嚴子璇，艾 瑛，陳明慶，閆雪蘭，劉 嘉

（1.昆明理工大學醫(yī)學院，云南 昆明 650032；2.云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，云南 昆明 650032)

宮腔粘連也稱子宮內粘連（intrauterine adhesions，IUA），是一種主要由于宮腔內操作，如人工流產(chǎn)、診斷性刮宮術、宮腔鏡下息肉摘除及肌瘤剔除、手取胎盤等，導致子宮內膜受損后纖維化及異常修復、子宮壁粘連、宮腔容積縮小的常見婦科疾病[1，2]。該疾病以月經(jīng)量減少或閉經(jīng)、下腹痛、不孕、習慣性流產(chǎn)及早產(chǎn)、胎盤位置異常等產(chǎn)科并發(fā)癥為主要臨床表現(xiàn)[3，4]。近年來，由于人工流產(chǎn)和宮腔鏡手術等宮腔操作的增多，加重子宮內膜損傷及子宮內膜感染，使IUA 患病率逐漸提高[5]，已成為一種常見的婦科疾病。盡管我國制定了適合國情的分類體系，臨床醫(yī)生可根據(jù)評分標準及臨床經(jīng)驗采取不同的治療方法，但IUA 的治愈率仍低下，治療后復發(fā)率高，對患者的生育功能、生殖健康及生活質量產(chǎn)生了嚴重影響[6]。目前對于IUA 發(fā)病機制、病程進展及臨床防治仍然需要進一步探索。合適的動物模型能為研究IUA 發(fā)病機制及預防、治療策略提供助力。而由于IUA 的形成機制尚不明確，建模方法也尚未統(tǒng)一，造模后也沒有固定的評價標準，因此探索穩(wěn)定的IUA動物模型構建方法及合適的建模時間十分有必要。本研究旨在探索機械損傷構建大鼠宮腔粘連模型的效果與評價，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性未受孕8 周齡SD 大鼠20 只，體質量280 g 左右，購自成都達碩實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2014-028。室溫（23±2）℃，濕度45%～55%條件下飼養(yǎng)，每日光照時間12 h，自由攝水進食，適應性飼養(yǎng)1 周。該研究符合動物福利和倫理原則、符合國家關于實驗動物福利倫理相關規(guī)定。

1.2 建模方法 通過陰道涂片方法區(qū)分不同動情周期大鼠，取動情后期或間期的雌性未受孕SD 大鼠。采用異氟烷麻醉機進行麻醉，5%異氟烷誘導麻醉，2%異氟烷術中持續(xù)麻醉。手術過程嚴格無菌操作。大鼠腹部備皮，碘伏消毒，于陰道口上3～4 cm 處在皮膚正中線上作2～3 cm 的縱形切口，暴露肌肉，于肌肉腹白線作2～3 cm 的縱形切口，暴露腹腔；用纏有膠帶的鑷子將右側子宮牽拉出腹腔，于卵巢下0.5 cm 處剪口，置入微型刮宮器，刮出內膜組織后縫合宮體，卵巢端結扎（刮宮組）。左側子宮同法牽拉出腹腔后剪口暴露內膜，不做刮宮操作，卵巢端結扎，最后將雙側子宮恢復至正常位置，可吸收縫合線縫合切口，縫合處滴慶大霉素0.2 ml（2 ml∶80 萬單位）（對照組）。術后第2 天，肌肉注射10 倍稀釋后的慶大霉素0.2 ml（2 ml∶80 萬單位），連續(xù)給藥3 d。

1.3 評估標準與方法

1.3.1 機械損傷法建模效果的評估 10 只大鼠通過上述方法建模，10 只對照組大鼠僅切開暴露內膜，未進行刮宮操作，兩組通過大體標本觀察宮腔形態(tài)；常規(guī)固定后HE 染色、Masson 染色并觀察組織形態(tài)；HE 染色下于低倍鏡下（×5）測量子宮內膜厚度，每組隨機選取3 張切片，每張切片從不同角度測量5次，取平均值作為結果；低倍鏡下（×20）計數(shù)子宮內膜腺體數(shù)目，每張切片隨機選取5 個視野作為結果，取平均值作為結果；Masson 染色下與高倍鏡下（×200）計算子宮內膜纖維化面積比率（子宮內膜間質纖維化面積除以子宮內膜間質及腺體總面積），每組隨機選取3 張切片，每張切片隨機選取5 個視野，取平均值作為結果。

