李 芳，蔣海濤，張 愷，秦 瑩，2，鄭紀(jì)偉，2

（1.徐州醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，江蘇 徐州 221000；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科，江蘇 徐州 221000）

炎癥、創(chuàng)傷、腫瘤或自身免疫性疾病常引起頜面部皮膚和口腔黏膜的缺損[1]。當(dāng)缺損直徑超過(guò)2 cm或深度大于1 cm 時(shí)[2]，因其不能自行形成上皮，若直接拉攏縫合可能導(dǎo)致廣泛的瘢痕形成和活動(dòng)受限，傳統(tǒng)方法需要自體皮膚或皮瓣移植修復(fù)缺損。為了找到替代自體皮膚和黏膜移植的方案，人們做出了巨大的努力，組織工程技術(shù)的應(yīng)用為該研究領(lǐng)域提供新的方向。隨著組織工程技術(shù)及新材料技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床上常采用脫細(xì)胞真皮基質(zhì)來(lái)修復(fù)缺損皮膚[3]。脫細(xì)胞真皮基質(zhì)[4]可恢復(fù)全層皮膚創(chuàng)面，提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量，已被證明適用于許多外科重建手術(shù)，作為成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的支架，有助于真皮的形成。本研究通過(guò)從豬的肌腱中制取的雙層型脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（商品名：皮耐克）及目前國(guó)內(nèi)常用的單層型脫細(xì)胞真皮基質(zhì)材料（商品名：海奧生物膜）用于大鼠皮膚全層缺損修復(fù)，對(duì)術(shù)后創(chuàng)面大體觀察、創(chuàng)面愈合率、HE 染色、Masson 染色等方面進(jìn)行觀察，探究該材料修復(fù)缺損的效果，比較兩種生物材料在生物相容性、炎性反應(yīng)、微血管形成速度及促進(jìn)組織愈合能力的差異，以期為臨床應(yīng)用提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 實(shí)驗(yàn)于2021 年10 月-2022 年1 月在徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。雙層型脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（皮耐克，Pelnac）來(lái)自Gunze Limited 公司，通過(guò)向豬肌腱的膠原蛋白中添加熱和化學(xué)交聯(lián)而形成，是一種雙層膜，具有淺層硅膠膜層和豬膠原海綿層，其孔隙直徑在100～160 μm，該產(chǎn)品通過(guò)冷凍和干燥制成海綿狀[5]。單層型脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（海奧生物膜）來(lái)自煙臺(tái)正海生物有限公司，由牛的皮膚組織經(jīng)脫細(xì)胞及去除自身免疫源等方法處理后制備而成，鏡下呈三維框架結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD 雌性大鼠來(lái)自南京紫源生物科技有限公司，6～7 周，體重180～220 g，許可證號(hào)：XM202109173。所有大鼠飼養(yǎng)在徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)環(huán)境，自由攝食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 全皮層切除模型的建立 選取SD 大鼠（雌鼠，6～7 周），10%的水合氯醛，3 ml/kg 進(jìn)行腹腔注射。取俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)，以8%硫化鈉涂于大鼠背部術(shù)區(qū)進(jìn)行脫毛，溫水洗表面皮膚。將動(dòng)物隨機(jī)分為空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，每組30 只。背部切除全層皮膚創(chuàng)面（10 mm×10 mm），空白組給予凡士林油紗修復(fù)，對(duì)照組給予海奧生物膜修復(fù)，實(shí)驗(yàn)組給予皮耐克修復(fù)。用3-0 絲線縫合，反包扎處理。并于術(shù)后第3、6、9 天各處死10 只大鼠，取出支架及部分周圍組織進(jìn)行組織學(xué)檢查。

1.2.2 創(chuàng)面愈合情況觀察 術(shù)后第3、6、9 天，觀察大鼠創(chuàng)面愈合有無(wú)紅腫、滲出、壞死、感染等情況，采用相同參數(shù)（相機(jī)與大鼠皮膚創(chuàng)面保持相同距離）對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行拍照。用ImagePro Plus 6.0 軟件計(jì)算大鼠創(chuàng)面面積來(lái)計(jì)算愈合率，按公式計(jì)算傷口愈合率：創(chuàng)面愈合率=（初始創(chuàng)傷面積-各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面面積）/初始創(chuàng)傷面積×100%。

