王尹強(qiáng)，高占芳，徐 睿，蔣香菊

(新疆第二醫(yī)學(xué)院，新疆克拉瑪依 834000)

雙酚A( Bisphenol A，BPA)屬于雙酚類(lèi)化合物，是一種合成高分子材料的單體，常用于生產(chǎn)增塑劑、殺蟲(chóng)劑、油漆和其他化學(xué)產(chǎn)品。BPA 單體可從塑料容器中分解，在高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下會(huì)加速釋放過(guò)程[1]。雙酚A通過(guò)不同方式影響人類(lèi)內(nèi)分泌和代謝，導(dǎo)致代謝紊亂。研究表明，BPA可通過(guò)皮膚、呼吸道等途徑進(jìn)入人體，可對(duì)神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌等多個(gè)系統(tǒng)造成不良作用[2]。盡管BPA能以萄糖醛酸苷或硫酸鹽結(jié)合物的形式從尿液中排出體外，但由于其結(jié)合-解離時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致排泄延遲而進(jìn)入組織中。BPA暴露在日常生活中，難以檢測(cè)，具有慢性毒性作用。流行病學(xué)研究表明，超過(guò)90%的人的尿液、孕婦血清、母乳、羊水、臍血和胎盤(pán)中都可檢測(cè)到BPA[3]。雙酚A不僅對(duì)女性生殖系統(tǒng)造成不同程度的影響和損傷，還會(huì)對(duì)子代的生育能力產(chǎn)生嚴(yán)重影響。

研究表明，在用低劑量的BPA處理懷孕小鼠后，雌性后代的體重和子宮濕重均下降，表明BPA對(duì)幼年大鼠卵巢發(fā)育有一定的抑制作用[4]。在關(guān)于BPA對(duì)人工授精成功率影響的研究中發(fā)現(xiàn)，尿液中BPA濃度越高，次級(jí)卵泡、成熟卵泡的總數(shù)越少，表明BPA會(huì)損害卵細(xì)胞的形成、成熟和授精能力[5-6]。

女性的血清抗苗勒管激素(AMH)水平可能代表卵巢卵泡儲(chǔ)備，在輔助生殖技術(shù)定量和定性預(yù)測(cè)中具有重要作用。AMH的生理功能主要包括抑制原始卵泡的募集，減緩原始卵泡的早期快速消耗，降低卵泡對(duì)雌激素的敏感性，抑制卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育，阻礙優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇[7]，影響初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡對(duì)卵泡刺激素(FSH )的反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育[8]。因此，AMH的表達(dá)可能與卵泡障礙性疾病密切相關(guān)[9]。

雙酚A作為一種日常生活經(jīng)常接觸的化學(xué)物質(zhì)，具有類(lèi)似雌性激素的活性，已被證實(shí)可對(duì)女性生殖健康造成一定的危害，如引起腫瘤和不孕癥，但具體機(jī)制還不明確。而AMH可作為卵巢儲(chǔ)備和腫瘤的標(biāo)志物，但目前還不清楚BPA是否影響卵巢AMH的表達(dá)。以健康性成熟的雌性小鼠為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行不同濃度的BPA處理，檢測(cè)不同濃度處理小鼠后的卵巢重量、卵泡構(gòu)成及AMH在卵泡中的表達(dá)特征，探究BPA是否通過(guò)調(diào)控抗苗勒管激素(AMH)表達(dá)量改變而引起青春期雌性小鼠的卵巢功能和結(jié)構(gòu)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組與處理方法

取24只6周、體重30～35 g的SPF級(jí)昆明系雌性小鼠，于21℃～26℃、50%～70%的相對(duì)濕度環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，4只/籠。適應(yīng)性飼喂1周后，隨機(jī)選擇18只小鼠分為3組(BPA 染毒 B 組、C 組、D 組)，分別用10 mg/kg、50 mg/kg、250 mg/kg濃度的雙酚A灌胃，剩下6只為作為空白對(duì)照，灌胃等體積玉米油，處理后采集小鼠卵巢樣品待檢測(cè)。

1.2 樣品處理

每個(gè)處理組小鼠隨機(jī)選3只，取出卵巢用于組織觀察和免疫組化分析。在固定液固定24 h后備用。

1.3 卵巢的組織切片及觀察

分別對(duì)不同的卵巢樣品脫水、包埋、切片、脫蠟、復(fù)水，對(duì)部分不同階段和不同樣品的卵泡HE染色觀察。每種樣品選出連續(xù)的2張進(jìn)行常規(guī)HE染色照相對(duì)比分析，比對(duì)各組4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期卵泡的形態(tài)結(jié)構(gòu)差異。

1.4 免疫組化分析

選出不同樣品的卵巢2張連續(xù)切片，做AMH的免疫組織化學(xué)染色觀察。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度BPA對(duì)卵泡發(fā)育的影響