1.3.2 IUA 建模后不同時間宮腔粘連情況 于構建大鼠宮腔粘連模型后第3、5、7、9 天各處死2 只大鼠，觀察造模后宮腔形態(tài)，收集子宮受損端組織，提取蛋白用于Western Blot 檢測TGF-β1的表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（）表示，采用t檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 造模后標本的外觀比較 對照組大鼠宮腔表面光滑呈粉紅，刮宮組大鼠子宮直徑與對照組相比明顯增粗，宮腔表面可見環(huán)形狹窄，宮腔失去正常形態(tài)，局部或整體粘連阻塞，部分子宮遠端可見積水樣改變，子宮內膜與對照組相比蒼白，并有類似纖維化樣的改變。

2.2 造模后標本的組織學比較 正常大鼠子宮宮腔形態(tài)規(guī)則，分為內膜層、肌層、漿膜層3 層，內膜層襯于宮腔表面，由單層柱狀上皮覆蓋，間質內可見腺體排列，組織間可見血管和成纖維細胞，巨噬細胞和漿細胞散布其中。從子宮組織學差異分析，對照組肌層完整，內膜豐厚，腺體豐富；刮宮組宮腔粘連側子宮可見宮腔狹窄甚至閉塞，子宮內膜變薄甚至消失，間質內炎癥細胞浸潤，可見大量膠原纖維混亂排列，腺體減少甚至消失。若刮宮組子宮損傷過度，可見子宮失去正常結構，內膜及肌層徹底壞死。兩組子宮HE染色結果見圖1、圖2。

圖1 對照組子宮HE 染色（×10）

圖2 刮宮組子宮HE 染色（×10）

2.3 兩組子宮內膜指標比較 刮宮組子宮內膜厚度薄于對照組、子宮內膜腺體數(shù)量少于對照組、子宮內膜纖維化面積比率高于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組子宮內膜指標比較（）

表1 兩組子宮內膜指標比較（）

2.4 IUA 建模后不同時間宮腔粘連情況分析 子宮建模部位在第3 天宮腔粘連程度最高，可見組織充血，宮腔中、重度水腫粘連，第5 天宮腔輕度水腫粘連，第7、9 天宮腔粘連、水腫程度逐漸減輕，即建模后宮腔粘連在第3 天到達高峰，第5 天后開始修復。

2.5 刮宮后不同時間點受損子宮TGF-β1的表達Western Blot 檢測結果顯示，與其他時間點相比，刮宮后第3 天受損子宮TGF-β1的表達量最高，見圖3。

圖3 刮宮后不同時間點受損子宮TGF-β1 的表達

3 討論

目前研究者主要采用大鼠、小鼠、小型犬、新西蘭兔以及部分靈長類動物構建宮腔粘連模型。其中，靈長類動物（如恒河猴、狒狒等）雖然在月經(jīng)周期、生殖解剖生理及基因序列上與人類相似，但由于其成本高、操作復雜，難以廣泛使用[7]。相對而言，大鼠、小鼠以及兔、小型犬等物種遺傳背景清晰、成本低、實驗操作簡單可控，成為研究者構建宮腔粘連模型，研究子宮損傷修復的理想動物。大鼠具有實驗操作簡便、結果直觀迅速、飼養(yǎng)和實驗成本低廉等眾多優(yōu)勢，且大鼠繁殖力強、妊娠周期短，可大大縮短實驗周期，另其雙角子宮可構建自身對照，降低實驗偏倚。因此，本研究選擇以大鼠構建宮腔粘連動物模型。此外，本研究以機械損傷（刮宮法）為建模方法，構建大鼠宮腔粘連模型，因動物來源易于獲取、操作過程便于控制等優(yōu)點，且該模型的發(fā)病機制、子宮內膜形態(tài)、組織學改變均類似于人類宮腔粘連，可為研究IUA 的發(fā)病機理、預防、治療等提供基礎。

