何思悅，唐紫云，劉 衡，張成桂，周 雯，畢子瑩，周 玥*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000）

慢性髓細(xì)胞性白血?。╟hronic myelogenous leukemia，CML）是一種惡性骨髓增生性腫瘤，占成人白血病發(fā)病率的15%。目前酪氨酸激酶抑制劑是靶向治療的主要方式，但治療過(guò)程中易出現(xiàn)多種不良反應(yīng)和副作用，對(duì)患者的治療和生活造成極大的影響〔1〕。近年來(lái)，中藥在白血病治療方面的作用得到廣泛關(guān)注，中藥在抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、聯(lián)合放化療、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等方面效果顯著〔2〕。美洲大蠊Periplaneta americana L.隸屬蜚蠊科，古時(shí)多用于創(chuàng)傷修復(fù)、祛腐生肌、清熱解毒等，現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)美洲大蠊具有增強(qiáng)免疫力、抗病毒等多種藥理活性，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有不同程度的抑制作用，而且原材料豐富，容易獲取，應(yīng)用前景廣泛。有研究〔3-4〕表明，通過(guò)不同提取方法得到的多種美洲大蠊提取物對(duì)K562 細(xì)胞的增殖有不同程度的抑制作用，但具體機(jī)制尚不清楚。美洲大蠊提取物CⅡ-3 是提取于美洲大蠊的一種小分子肽〔5〕，主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤血管的生成及轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等方面發(fā)揮其抗癌作用〔6〕。本研究探究美洲大蠊提取物CⅡ-3 對(duì)人白血病細(xì)胞K562 增殖的影響，為開(kāi)發(fā)低毒有效的抗腫瘤藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料美洲大蠊提取物CⅡ-3 由大理大學(xué)藥學(xué)院張成桂教授提供；K562 細(xì)胞（齊式生物科技有限公司）；RPMI1640 培養(yǎng)基（美侖生物公司，批號(hào)：C0039）；胎牛血清（Vivacell 公司，批號(hào)：2025067）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（北京索萊寶科技公司，批號(hào)：P1003）；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（KeyGEN BioTECH 公司，批號(hào)：KGA512）；磷酸化p53 抗體（Abcam 公司，批號(hào)：ab32132）；羊抗兔抗體（Sigma 公司，批號(hào)：40839）；ECL 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（PIERCE 公司，批號(hào)：32209）。

1.2 儀器多功能酶標(biāo)儀（BIO-RAD 公司）；高壓蒸氣滅菌器（Sanyo 公司）；生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Sanyo 公司）；低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；倒置顯微鏡（Motic 公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)板（上海醫(yī)用儀器廠(chǎng)）；流式細(xì)胞儀（Beckman 公司）；垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置（BIO-RAD 公司）；圖像分析系統(tǒng)（LabworksTM Analysis Software 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用RPMI1640 培養(yǎng)基（含10% 胎牛血清）于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)K562 細(xì)胞，培養(yǎng)2～3 d 計(jì)數(shù)并傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562 細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL 的密度將細(xì)胞接種于96 孔板內(nèi)，每孔100 μL，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為5、10、20、40、80、160 μg/mL 的CⅡ-3，每孔50 μL，每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照組（僅有K562 細(xì)胞，不加CⅡ-3，以下簡(jiǎn)稱(chēng)“對(duì)照組”），置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24、48、72 h，加入10 μL CCK-8 溶液，孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=［（對(duì)照組OD 值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/（對(duì)照組OD 值-空白組OD 值）］×100%，其中，空白組僅有培養(yǎng)基，用于消除計(jì)算時(shí)培養(yǎng)基內(nèi)酚紅對(duì)OD 值的影響。

