沙見宇,裴 歡,劉 曦,閆雪秋
(北京北大維信生物科技有限公司,北京 100094)
紅曲是指以大米為原料,接種紅曲霉經(jīng)固態(tài)發(fā)酵而成的紅曲米[1]?,F(xiàn)代研究表明,紅曲發(fā)酵產(chǎn)物含有莫納克林K、紅曲色素、γ-氨基丁酸、支鏈氨基酸、麥角固醇、酶類活性物質(zhì)等多種有益成分[2-3]。莫納克林K是紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中的主要活性成分,莫納克林K以酸型(開環(huán))和內(nèi)酯型(閉環(huán))兩種形態(tài)存在,其中內(nèi)酯型莫納克林K的穩(wěn)定性較酸型莫納克林K更高。在酸性條件下,酸型莫納克林K會向內(nèi)酯型不斷轉(zhuǎn)化[3],內(nèi)酯型莫納克林K具有降血脂、降膽固醇的活性。
羥甲基戊二酰單酰輔酶A(hydroxymethylglutaryl CoA,HMG-CoA)還原酶是人體中膽固醇生物合成限速酶,而莫納克林K可以與HMG-CoA還原酶受體競爭性結(jié)合,從而抑制HMG-CoA還原酶活性,進(jìn)一步減少膽固醇的合成[4-5]。同時,莫納克林K還可以通過提升肝細(xì)胞膜上的低密度脂蛋白受體的數(shù)量、活性及其親和力,促使膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁而排出體外,從而降低血漿中的膽固醇含量[6]。
在提高紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中莫納克林K的方法中,常見的有菌種分離鑒定[7],發(fā)酵工藝優(yōu)化[8]、誘變育種[9]、基因編輯[10]等方法;還有一些新興的育種技術(shù),如常壓室溫等離子體[11]、氮離子束[12]、高能混合粒子場[13]等。紫外誘變即通過以紫外線照射微生物,促使微生物核酸上的嘌呤和嘧啶堿基生成嘧啶二聚體,從而阻礙堿基之間的正常配對,導(dǎo)致微生物發(fā)生突變甚至死亡,提高突變頻率,通過適當(dāng)?shù)姆椒êY選育種[14]。共酵培養(yǎng)則是通過將紅曲霉菌與其他菌液混合一起參與發(fā)酵,目前已報道的研究表明,紅曲霉菌與多種酵母進(jìn)行共酵均可提高發(fā)酵產(chǎn)物中莫納克林K含量[15-16]。但以往研究中大多只采用一種方法提高莫納克林K產(chǎn)量,對同時采用紫外誘變和共酵的研究報道較少。該研究選用紫外誘變篩選紅曲菌株,結(jié)合與釀酒酵母共酵培養(yǎng)的方法,以期進(jìn)一步提高紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中莫納克林K含量。
1.1.1 菌株與試劑
紫色紅曲霉(Monascus purpureus)MY-11:實(shí)驗(yàn)室保藏;釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)2.2084:中國普通微生物菌種保藏管理中心;葡萄糖、七水硫酸鎂、無水氯化鈣、磷酸二氫銨、蛋白胨(均為分析純或生化試劑)、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇(分析純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;大米粉:五常市萬福米業(yè)有限公司;土豆:市售;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基:北京陸橋技術(shù)股份有限公司;乙腈、三氟乙酸(均為色譜純):美國Fisher公司;莫納克林K標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純):中國食品藥品檢定研究院;超純水:實(shí)驗(yàn)室自制。
1.1.2 培養(yǎng)基
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基:取PDA培養(yǎng)基干粉46.0 g,加入1 000 mL 蒸餾水中,121 ℃高壓滅菌30 min,備用。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基[17]:葡萄糖80 g/L,蛋白胨10 g/L,NH4H2PO42 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,CaCl20.1 g/L,以土豆汁溶解上述藥品,121 ℃滅菌20 min。
大米培養(yǎng)基[18]:大米粉38.5%,麩皮7.5%,水50%,葡萄糖2.5%,蛋白胨1.5%,pH值為5,121 ℃滅菌20 min。
ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器:上海智誠有限公司;LRH-250-HSE恒溫恒濕培養(yǎng)箱:珠江泰宏君儀器設(shè)備有限公司;BXM-110VE立式壓力蒸汽滅菌器:上海博訊醫(yī)療生物儀器股份生物有限公司;WGL-230B電熱鼓風(fēng)干燥箱、FW80高速萬能粉碎機(jī):天津市泰斯特儀器有限公司;島津LC-20AT型高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀:日本島津公司;KQ5200DE型超聲波清洗機(jī):昆山合創(chuàng)超聲儀器有限公司;METTLER XPE205DR型電子天平:梅特勒托利多公司;超純水儀:美國PALL公司。
1.3.1 孢子菌懸液的制備
取一支斜面菌種,加入少量無菌水,用接種環(huán)刮下斜面上的孢子,裝入三角瓶中振搖15 min,使孢子充分散開,用帶有4層擦鏡紙漏斗過濾掉菌絲,定容至50 mL,制成孢子菌懸液。
1.3.2 紫外誘變方法[19]
取6份10 mL孢子菌懸液于無菌培養(yǎng)皿中,置于15 W紫外燈下30 cm處,分別照射0、10 s、20 s、30 s、40 s、60 s。取誘變后各照射時間段孢子懸液0.5 mL,稀釋至10-4。取各稀釋液0.1 mL涂布于固體培養(yǎng)基,30 ℃避光培養(yǎng)7 d,記錄平板菌落數(shù),計(jì)算誘變致死率,其計(jì)算公式如下:
1.3.3 菌株篩選
紫色紅曲霉初篩[20]:觀察平板上長出的菌落,挑取生長速度較快或形態(tài)、顏色變化的菌株轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)。
紫色紅曲霉復(fù)篩:將篩選得到的紅曲霉菌株按照5%(V/V)接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃搖床培養(yǎng)2 d。吸取液體種子于大米培養(yǎng)基中,攪拌混勻,30 ℃培養(yǎng)25 d,得到紅曲。按照1.3.6步驟進(jìn)行莫納克林K的檢測,篩選莫納克林K含量高的誘變菌株。
1.3.4 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
將篩選得到的高產(chǎn)莫納克林K的誘變菌株接種到PDA斜面培養(yǎng)基上,連續(xù)轉(zhuǎn)接5代,相同條件下發(fā)酵培養(yǎng),通過HPLC法測定每代菌株發(fā)酵液的莫納克林K含量,分析誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性。
1.3.5 共酵培養(yǎng)
將釀酒酵母于12°Bx的麥芽汁中進(jìn)行活化,28 ℃活化24 h,得到酵母菌液。將誘變菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃振蕩培養(yǎng)48 h,得到紅曲霉菌液。
將酵母菌液和紅曲霉菌液接入大米培養(yǎng)基內(nèi),20%(以大米培養(yǎng)基為基準(zhǔn))紅曲菌液體分別與0、1%、2%、3%、4%(109CFU/mL)的酵母菌液進(jìn)行共酵培養(yǎng),攪拌混勻,30 ℃培養(yǎng)25 d,得到紅曲。
1.3.6 莫納克林K的測定
取紅曲采用HPLC法進(jìn)行莫納克林K的檢測。紅曲于90 ℃干燥24 h后,用高能粉碎機(jī)粉碎成紅曲粉。檢測紅曲粉中酸型莫納克林K和內(nèi)酯型莫納克林K的含量[21]。
1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2016軟件進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)和分析。
不同紫外照射時間對致死率的影響結(jié)果見圖1。對紅曲霉菌MY-11進(jìn)行紫外誘變,采用致死率來考察紫外線對紅曲霉的損傷作用。為獲得較高的正突變率,方便誘變菌株的篩選,選取致死率在70%~80%的最佳[22]。由圖1可知,紫外誘變劑量達(dá)到20 s時,紅曲菌的致死率達(dá)到76%,所以確定紫外誘變的最佳照射時間為20 s。
圖1 紫外誘變時間對致死率的影響Fig.1 Effect of UV mutation time on lethality
以紫色紅曲霉MY-11為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變,經(jīng)菌落形態(tài)初篩,獲得紫外誘變菌株8株,編號為M1~M8,分別對其進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵并測定莫納克林K的含量,檢測其是否高于出發(fā)菌株莫納克林K的含量,測定結(jié)果見表1。由表1可知,與出發(fā)菌株相比,誘變菌株M7、M8的莫納克林K的含量均有較大提高,含量分別達(dá)到了12.42 mg/g、12.49 mg/g;相比出發(fā)菌株MY-11分別提高了26%、27%,因此選擇誘變菌株M7和M8作為共酵培養(yǎng)的菌種。