1.2.3 創(chuàng)面微血管密度和炎細(xì)胞密度觀察 切除的組織在4%的甲醛溶液中固定。所有組織采用常規(guī)組織化學(xué)方法，石蠟包埋，切片厚度3 μm，HE 染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取每張切片5 個(gè)視野（400 倍），計(jì)算各組創(chuàng)面微血管和炎細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4 創(chuàng)面膠原纖維觀察 術(shù)后第3、6、9 天，將創(chuàng)面組織投入含體積分?jǐn)?shù)為4%甲醛固定液的離心管中，行Masson 染色后光鏡觀察創(chuàng)面組織膠原排列及形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組創(chuàng)面愈合情況比較 術(shù)后第3 天3 組創(chuàng)面均已結(jié)痂，無(wú)明顯紅腫反應(yīng)，移植物與創(chuàng)面緊密接觸；第9 天時(shí)，肉眼可見對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的傷口面積小于空白組（P＜0.05）；第3 天實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的愈合率高于空白組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第6天，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的愈合率高于空白組（P＜0.05），且實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組創(chuàng)面愈合率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第9 天實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合率高于空白組和對(duì)照組（P＜0.05），且對(duì)照組高于空白組（P＜0.05），見表1、圖1。

表1 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠的創(chuàng)面愈合率比較（，%）

表1 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠的創(chuàng)面愈合率比較（，%）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與對(duì)照組比較，bP＜0.05

圖1 3 組大鼠創(chuàng)面愈合的情況

2.2 3 組創(chuàng)面炎細(xì)胞密度和微血管密度比較 術(shù)后第3、6 天，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組新生毛細(xì)血管生長(zhǎng)速度快于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第9 天時(shí)3組新生毛細(xì)血管生長(zhǎng)速度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2；第3 天時(shí)空白組炎細(xì)胞浸潤(rùn)較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組多，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第6、9 天時(shí)空白組炎細(xì)胞較對(duì)照組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組炎癥細(xì)胞多于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表2 3 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)缺損部分新生毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)比較（，%）

表2 3 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)缺損部分新生毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)比較（，%）

注：與空白組比較，aP＜0.05

表3 3 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)缺損部分炎癥細(xì)胞數(shù)比較（，%）

表3 3 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)缺損部分炎癥細(xì)胞數(shù)比較（，%）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與對(duì)照組比較，bP＜0.05

圖2 大鼠創(chuàng)面組織HE 病理切片（×400）

2.3 3 組創(chuàng)面膠原纖維比較 隨著創(chuàng)面修復(fù)的進(jìn)展，鏡下觀藍(lán)色區(qū)域的面積和密度越來(lái)越大，表明創(chuàng)面處新生了大量膠原纖維。第3、6、9 天，對(duì)照組中藍(lán)色較空白組多；第9 天，實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞較對(duì)照組增多，并表現(xiàn)出有序的膠原纖維排列，見圖3。3 組大鼠術(shù)后第3、6、9 天成纖維數(shù)量均呈現(xiàn)逐漸增多趨勢(shì)，術(shù)后第9 天實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

圖3 術(shù)后第9 天各組創(chuàng)面處Masson 染色比較（×400）

表4 各組大鼠不同時(shí)間缺損部分成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)（，%）

表4 各組大鼠不同時(shí)間缺損部分成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)（，%）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與對(duì)照組比較，bP＜0.05

3 討論

在日常生活中，頜面部皮膚直接暴露在外部環(huán)境中，各種原因?qū)е碌钠つw創(chuàng)傷總是無(wú)法避免的。皮膚傷口分為急性傷口（機(jī)械傷、化學(xué)傷和手術(shù)傷口等）和慢性傷口（燒傷、感染、糖尿病等）[6]。創(chuàng)傷修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括三個(gè)重疊的階段（炎癥、組織形成和組織重塑），以實(shí)現(xiàn)組織的完整性[7]。在炎癥階段，肉芽組織主要由炎癥細(xì)胞（中性粒細(xì)胞為主）組成，它們被招募到傷口部位，并在修復(fù)過(guò)程的進(jìn)展中被移除[8]。在組織形成時(shí)，由內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞組成，這些細(xì)胞開始填充創(chuàng)面以恢復(fù)組織完整性。其中真皮結(jié)構(gòu)在皮膚重建過(guò)程中具有重要作用，能促進(jìn)表皮細(xì)胞的遷移、黏附、增殖和分化[9]。

