唐 沖，成池芳，許引虎，段長青，燕國梁,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院葡萄與葡萄酒研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點實驗室，北京 100083；2.新疆中信國安葡萄酒業(yè)有限公司，新疆 昌吉 832200；3.湖北省酵母功能重點實驗室，安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

在葡萄酒發(fā)酵過程中，釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）負責(zé)將糖代謝成乙醇和CO2[1]，并產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，如高級醇、脂肪酸、脂肪酸酯等，實現(xiàn)快速、完全、高效的發(fā)酵[2]。實際上，在發(fā)酵過程中，還有其他多種不同酵母菌系（株）參與，包括非釀酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae）。非釀酒酵母是葡萄酒釀造中區(qū)別于釀酒酵母的一大類酵母的統(tǒng)稱，主要包括假絲酵母屬（Candida）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、畢赤酵母屬（Pichia）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）和克勒克酵母屬（Kloeckera）等[3]。過去的研究中，非釀酒酵母往往被忽略或被認為是不受歡迎的腐敗酵母菌，但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出與釀酒酵母迥異的代謝特性，例如能夠分泌相關(guān)酶類從而改變和提升品種香氣的比例和含量；高產(chǎn)脂肪酸類、高級醇、酯類和醛類物質(zhì)；低產(chǎn)乙醇，能夠改變酸的含量和比例。非釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵中的應(yīng)用潛力越來越受到重視。在國外很多傳統(tǒng)葡萄酒產(chǎn)區(qū)，釀酒師會綜合考慮氣候條件、葡萄品種、栽培條件，釀造工藝、衛(wèi)生狀況等因素，通過控制葡萄酒的發(fā)酵條件，充分利用非釀酒酵母的釀造優(yōu)點，將其與釀酒酵母有機結(jié)合起來，釀造出風(fēng)味復(fù)雜、獨具特色的葡萄酒[4]。如將戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）和釀酒酵母進行混合發(fā)酵，可以減少乙酸的產(chǎn)生，并且增加葡萄酒中的果香味[5]。星型假絲酵母（Candida stellata）與釀酒酵母混合發(fā)酵有助于減少乙酸、乙醛等不良氣味的產(chǎn)生，提高葡萄酒酯類物質(zhì)的含量[6]。東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）發(fā)酵時可以產(chǎn)生較高濃度的酯類、高級醇、琥珀酸，與釀酒酵母混合發(fā)酵后可以降低揮發(fā)酸的含量，產(chǎn)生較多具有水果香氣的酯類物質(zhì)[7]。越來越多的研究結(jié)果也表明，本土非釀酒酵母菌株能夠產(chǎn)生一些凸顯產(chǎn)地葡萄酒獨特感官特征的風(fēng)味物質(zhì)，從而賦予當(dāng)?shù)仄咸丫篇毺氐钠焚|(zhì)和風(fēng)格[8-12]。表1總結(jié)了部分常見的非釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵中的應(yīng)用特點。

表1 部分非釀酒酵母菌的應(yīng)用特點Table 1 Application characteristics of some non-Saccharomyces yeasts

在眾多非釀酒酵母中，耐熱克魯維酵母（Lachancea thermotolerans，LT）是一種具有巨大應(yīng)用潛力的酵母菌，它的主要釀造特性是能夠在乙醇發(fā)酵過程中高產(chǎn)L-乳酸[24]，從而有效增加葡萄酒的酸度，具有生物“酸化劑”之稱。高產(chǎn)乳酸的一個直接作用是能夠降低pH值（降低0.3～0.5），對葡萄酒的色澤產(chǎn)生積極影響，有效提高葡萄酒的生物穩(wěn)定性和顏色穩(wěn)定性[13]。因此，LT高產(chǎn)乳酸的特性對于解決我國西部葡萄酒產(chǎn)區(qū)“糖高酸低”的產(chǎn)業(yè)問題具有重要的現(xiàn)實意義[25]。但與其他非釀酒酵母相比，目前對LT的研究報道還比較少。為此本文對LT在葡萄酒釀造中的研究和應(yīng)用情況進行綜述，以期對LT的進一步研究提供有益的參考和借鑒，加快其工業(yè)應(yīng)用的進程。

1 耐熱克魯維酵母的基本性質(zhì)

