程明璟，嚴(yán) 萍，樊玉娟，趙衛(wèi)東*

（1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，云南大理 671000）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染與胃炎、消化性潰瘍、淋巴瘤和胃癌等疾病相關(guān)，全球每年新發(fā)胃癌病例中約60%與H.pylori 慢性感染相關(guān)〔1-2〕。因此，H.pylori 慢性感染的防治已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問題。深入研究H.pylori 慢性感染機(jī)制，根除H.pylori 感染，是預(yù)防胃癌的重要方法〔3〕。針對(duì)H.pylori 慢性感染的免疫學(xué)機(jī)制探討根除H.pylori 感染的有效治療方法，是國內(nèi)外感染與免疫學(xué)領(lǐng)域面臨的重大課題。近年來，借助生物信息學(xué)分析方法尋找各類疾病發(fā)生、發(fā)展過程中重要的靶標(biāo)分子已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)〔4〕?；诖?，本研究利用公開發(fā)表數(shù)據(jù)庫中H.pylori 感染的相關(guān)數(shù)據(jù)資料，借助生物信息學(xué)方法分析H.pylori 感染過程中發(fā)生顯著變化的核心基因及其影響的重要生物學(xué)過程，以期為H.pylori 感染的根除以及對(duì)胃癌的防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集利用關(guān)鍵詞“Helicobacter pylori”“Homo sapiens”在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）創(chuàng)建的基因表達(dá)綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）進(jìn)行檢索，共檢索到665 個(gè)數(shù)據(jù)集，經(jīng)篩選后，3 個(gè)數(shù)據(jù)集（GSE6143、GSE60427、GSE60662）成為目標(biāo)數(shù)據(jù)集，隨后下載3 個(gè)數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)文件，其中，GSE6143 數(shù)據(jù)集來源于GPL193 測序平臺(tái)，共包括24 個(gè)樣本（8 個(gè)H.pylori 陰性樣本，16 個(gè)H.pylori陽性樣本）；GSE60427 數(shù)據(jù)集來源于GPL17077 測序平臺(tái)，共包括32 個(gè)樣本（8 個(gè)H.pylori 陰性樣本，24 個(gè)H.pylori 陽性樣本）；GSE60662 數(shù)據(jù)集來源于GPL13497 測序平臺(tái)，共包括16 個(gè)樣本（4 個(gè)H.pylori 陰性樣本，12 個(gè)H.pylori 陽性樣本）。

1.2 差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）的篩選利用NCBI 網(wǎng)站提供的在線分析軟件GEO2R 對(duì)GSE6143、GSE60427 和GSE60662 數(shù)據(jù)集進(jìn)行DEGs 分析，分析時(shí)以H.pylori 陰性樣本為對(duì)照組，H.pylori 陽性樣本為實(shí)驗(yàn)組，并計(jì)算出每個(gè)基因變化倍數(shù)的絕對(duì)值（|lgFC|）和校正P 值，當(dāng)基因同時(shí)滿足|lgFC|≥1.0 和P＜0.05 時(shí)，該基因被視為DEGs，利用韋恩圖表示以上3 個(gè)數(shù)據(jù)集DEGs 中共同的核心基因。

1.3 KEGG 通路富集分析和GO 分析為了探索核心基因影響的細(xì)胞通路及基因本體特點(diǎn)，使用在線軟件Enrichr（https：//maayanlab.cloud/Enrichr/）對(duì)核心基因進(jìn)行KEGG 通路富集和GO 分析，根據(jù)綜合得分排名將前10 條信息進(jìn)行展示。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析為了進(jìn)一步弄清H.pylori 感染人體后核心基因表達(dá)的蛋白質(zhì)之間的相互作用，利用在線軟件STRING（https：//string-db.org/）建構(gòu)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，當(dāng)配對(duì)分?jǐn)?shù)＞0.4 時(shí)，認(rèn)為2個(gè)蛋白質(zhì)之間存在相互作用；利用Cytoscape 軟件分析配對(duì)蛋白質(zhì)，并計(jì)算每個(gè)蛋白質(zhì)的度值，當(dāng)度值≥5 分時(shí)，將其確定為重要蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 DEGs 篩選結(jié)果以基因表達(dá)|lgFC|≥1.0 和P ＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，GSE6143、GSE60427 和GSE60662 中分別有178 個(gè)、256 個(gè)和130 個(gè)DEGs。利用韋恩圖表示3 個(gè)數(shù)據(jù)集中共有的DEGs，共篩選到29 個(gè)核心基因，分別為IFNAR2、TRAF1、ICAM1、CASP1、TLR4、TGFB1、ENG、CCL19、CXCL3、CR2、C3、EMP3、ICAM3、CCL4、MFNG、GATD3A、ATP2A3、IGF1R、PTPN21、PTPN14、DKK3、HDAC5、FGFR4、PAK1、BAG1、IL1RL2、TLR5、PTPN9 和IL9R。見圖1。