2.3 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)照組細(xì)胞和經(jīng)80 μg/mL CⅡ-3 處理72 h 的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以1×103個(gè)/mL的密度接種于24 孔板內(nèi)，每孔500 μL，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育7 d，倒置顯微鏡下觀(guān)察并計(jì)數(shù)細(xì)胞集落數(shù)，以細(xì)胞數(shù)＞50 為1 個(gè)集落，計(jì)算細(xì)胞集落形成率和細(xì)胞集落抑制率。細(xì)胞集落形成率（%）=（細(xì)胞平均集落數(shù)/每孔加入的細(xì)胞數(shù)）×100%；細(xì)胞集落抑制率（%）=［（對(duì)照組細(xì)胞集落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞集落數(shù)）/對(duì)照組細(xì)胞集落數(shù)］×100%。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期收集對(duì)照組細(xì)胞和經(jīng)80 μg/mL CⅡ-3 處理72 h 的細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，加入1 mL 75%乙醇吹打混勻，4 ℃固定過(guò)夜。1 000 r/min 離心后收集細(xì)胞，PBS 洗滌，加入碘化丙啶染色液，37 ℃避光溫浴30 min，流式細(xì)胞儀測(cè)定488 nm 波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度。

2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)磷酸化p53 蛋白表達(dá) 收集對(duì)照組細(xì)胞和經(jīng)80 μg/mL CⅡ-3 處理72 h 的細(xì)胞，PBS 洗滌，加入蛋白裂解液提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，取20 μg 蛋白進(jìn)行上樣。經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗磷酸化p53（1∶500 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜，TBST 緩沖液洗滌條帶3 次，加入二抗（1∶1 000 稀釋?zhuān)┓跤?.5 h，ECL 曝光液顯色后凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，測(cè)定蛋白條帶灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CⅡ-3 對(duì)K562 細(xì)胞增殖的影響CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果顯示：24、48、72 h 時(shí)，不同濃度的CⅡ-3對(duì)K562 細(xì)胞的增殖均有抑制作用，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，大多數(shù)濃度CⅡ-3 對(duì)K562 細(xì)胞增殖抑制作用增強(qiáng)，因此，選擇72 h 作為培養(yǎng)時(shí)間。在作用時(shí)間為72 h 時(shí)，CⅡ-3 濃度為80 μg/mL，細(xì)胞增殖抑制率最高，與大多數(shù)作用濃度和作用時(shí)間相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。因此，選擇80 μg/mL CⅡ-3 作用72 h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 CⅡ-3 對(duì)K562 細(xì)胞增殖的抑制率（%，，n=3）

表1 CⅡ-3 對(duì)K562 細(xì)胞增殖的抑制率（%，，n=3）

注：在作用時(shí)間相同的情況下，與80 μg/mL CⅡ-3 比較*P＜0.05；CⅡ-3 濃度為80 μg/mL 時(shí)，與作用72 h 比較△P＜0.05。

3.2 CⅡ-3 對(duì)K562 細(xì)胞集落形成能力的影響與對(duì)照組相比，80 μg/mL CⅡ-3 作用于K562 細(xì)胞72 h 后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞集落數(shù)明顯減少，細(xì)胞集落形成率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2、圖1。

圖1 CⅡ-3 對(duì)K562 細(xì)胞集落形成能力的影響（×100）

表2 CⅡ-3 對(duì)K562 細(xì)胞集落形成能力的影響（，n=3）

表2 CⅡ-3 對(duì)K562 細(xì)胞集落形成能力的影響（，n=3）

注：與對(duì)照組相比**P＜0.01。

3.3 CⅡ-3 對(duì)K562 細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，80 μg/mL CⅡ-3 作用于K562 細(xì)胞72 h 后，G0/G1 期細(xì)胞比例明顯升高，S 期細(xì)胞比例顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表3、圖2。

圖2 CⅡ-3 對(duì)K562 細(xì)胞周期的影響

表3 CⅡ-3 對(duì)K562 細(xì)胞周期的影響（%，，n=3）

表3 CⅡ-3 對(duì)K562 細(xì)胞周期的影響（%，，n=3）

注：與對(duì)照組相比**P＜0.01。

3.4 CⅡ-3 對(duì)K562 細(xì)胞磷酸化p53 蛋白表達(dá)的影響蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，80 μg/mL CⅡ-3 作用72 h 后，磷酸化p53 蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 CⅡ-3 對(duì)K562 細(xì)胞磷酸化p53 蛋白表達(dá)的影響