LT以前被稱作Kluyveromyces thermotolerans，后來由Kurtzman[26]根據(jù)基因序列分析將其歸為Lachancea屬。LT基因組長度為10.6 Mb，含有8 條染色體[27]，圖1是LT在WLN培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)[28]和顯微鏡下的細胞形態(tài)[14]。

圖1 LT在WLN培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)（A）以及顯微觀察（B）[14,28]Fig.1 Colony morphology on WLN medium (A) and microscopic observation (B) of LT[14,28]

LT可以通過形成1～4 個球形子囊孢子進行有性生殖，也可以通過多端出芽方式進行無性生殖[15]。具有中等發(fā)酵活力，可耐受體積分數(shù)5%～9%的乙醇，也有研究發(fā)現(xiàn)在乙醇體積分數(shù)為9%時，LT可以存活數(shù)天[29]，表明LT對乙醇脅迫具有很強的菌株特異性。LT菌株可以耐受10～20 mg/L的游離SO2，有些菌株可以耐受100 mg/L的總SO2。研究表明，LT產(chǎn)H2S的能力為中高活性[30]。此外，LT對氧的需求要高于釀酒酵母，因此，氧氣對于LT的存活和生長極為重要[31]。表2列出了LT的一些生理生化特性。

表2 LT的部分生理生化特性Table 2 Selected physiological and biochemical characteristics of LT

LT在自然發(fā)酵的葡萄酒中可以被分離得到，其不僅存在于葡萄果實中，還能從昆蟲、植物、土壤等中分離出來[25]。LT的分離鑒定可以通過賴氨酸培養(yǎng)基以及CHROMagar?顯色培養(yǎng)基進行（25～28 ℃的溫度下培養(yǎng)），在CHROMagar?顯色培養(yǎng)基中，釀酒酵母表現(xiàn)出紫色的菌落，而LT的菌落則為紅棕色（其他非釀酒酵母多為乳白色），基于此性質(zhì)，可以方便快捷地將LT分離出來[32]。之后再通過26S rRNA的D1/D2區(qū)域測序和/或隨機擴增多態(tài)DNA指紋圖譜來完成鑒定[33-34]。需要說明的是，與其他非釀酒酵母相比，LT在葡萄酒自然發(fā)酵中分離出的幾率較低。

2 耐熱克魯維酵母對葡萄酒品質(zhì)的影響

2.1 對主代謝產(chǎn)物的影響

乙醇是葡萄酒發(fā)酵過程中的主要代謝產(chǎn)物，在初始糖度為22%～24%的典型葡萄酒發(fā)酵過程中，約95%的糖會被轉(zhuǎn)化為乙醇和CO2，1%轉(zhuǎn)化為細胞物質(zhì)，其余4%轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物，包括甘油、酸、高級醇、酯等[35]。Comitini等[36]研究發(fā)現(xiàn)，5 株不同的LT菌株發(fā)酵力（將糖發(fā)酵成乙醇的能力）從4.58%（乙醇體積分數(shù)，后同）到7.96%不等，而3 株釀酒酵母菌的發(fā)酵力范圍為10.78%～12.62%，表明LT的發(fā)酵能力要弱于釀酒酵母，因此可以將LT與發(fā)酵能力強的釀酒酵母混合使用完成乙醇發(fā)酵[37-38]。同時根據(jù)LT低發(fā)酵能力的特性也可以將其單獨接種進行低度酒的發(fā)酵，如啤酒發(fā)酵[39]和甜型酒發(fā)酵[40]，在這種情況下LT產(chǎn)生的乳酸可以與糖達到很好的平衡，增加酒體的新鮮感和平衡度。一些研究發(fā)現(xiàn)LT單獨發(fā)酵也可以產(chǎn)生體積分數(shù)大于10%的乙醇（10.35%[41]或10.46%[42]），表明LT的發(fā)酵能力范圍比較寬泛。Hranilovic等[43]比較了5 株不同的LT菌株與釀酒酵母在兩種接種方式（同時接種和釀酒酵母延遲接種）下的發(fā)酵性能，發(fā)現(xiàn)乙醇發(fā)酵水平低于或與釀酒酵母單獨發(fā)酵相當(dāng)。需要指出的是，一些LT菌株與釀酒酵母在延遲接種時（先接入LT菌，培養(yǎng)一段時間后再接入釀酒酵母）最終的殘?zhí)呛枯^高，即引起了發(fā)酵遲滯現(xiàn)象，這主要是因為在接種釀酒酵母之前LT消耗了大量營養(yǎng)物質(zhì)，使得釀酒酵母生長和發(fā)酵緩慢，因此二者的接種比例和接種時間需要重點關(guān)注。