對于宮腔粘連模型的構建方法，目前主要包括物理性損傷（冷凍損傷、熱損傷、宮腔放置銅線或含成纖維細胞的聚乙烯海綿等）、化學性損傷（25%甲醛、2%福爾馬林乙醇溶液、硫酸銅無水片劑、苯酚膠漿、氟化物和乙醇等）、機械性損傷（利用手術器械，刮除子宮內膜）、雙重病理損傷模型（機械和降低雌激素聯(lián)合法、機械和感染雙重損傷法、雙重機械損傷法等）、多重損傷法等[8，9]。對于不同的建模方法，有研究認為[10]，單一處理方法損傷的子宮內膜容易恢復，無法構建長期有效的宮腔粘連模型，且與人類IUA 多因素影響的形成機制不符，故多采用雙重或多重損傷方法。但臨床多數(shù)宮腔粘連繼發(fā)于子宮創(chuàng)傷，刮宮術是常見的損傷因素，對于不完全流產(chǎn)、胎盤殘留而反復刮宮者更易發(fā)生宮腔粘連，其中25%見于產(chǎn)后1～4 周的刮宮術，且其手術次數(shù)與IUA 發(fā)生呈正比[11]。此外，刮宮術等宮腔操作后導致的子宮內膜纖維化、炎癥反應、細胞外基質過度沉積等一系列病理生理變化是人類宮腔粘連發(fā)生的主要病因，故本研究采用單一機械損傷法構建大鼠宮腔粘連模型，并探討單一機械損傷對于構建大鼠宮腔模型的效果。

目前評判是否成功建造宮腔粘連動物模型沒有統(tǒng)一的標準，認為可以通過內膜厚度、子宮內膜纖維面積比率及腺體數(shù)目的變化評價造模效果[12]。本研究結果顯示，子宮建模部位在第3 天宮腔粘連程度最高，可見組織充血，宮腔中、重度水腫粘連，第5 天宮腔輕度水腫粘連，第7、9 天宮腔粘連、水腫程度逐漸減輕，即建模后宮腔粘連在第3 天到達高峰，第5天后開始修復；刮宮組子宮內膜厚度薄于對照組、子宮內膜腺體數(shù)量少于對照組、子宮內膜纖維化面積比率高于對照組（P＜0.05），提示構建的大鼠宮腔粘連模型其子宮內膜內膜變薄、子宮內膜腺體數(shù)量減少、子宮內膜纖維化面積比率增高，驗證了造模的成功。另外，創(chuàng)傷后的子宮內膜在修復過程中可發(fā)生炎癥期、組織形成期、組織重建期3 個病理生理變化時期，由大量的細胞、細胞因子及細胞外基質共同參與。成纖維細胞被激活并大量增殖，引起細胞外基質合成降解失衡、沉積增多，從而引起纖維組織形成[13]。TGF-β 是一類多功能的細胞因子，在成纖維細胞合成細胞外基質，進而導致膠原沉積，并在纖維組織形成的過程中起促進作用，被認為是參與纖維化形成的主要細胞因子[14]。本研究通過分析宮腔鏡粘連分離術后創(chuàng)面滲出液中粘連相關細胞因子濃度，發(fā)現(xiàn)與其他時間點相比，刮宮后第3 天受損子宮TGF-β1的表達量最高，提示刮宮后第3 天大鼠子宮宮腔粘連程度最為嚴重，第5 天開始修復，若進行藥物防治宮腔粘連的研究，可在術后給藥第3 天檢測宮腔粘連恢復情況，判斷藥物療效。Guo LP 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，IUA 大鼠模型子宮內膜組織中TGF-β1的表達高于正常大鼠子宮內膜組織，認為TGF-β1高表達與IUA 的發(fā)展有關。也有研究發(fā)現(xiàn)[16]，TGF-β1表達水平與宮腔粘連程度呈正比。以上研究結果提示，在IUA 疾病進展中，TGF-β1發(fā)揮重要作用，并可反映宮腔粘連程度。

綜上所述，大鼠宮腔粘連模型可以通過機械刮宮構建，模型建立后子宮內膜變薄、子宮內膜腺體數(shù)量減少、子宮內膜纖維化面積增加，與人類宮腔粘連病理情況相似，且建模后第3 天，受損子宮TGF-β1的表達量最高，大鼠子宮宮腔粘連程度最為嚴重。