圖1 核心基因篩選韋恩圖

2.2 核心基因的KEGG 通路富集分析為進(jìn)一步探索29 個(gè)核心基因的通路富集情況，對(duì)其進(jìn)行了KEGG 通路富集分析，富集結(jié)果顯示，核心基因主要涉及軍團(tuán)菌病、瘧疾、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路、炎癥性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、利什曼病和百日咳等方面。見表1。

表1 核心基因的KEGG 通路富集情況

2.3 核心基因的GO 分析為了進(jìn)一步探索29 個(gè)核心基因的特性及其生物學(xué)功能，對(duì)其進(jìn)行了GO分析，包括細(xì)胞組成分析、生物過程分析和分子功能分析。細(xì)胞組成分析結(jié)果顯示，核心基因主要存在于蛋白激酶復(fù)合物、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、血小板致密管狀網(wǎng)絡(luò)膜、血小板致密管狀網(wǎng)絡(luò)和肌漿網(wǎng)膜中；生物過程分析結(jié)果顯示，核心基因主要參與補(bǔ)體激活替代途徑、心內(nèi)膜墊形成的上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子β 刺激的反應(yīng)調(diào)節(jié)、核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)和細(xì)胞外基質(zhì)分解的調(diào)節(jié)等過程；分子功能分析結(jié)果顯示，核心基因的分子功能包括Ⅱ型轉(zhuǎn)化生長因子β 受體結(jié)合、Ⅰ型轉(zhuǎn)化生長因子β受體結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶激活劑活性參與凋亡過程、成纖維細(xì)胞生長因子激活受體活性和干擾素受體活性等。見表2。

表2 核心基因的GO 分析情況

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析為進(jìn)一步了解核心基因所表達(dá)蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系，使用在線軟件STRING 對(duì)其進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析。見圖2A。根據(jù)度值高低進(jìn)行排序，度值越高表明與之相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)數(shù)量越多，其在PPI 網(wǎng)絡(luò)中越重要。PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，排名第1 位的蛋白質(zhì)為TLR4（度值為13），第2位至第13 位的蛋白質(zhì)依次為ICAM1（度值為12），CCL4（度值為7），TLR5、CCL19、CR2（度值均為5），TGFB1、CASP1、CXCL3（度值為4），C3、ENG（度值均 為3），ICAM3、TRAF1（度值均為2）。使 用Cytoscape 軟件將度值≥5 分的重要蛋白質(zhì)進(jìn)行可視化展示，相互作用關(guān)系見圖2B。

圖2 核心基因表達(dá)蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

3 討論

本研究通過分析公共數(shù)據(jù)庫中H.pylori 感染相關(guān)的數(shù)據(jù)資料，篩選出H.pylori 感染者與未感染者之間的DEGs，并對(duì)這些DEGs 進(jìn)行了KEGG 通路富集分析和GO 分析。分析結(jié)果顯示，H.pylori 感染機(jī)體后激活了炎癥免疫反應(yīng)。在PPI 網(wǎng)絡(luò)分析中發(fā)現(xiàn)H.pylori 感染機(jī)體后趨化因子（如TLR4、ICAM1、CCL4、TLR5、CCL19、CR2 等重要蛋白質(zhì)）較為活躍。

