異造成的。

本研究表明，miR-122 的水平與DR 的嚴(yán)重程度有關(guān)，且其水平隨著病情嚴(yán)重程度明顯增加。在基于大人群的Bruneck 研究中，循環(huán)的miR-122 水平與胰島素抵抗、肥胖、代謝綜合征、2 型糖尿病和不良血脂狀況有關(guān)。此外，有研究證實(shí)用阿托伐他汀治療12 個(gè)月后，循環(huán)的miR-122 顯著下降〔13〕。以上研究都表明，循環(huán)的miR-122 與發(fā)展代謝綜合征和2 型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。miR-122-5p/133b 比率被發(fā)現(xiàn)是接受初級(jí)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療的急性心肌梗死患者發(fā)生主要不良事件風(fēng)險(xiǎn)較高的預(yù)后生物標(biāo)志物〔14〕。高脂血癥患者的血漿中miR-122 的水平明顯升高，且miR-122 水平與TC、TG 和LDL-C 水平呈正相關(guān)。miR-122 的水平增加與冠狀動(dòng)脈疾病有關(guān)，并與冠狀動(dòng)脈疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。最近報(bào)道減肥手術(shù)患者的血清miR-122 水平增加，這與內(nèi)皮功能的改善相關(guān)〔15〕。本研究表明，miR-122 水平的增加與糖尿病微血管并發(fā)癥的嚴(yán)重程度相關(guān)。miR-122 可以作為DR 嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物，其敏感性和特異度均較高，可能是它參與了缺氧依賴的血管增殖和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)。

對(duì)于miR-1281，目前僅少數(shù)研究將其確定為人類疾病的潛在生物標(biāo)志物，包括腹主動(dòng)脈瘤、冠心病和肺動(dòng)脈高壓、慢性腎病、免疫性血小板減少性紫癜和惡性胸膜間皮瘤〔16-20〕。本研究中發(fā)現(xiàn)其在DR 患者中也顯著升高，暗示miR-1281 可作為潛在的生物標(biāo)志物來評(píng)估視網(wǎng)膜病變的疾病進(jìn)展，甚至輔助疾病診斷。既往研究證實(shí)miR-1281 在糖尿病患者的中央角膜以及慢性腎病患者的血漿和尿液樣本中上調(diào)，而角膜病變和慢性腎病通常是繼發(fā)于控制不佳的糖尿病〔21〕。Greco 等〔22〕對(duì)ARPE-19 視網(wǎng)膜細(xì)胞的體外細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果表明，高糖處理后miR-1281 分泌水平顯著高于低糖條件下，并觀察到用miR-1281 處理導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）mRNA 豐度和VEGFA 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性增加，可以推測(cè)在慢性葡萄糖過量的情況下視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞會(huì)過度表達(dá)miR-1281，可能通過激活相鄰內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生VEGFA 蛋白在DR 中發(fā)揮致病作用，從而誘導(dǎo)VEGFA 介導(dǎo)的新血管生成和視網(wǎng)膜血管損傷。miR-1281 如何上調(diào)VEGFA基因轉(zhuǎn)錄尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)分析表明，miR-1281 可能靶向缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）抑制因子的mRNA 序列，由于miR-1281 誘導(dǎo)的HIF-1α抑制因子具有不穩(wěn)定性，易發(fā)生降解，會(huì)導(dǎo)致HIF-1α 的積累以及視網(wǎng)膜和中樞神經(jīng)血管功能活性受損，促使HIF-1α 表達(dá)的進(jìn)一步上調(diào)，因此，增強(qiáng)了缺氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，包括VEGFA。下一步將圍繞miR-1281 在VEGFA 通過HIF-1α 引起的葡萄糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷中是否具有功能作用進(jìn)行探究。

綜上所述，本研究初步證實(shí)DR 患者血清miR-122 和miR-1281 顯著升高，且與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。ROC 曲線顯示這2 種生物標(biāo)志物具有較好的鑒別PDR 與非PDR 的診斷性能。