表1 紅曲霉MY-11紫外誘變菌株復(fù)篩結(jié)果Table 1 Rescreening results of UV mutagenesis strains of Monascus MY-11
單一紫外誘變初篩效果較好,但紫外誘變后的突變菌株性狀具有不穩(wěn)定性,傳代培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)性狀衰退,需要遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。對M7和M8分別連續(xù)傳代5次,進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn),并檢測其莫納克林K產(chǎn)量,結(jié)果見表2。
表2 紅曲霉誘變菌種的遺傳穩(wěn)定性Table 2 Genetic stability of mutated Monascus strain
由表2可知,誘變菌株M7、M8傳代5次后,紅曲霉M7、M8傳代培養(yǎng)發(fā)酵的莫納克林K含量均有不同程度的下降,紅曲霉M8的衰減幅度明顯高于紅曲霉M7,M7的遺傳穩(wěn)定性優(yōu)于M8,與第一代菌株相比,第五代的菌株莫納可林K產(chǎn)量分別降低了27%和39%??赡苁且?yàn)閱我坏淖贤庹T變使得菌株易產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”,引起菌種的活性代謝物質(zhì)減少[23]。
由于單一的紫外誘變方法使得紅曲霉產(chǎn)莫納克林K能力呈現(xiàn)衰退的趨勢,有研究表明,紅曲霉菌與多種酵母進(jìn)行共酵均可提高發(fā)酵產(chǎn)物中莫納克林K含量[15-16]。因此該研究采用與酵母共酵的方法繼續(xù)提高紅曲霉誘變菌株產(chǎn)莫納克林K的能力。為探究酵母共酵對莫納克林K產(chǎn)量的影響,以第5代的紫外誘變篩選菌株M7、M8為研究對象,分別與不同添加量酵母菌菌液共酵25 d,測定菌株的莫納克林K產(chǎn)量,結(jié)果見表3。
表3 紅曲霉M7、M8分別與酵母固態(tài)共酵25 d的莫納克林K含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of Monaklin K content of solid-state fermentation Monascus strains M7 and M8 with yeast for 25 d
由表3可知,酵母接種量的大小會影響紅曲霉M7發(fā)酵的莫納克林K含量。適宜的接種量有利于微生物的生長代謝和次級代謝產(chǎn)物的積累[24-25]。當(dāng)酵母接種量為3%時,紅曲霉M7發(fā)酵的莫納克林K含量最高為9.35 mg/g,相比不加酵母液,提高了2.63%。同樣,當(dāng)酵母接種量為3%時,紅曲霉M8發(fā)酵的莫納克林K含量最高為8.94 mg/g,相比不加酵母液提高16.41%。當(dāng)接種量小于3%時,莫納克林K的含量較低,推測酵母在固態(tài)發(fā)酵過程中與紅曲霉共酵,釋放出較少對莫納克林K產(chǎn)量提高有益的誘導(dǎo)因子,不足以使產(chǎn)量顯著提高。當(dāng)接種量大于3%時,可能是由于引入的水分較多,不利于菌體的生長。可能由于紅曲霉與酵母共酵生長,能夠持續(xù)釋放更多對莫納克林K有益的誘導(dǎo)因子,使得含量提高[16]。朱蕊等[16]做過類似的研究,加入酵母共酵使得洛伐他汀的含量可達(dá)12.93 mg/g。綜上,添加適量的酵母菌對固態(tài)發(fā)酵有益,對于紅曲霉M7、M8,加入3%的酵母菌液共酵均能提高莫納克林K產(chǎn)量。
為提高紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)莫納克林K能力,加快紅曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)莫納克林K工業(yè)化進(jìn)程。該研究以紅曲霉MY-11為原始菌株,經(jīng)紫外誘變篩選出M7、M8兩株誘變菌株,其莫納克林K含量分別達(dá)到了12.42 mg/g、12.49 mg/g;相比原始菌株MY-11分別提高了26%、27%。單一的紫外誘變方法使得紅曲霉產(chǎn)莫納克林K能力呈現(xiàn)衰退的趨勢,將誘變菌株M7、M8分別與釀酒酵母共酵培養(yǎng)25 d,發(fā)現(xiàn)加入3%的酵母菌液共酵均能提高莫納克林K產(chǎn)量,對比不加酵母液,分別提高了2.63%、16.41%??傮w來說,單一紫外誘變相比共酵在提高菌株產(chǎn)莫納克林K含量上具有較大的優(yōu)勢,但紫外誘變存在遺傳穩(wěn)定性不足的缺陷,紫外誘變篩選結(jié)合共酵培養(yǎng)方法會提高紅曲中莫納克林K含量。后續(xù)研究采用復(fù)合誘變、優(yōu)化誘變菌株的發(fā)酵工藝等方法解決遺傳穩(wěn)定性不足等問題。