甘油是僅次于乙醇的第二大酵母發(fā)酵產(chǎn)物，其含量是評價葡萄酒質(zhì)量的重要指標之一，能夠使酒液更黏稠，口感更甘甜[44]。Benito等[45]利用LT與釀酒酵母混合接種雷司令干白葡萄酒，發(fā)現(xiàn)甘油質(zhì)量濃度比釀酒酵母單獨發(fā)酵增加了0.29 g/L。這與Gobbi等[42]的研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵時甘油質(zhì)量濃度增加了0.69 g/L，另外，低溫發(fā)酵（20 ℃）比高溫發(fā)酵（30 ℃）可產(chǎn)生更多的甘油，并且增加幅度隨著LT接種比例的增加而上升。Shekhawat等[46]利用LT與釀酒酵母混合發(fā)酵霞多麗葡萄酒，以每天通入氧氣的次數(shù)作為不同處理條件變量，發(fā)現(xiàn)甘油質(zhì)量濃度隨著通氧次數(shù)的增加而升高，最多可比對照升高0.19 g/L。綜上，LT與釀酒酵母混合接種可以有效增加甘油含量，而溫度和氧氣是兩個重要的影響因素。

乳酸是酵母發(fā)酵的另一種重要副產(chǎn)物，其口感柔和。它是由丙酮酸在酵母L(＋)和D(－)型乳酸脫氫酶催化下還原而生成。在葡萄酒發(fā)酵條件下，釀酒酵母主要合成D(－)型乳酸脫氫酶，形成200～300 mg/L的D-乳酸和極少量的L-乳酸。而LT生成的是L-乳酸，最高產(chǎn)量可以達到9.6 g/L。Kapsopoulou等[29]報道了從希臘北部產(chǎn)區(qū)分離出的一株LT（編號TH941），該菌在單一接種發(fā)酵時可以產(chǎn)生9.6 g/L乳酸，最終可滴定酸度比釀酒酵母高9.4 g/L，使得pH值從3.15降至2.90。該作者后續(xù)又進行了延遲發(fā)酵實驗（先接種TH941，延遲3 d后接種釀酒酵母），發(fā)現(xiàn)總酸度比釀酒酵母對照組增加了5 g/L[47]，表明LT與釀酒酵母混合接種可以有效增加葡萄酒酸度。這種增酸作用對于低酸度葡萄酒的發(fā)酵非常重要，特別是溫暖產(chǎn)區(qū)[48]，例如西班牙南部產(chǎn)區(qū)以及我國西北的新疆和寧夏產(chǎn)區(qū)。有研究發(fā)現(xiàn)，在溫暖產(chǎn)區(qū)的紅葡萄酒發(fā)酵中，LT產(chǎn)乳酸的水平要高于乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）在蘋果酸-乳酸發(fā)酵中的合成水平[49]，這一現(xiàn)象在國內(nèi)還有待進一步驗證，因為葡萄品種和所接菌株對LT產(chǎn)酸率具有很大影響。需要指出的是，釀酒酵母會抑制LT的產(chǎn)酸效率[28]，因此若想達到較高的增酸效果，可以采用延遲接種釀酒酵母或適當(dāng)增加LT接種比例的方式。