TLR4，又稱Toll 樣受體4，是Poltorak 等于1998 年發(fā)現(xiàn)的，可作為脂多糖、脂磷壁酸等病原相關(guān)分子模式受體，進(jìn)一步激活天然免疫反應(yīng)〔5〕。TLR4被認(rèn)為參與了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，Hu 等〔6〕通過泛癌研究發(fā)現(xiàn)TLR4 的表達(dá)與胃癌、腎透明細(xì)胞癌、黑色素瘤和子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后相關(guān)。此外，TLR4 亦可通過激活JNK 信號(hào)通路促進(jìn)肝臟炎癥反應(yīng)〔7〕。在H.pylori 感染中，TLR4 介導(dǎo)了機(jī)體對(duì)H.pylori的識(shí)別，并引起宿主的抗H.pylori 免疫反應(yīng)〔8〕。在TLR4 基因多態(tài)性研究方面，rs4986790 多態(tài)性可顯著增加H.pylori 感染風(fēng)險(xiǎn)〔9〕，而rs1057317 多態(tài)性亦可明顯增加H.pylori 感染所致的胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)〔10〕。

ICAM1，又稱細(xì)胞間黏附分子1 或CD54，主要參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長、炎癥和血管生成，對(duì)白細(xì)胞活化及遷移具有重要作用〔11〕。因此，ICAM1被認(rèn)為參與了多種癌癥的轉(zhuǎn)移和浸潤，包括乳腺癌〔12〕、前列腺癌〔13〕和結(jié)直腸癌〔14〕等。早在2002年，Innocenti 等〔15〕發(fā)現(xiàn)H.pylori 感染后可顯著促進(jìn)黏附相關(guān)因子ICAM1 的表達(dá)。隨后，De Jesus等〔16〕研究也表明H.pylori 的尿素酶會(huì)引起ICAM1表達(dá)升高，而ICAM1 進(jìn)一步促進(jìn)了H.pylori 對(duì)胃黏膜的黏附。

CCL4，又稱巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β，主要由活化的單核細(xì)胞分泌，可趨化淋巴細(xì)胞至炎癥部位。在多種癌癥中CCL4 亦可通過招募細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞而加強(qiáng)抗腫瘤免疫〔17〕。此外，有研究〔18〕發(fā)現(xiàn)H.pylori 感染后胃黏膜中的CCL4 表達(dá)明顯增強(qiáng)，并且CCL4 升高水平與感染部位炎癥細(xì)胞浸潤高度相關(guān)。

TLR5，又稱Toll 樣受體5，其是識(shí)別鞭毛蛋白的主要胞外受體。H.pylori 感染后，其菌毛相關(guān)蛋白CagY可活化TLR5，從而引起機(jī)體的固有免疫反應(yīng)〔19〕。而H.pylori 的菌毛蛋白FlaA 可逃避TLR5 介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)〔20〕。在胃活檢組織中，Pachathundikandi 等〔21〕發(fā)現(xiàn)TLR5 表達(dá)與H.pylori 感染和胃黏膜病變相關(guān)。

CCL19，又稱巨噬細(xì)胞炎性蛋白3β，主要由次級(jí)淋巴組織中的T 淋巴細(xì)胞分泌，可趨化成熟樹突狀細(xì)胞和幼稚T 淋巴細(xì)胞。H.pylori 感染后，胃黏膜細(xì)胞分泌CCL19，趨化CCR7+樹突狀細(xì)胞至淋巴結(jié)，最終誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)〔22〕。而CCL19 在H.pylori 感染相關(guān)胃癌中的研究較少，仍需進(jìn)一步探究。

CR2，又稱Ⅱ型補(bǔ)體受體，分布于單核細(xì)胞和B細(xì)胞表面，主要調(diào)節(jié)B 細(xì)胞的增殖和分化，此外也是EB 病毒的受體〔23〕。目前，雖然關(guān)于CR2 與H.pylori感染之間的直接研究較少，但是有學(xué)者發(fā)現(xiàn)H.pylori感染可促進(jìn)EB 病毒對(duì)胃黏膜細(xì)胞的黏附〔24〕，具體機(jī)制仍有待研究。

綜上所述，H.pylori 感染機(jī)體后引起機(jī)體免疫反應(yīng)，尤其是機(jī)體固有免疫反應(yīng)。同時(shí)TLR4、ICAM1、CCL4、TLR5、CCL19 和CR2 在H.pylori 感染相關(guān)疾病中也發(fā)揮了重要作用，可為進(jìn)一步研究H.pylori 感染相關(guān)疾病提供參考。