4 討論

CML 是一種起源于造血干細(xì)胞的骨髓增生性疾病，化療是目前臨床上主要治療方案，但化療所導(dǎo)致的副作用極大地影響患者的治療效果和生活質(zhì)量〔7〕。因此，尋找高效、低毒副作用的藥物成為治療的新目標(biāo)〔8〕。

高三尖杉酯堿是從我國(guó)特有植物粗榧中提取的一種生物堿，研究〔9〕表明其具有抗腫瘤活性，對(duì)K562 細(xì)胞有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、阻滯細(xì)胞周期等作用，在臨床治療中，廣泛用于治療急性髓系白血病、慢性粒細(xì)胞白血病和骨髓增生異常綜合征，2012 年被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療伊馬替尼耐藥的CML 患者，由此可見(jiàn)中藥在白血病治療方面有著很大的潛力。美洲大蠊，古時(shí)稱(chēng)蜚蠊，其藥用價(jià)值最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，具有活血散瘀的功效〔10〕。有研究〔11〕結(jié)果表明，美洲大蠊在抗肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等方面療效顯著，有著良好的應(yīng)用前景。

研究〔3〕表明，美洲大蠊提取物對(duì)K562 細(xì)胞、人原髓細(xì)胞白血病HL-60 細(xì)胞和小鼠淋巴樣瘤P388D1 細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用。本研究中，CCK-8法測(cè)定結(jié)果顯示，美洲大蠊提取物CⅡ-3 濃度為80 μg/mL、作用72 h 時(shí)，對(duì)K562 細(xì)胞增殖抑制率最高，為（57.8±1.0）%，故選擇此濃度及作用時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。集落形成實(shí)驗(yàn)可以直觀(guān)地反映腫瘤細(xì)胞的群體依賴(lài)性和增殖能力〔12〕，經(jīng)80 μg/mL CⅡ-3作用72 h 的K562 細(xì)胞其集落形成能力明顯下降，以上結(jié)果說(shuō)明CⅡ-3 能夠抑制K562 細(xì)胞增殖。

細(xì)胞增殖依賴(lài)于正常的細(xì)胞周期進(jìn)程，包括G0/G1 期、S 期、G2 期、M 期4 個(gè)時(shí)期，癌細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失調(diào)，細(xì)胞無(wú)限增殖分裂〔13〕，這種異常的細(xì)胞周期進(jìn)程是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的基本機(jī)制之一〔14〕。處于G0/G1 期的細(xì)胞被稱(chēng)為靜止期或非增殖狀態(tài)，將腫瘤細(xì)胞阻滯在該周期，就能達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的〔15〕。本研究中，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組阻滯在G0/G1 期的K562細(xì)胞顯著增加，S 期的細(xì)胞明顯減少，由此可知CⅡ-3通過(guò)阻滯腫瘤細(xì)胞周期，從而抑制K562 細(xì)胞增殖。

p53 蛋白可以使細(xì)胞周期阻滯在G1 期，還可以間接抑制細(xì)胞周期依賴(lài)激酶的活性，進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖〔16〕。有研究〔17〕表明，姜黃素衍生物能夠通過(guò)上調(diào)p53 蛋白表達(dá)水平導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖。p53 蛋白的磷酸化與癌癥關(guān)系密切，p53蛋白的磷酸化水平增加可以抑制腫瘤的形成〔18〕。p53 蛋白的磷酸化修飾是穩(wěn)定和增強(qiáng)p53 蛋白轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵〔19〕，因此，本研究中檢測(cè)了磷酸化p53蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組相比，CⅡ-3 誘導(dǎo)后的K562細(xì)胞磷酸化p53 蛋白表達(dá)水平升高，提示CⅡ-3 通過(guò)調(diào)控p53 蛋白抑制K562 細(xì)胞增殖。

本研究探討了美洲大蠊提取物CⅡ-3 對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，CⅡ-3 可以抑制K562細(xì)胞的增殖，降低細(xì)胞集落形成率，使阻滯在G0/G1期的細(xì)胞比例增加，S 期的細(xì)胞比例減少，并上調(diào)p53 蛋白的表達(dá)。該結(jié)果為后續(xù)進(jìn)行深入研究其具體機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為美洲大蠊提取物CⅡ-3 的臨床應(yīng)用提供新思路。