HE染色結(jié)果如圖1，可見(jiàn)卵巢組織結(jié)構(gòu)相對(duì)比較完整，原始卵泡數(shù)量較多，血管較少，可看到處于不同發(fā)育階段的卵泡。BPA 染毒 B 組、C 組、D 組卵巢組織出現(xiàn)不同程度的病理?yè)p傷，如出現(xiàn)出血性卵泡、大型竇狀卵泡、多卵母細(xì)胞卵泡和卵巢囊腫樣變化。隨著B(niǎo)PA染毒劑量的不斷增加，卵巢組織的病理變化也開(kāi)始加重，異常卵泡的比例也逐漸增多，顆粒細(xì)胞層出現(xiàn)不規(guī)則裂隙更明顯。

圖1 HE染色 BPA 染毒 B 組、C 組、D組分別是(10 mg/kg、50 mg/kg、250 mg/kg BPA濃度)Fig.1 HE staining BPA contamination B group, C group, D group (10 mg/kg, 50 mg/kg, 250 mg/kg BPA concentration)

2.2 不同濃度BPA對(duì)卵巢組織AMH表達(dá)變化

免疫組化分析AMH在卵巢組織中的表達(dá)定位見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，C組和D組小鼠卵巢組織AMH表達(dá)量明顯高于A和B組，即小鼠染毒BPA≥50 mg/kg會(huì)導(dǎo)致小鼠卵巢AMH表達(dá)量增多；而小鼠染毒 BPA在250 mg/kg 時(shí)，卵巢AMH表達(dá)量顯著升高。

圖2 BPA 染毒 E 組、F 組、G組、H組分別是(10 mg/kg、50 mg/kg、250 mg/kg BPA濃度)卵巢組織AMH表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果，顆粒細(xì)胞分化為表達(dá)AMII(黑箭頭↑ )Fig.2 BPA contamination E group, F group, G group and H group (10 mg/kg, 50 mg/kg and 250 mg/kg BPA concentration)ovarian tissue AMH expressed immunohistochemical test results, granule cells differentiating expression AMII(black arrow↑)

3 討論

雙酚A作為化工中間體，分布廣泛，對(duì)環(huán)境的污染也越來(lái)越嚴(yán)重。雙酚A是人們?nèi)粘Ｉ钪薪?jīng)常接觸的化學(xué)物質(zhì)之一，人體會(huì)通過(guò)呼吸、皮膚黏膜接觸等方式攝入雙酚A。BPA可能影響未成熟雌性小鼠的生殖發(fā)育，從而影響其成熟后的生殖功能。數(shù)據(jù)表明，血液中BPA水平與許多女性生殖健康問(wèn)題有關(guān)，包括子宮內(nèi)膜增生、流產(chǎn)、不孕和多囊卵巢綜合征(PCOS)[10]。作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族成員之一，抗苗勒管激素(AMH)能顯著誘導(dǎo)苗勒管退化，在沒(méi)有AMH的情況下，苗勒管發(fā)育成子宮、輸卵管和陰道上部[11]，AMH僅在性腺中產(chǎn)生，并參與卵泡生長(zhǎng)和發(fā)育調(diào)節(jié)。卵巢中，AMH由早期發(fā)育卵泡的顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，能夠抑制原始卵泡的生長(zhǎng)。由于AMH在整個(gè)卵泡發(fā)生過(guò)程中表達(dá)，故從初級(jí)卵泡到竇狀卵泡期，血清AMH水平可能代表卵巢卵泡儲(chǔ)備的數(shù)量和質(zhì)量。AMH不僅在哺乳類(lèi)性腺發(fā)育早期中發(fā)揮作用，在后期兩性的性腺發(fā)育也都起著調(diào)控作用。

通過(guò)在小鼠性成熟期人為灌胃BPA溶液，成功構(gòu)建了小鼠卵巢損傷模型，通過(guò)不同濃度(10 mg/kg、50 mg/kg、250 mg/kg濃度組)的探索，為后續(xù)制作相關(guān)卵巢疾病模型提供了依據(jù)。通過(guò)分析不同濃度組小鼠卵巢結(jié)構(gòu)的變化，證明了BPA會(huì)造成小鼠卵巢發(fā)育異常，且隨著濃度的增加對(duì)顆粒細(xì)胞的損傷也逐漸增加。結(jié)果表明，250 mg/kg組小鼠卵巢組織中AMH基因的表達(dá)明顯比其他兩組高，說(shuō)明雙酚A能夠顯著抑制卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育，減少卵巢中卵泡的數(shù)量。BPA組閉鎖卵泡數(shù)高于對(duì)照組，而總卵泡數(shù)、初級(jí)卵泡數(shù)和次級(jí)卵泡數(shù)低于對(duì)照組，說(shuō)明BPA對(duì)卵巢功能有較強(qiáng)的損傷作用，主要作用于卵泡的發(fā)育和成熟過(guò)程。有研究證實(shí)，長(zhǎng)期處于低劑量的BPA暴露下，次級(jí)卵泡數(shù)量會(huì)顯著下降[12]，BPA會(huì)影響腔前卵泡的發(fā)育，機(jī)制主要是通過(guò)抑制顆粒細(xì)胞中雌激素的合成和分泌來(lái)調(diào)控。生長(zhǎng)分化因子9(GDF-9)和骨形成蛋白15(BMP-15)在卵泡發(fā)育和顆粒細(xì)胞增殖中的作用已得到證實(shí)，本研究再次證實(shí)了AMH在卵泡發(fā)育中的重要作用。