當(dāng)前，頜面部皮膚缺損的治療方法[10]主要有傷口覆蓋物、自體皮膚移植、異體皮膚移植、應(yīng)用組織工程皮膚修復(fù)等，但傷口覆蓋物僅僅是覆蓋在創(chuàng)傷表面，無(wú)法促進(jìn)創(chuàng)面愈合；自體組織皮膚移植取材面積有限，增加供皮區(qū)，加重患者痛苦；異體皮膚移植的免疫排斥反應(yīng)大、皮膚容易壞死脫落等[11]。因此，對(duì)組織工程皮膚研究刻不容緩。雙層脫細(xì)胞真皮基質(zhì)[12]由表面的硅膠膜和下層的膠原海綿層所構(gòu)成。硅膠膜[13]具有封閉性，對(duì)水分流失和體內(nèi)平衡紊亂作出反應(yīng)，形成有利于表皮水化的環(huán)境，恢復(fù)受損表皮的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)表皮增生。同時(shí)，硅膠對(duì)氧氣有滲透性，可以調(diào)節(jié)創(chuàng)面處氧氣的平衡[14]。Tandara AA 等[15]研究表明，硅膠膜通過(guò)調(diào)節(jié)創(chuàng)面的壓力、溫度、氧張力和水化環(huán)境等可以減少瘢痕的形成。研究顯示[16-17]，膠原呈三維結(jié)構(gòu)，易于吸收組織創(chuàng)面的各種滲出液，使其達(dá)到自身重量的許多倍。當(dāng)血小板與膠原結(jié)合時(shí)，可提供形成血栓的基質(zhì)，啟動(dòng)凝血功能。膠原的pH 值低，可以降低創(chuàng)面的pH 值，這種酸性環(huán)境減少了繼發(fā)細(xì)菌的定植幾率，同時(shí)，膠原有成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)這些細(xì)胞有趨化作用，可促進(jìn)它們遷移到傷口區(qū)域[18]。此外，膠原蛋白[19]還可以加速血液循環(huán)，促進(jìn)血管形成。當(dāng)膠原孔徑在100～200 μm 時(shí)，有利于細(xì)胞遷移和毛細(xì)血管的形成，減少瘢痕組織。

本研究選用雙層脫細(xì)胞真皮基質(zhì)修復(fù)組作為實(shí)驗(yàn)組，單層脫細(xì)胞真皮基質(zhì)修復(fù)組為對(duì)照組，凡士林油紗為空白組，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比較不同型脫細(xì)胞真皮基質(zhì)對(duì)皮膚傷口愈合的影響，在大鼠背部制備全層皮膚缺損創(chuàng)面模型，比較大鼠的皮膚創(chuàng)面愈合率。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙層脫細(xì)胞真皮基質(zhì)用于治療皮膚缺損創(chuàng)面，能縮小創(chuàng)面面積，加快創(chuàng)面愈合，且愈合速率大于單層脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。經(jīng)過(guò)組織病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的毛細(xì)血管數(shù)量相比空白組有較大提升，增殖的后期炎癥細(xì)胞少于對(duì)照組。研究發(fā)現(xiàn)[20]，在創(chuàng)面的愈合過(guò)程中，炎癥反應(yīng)始終存在于整個(gè)創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程，降低組織創(chuàng)面的炎性反應(yīng)程度能促進(jìn)組織創(chuàng)面的愈合的速率，表明雙層型脫細(xì)胞真皮基質(zhì)通過(guò)加速血管新生及降低增殖后期炎癥反應(yīng)為特點(diǎn)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。成纖維細(xì)胞是真皮中最豐富的細(xì)胞，具有合成和重塑細(xì)胞外基質(zhì)的能力。有研究表明[21，22]，成纖維細(xì)胞是造成傷口收縮的主要原因，成纖維細(xì)胞的數(shù)量與傷口收縮率成正比，但無(wú)序且雜亂排列的膠原纖維常導(dǎo)致傷口瘢痕的形成。本研究中實(shí)驗(yàn)組膠原纖維的排列較對(duì)照組整齊、密度高。因此，推斷脫細(xì)胞真皮基質(zhì)通過(guò)調(diào)控細(xì)胞微環(huán)境修復(fù)缺損，且雙層脫細(xì)胞真皮基質(zhì)較單層脫細(xì)胞真皮基質(zhì)能較快促進(jìn)傷口愈合，后期瘢痕形成可能較不明顯。

綜上所述，相較于臨床中常用的單層型脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，雙層型脫細(xì)胞真皮基質(zhì)在治療創(chuàng)面缺損時(shí)有一定的優(yōu)勢(shì)，不僅能加快創(chuàng)面愈合速率，還能減輕瘢痕的形成，在頜面部皮膚缺損移植中有廣闊的應(yīng)用前景。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)還有很多不足，只對(duì)此種材料進(jìn)行了初步研究，如何抑制瘢痕形成及加速創(chuàng)面速率還有待進(jìn)一步研究。