揮發(fā)酸是由微生物產(chǎn)生的腐敗代謝產(chǎn)物之一，它會帶來令人不快的酸味和辛辣味，對葡萄酒風(fēng)味產(chǎn)生負面影響[37]。乙酸是葡萄酒中揮發(fā)酸的主要成分（約占揮發(fā)酸含量90%）[50]。Comitini等[36]比較了5 株LT菌株和3 株釀酒酵母菌株單獨發(fā)酵時的揮發(fā)酸含量，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母產(chǎn)生的揮發(fā)酸質(zhì)量濃度比LT高50%左右，5 株LT菌的乙酸產(chǎn)量在0.32～0.58 g/L之間。楊婕等[51]在3 株LT（編號分別為LT1、LT2、LT3）分別接種4 d后接入釀酒酵母進行混合發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)3 個實驗組所產(chǎn)生的揮發(fā)酸質(zhì)量濃度均顯著低于釀酒酵母對照組（差異為0.08～0.15 g/L），證明LT具有降低揮發(fā)酸產(chǎn)量的能力。LT低產(chǎn)乙酸的特性可能與高產(chǎn)乳酸有關(guān)，即分流部分葡萄糖至乳酸降低了乙酸的合成。Vilela等[37]發(fā)現(xiàn)LT合成乙酸的能力與氧氣濃度呈依賴性，這意味著為了降低乙酸濃度，要避免氧氣接觸或適當(dāng)降低氧氣濃度。

乙醛是酵母發(fā)酵的另一種副產(chǎn)物，少量的乙醛會給葡萄酒帶來愉悅的香氣，但當(dāng)其含量過高時就會產(chǎn)生爛蘋果等不良氣味。與釀酒酵母相比，LT單獨和混合發(fā)酵都能夠降低乙醛含量。例如，Ciani等[52]發(fā)現(xiàn)LT單獨發(fā)酵時乙醛質(zhì)量濃度與釀酒酵母對照組相比降低了81 mg/L，LT與釀酒酵母同時接種和延遲接種時乙醛質(zhì)量濃度與釀酒酵母單獨接種相比分別下降了36 mg/L和63 mg/L，表明乙醛的下降幅度與LT單獨存在的時間有關(guān)。Zenisova等[53]利用LT與釀酒酵母延遲接種白比諾葡萄酒時也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。

2.2 對葡萄酒風(fēng)味化合物的影響

高級醇和酯類化合物是葡萄酒中重要的香氣物質(zhì)[54]。與其他非釀酒酵母一樣，LT與釀酒酵母混合發(fā)酵能改善香氣輪廓與組成，但與其他非釀酒酵母相比，這種改善是有限的，例如德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）。LT與釀酒酵母混合接種主要影響高級醇和乙醇酯的含量，并且與接種方式密切相關(guān)。在Balikci等[55]的研究中，LT與釀酒酵母順序接種時2-甲基丁醇（23.94～25.47 mg/L）、3-甲基丁醇（94.22～97.37 mg/L）和異丁醇（28.43～33.04 mg/L）質(zhì)量濃度與釀酒酵母單獨發(fā)酵相比顯著降低，而同時接種與對照沒有顯著差異。楊婕等[51]利用3 株LT（編號分別為LT1、LT2、LT3）分別與釀酒酵母進行順序接種，發(fā)現(xiàn)酒樣中高級醇總質(zhì)量濃度（3 637.00～3 800.07 μg/L）與釀酒酵母對照酒樣（4 316.77 μg/L）相比下降了12%～16%，但是某些高級醇，例如正丁醇、2,3-丁二醇、1-癸醇、苯乙醇含量要高于對照酒樣。這與胡娟[56]的研究結(jié)果是一致的，其發(fā)現(xiàn)與對照相比，LT與釀酒酵母順序接種時高級醇總含量減少了約25%。而Comitini等[36]在混合接種LT與釀酒酵母發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)高級醇含量較釀酒酵母對照相比增加了約31%。

LT高產(chǎn)乳酸的性質(zhì)會促進乳酸乙酯的合成，乳酸乙酯能夠賦予葡萄酒水果香氣以及奶油香氣，對于葡萄酒香氣具有積極的貢獻[57]。不同的研究發(fā)現(xiàn)，LT與釀酒酵母混合發(fā)酵時乳酸乙酯與釀酒酵母對照組相比分別提高了3[36]、14 mg/L[48]和32 mg/L[58]。Shekhawat等[46]發(fā)現(xiàn)LT與釀酒酵母混合接種時乙酯總量相對于釀酒酵母單獨發(fā)酵增加了約30%，其中增幅較大的是乳酸乙酯（33%）、丁酸乙酯（20%）、己酸乙酯（10%）和癸酸乙酯（10%）。

Korenika等[59]將LT與商業(yè)釀酒酵母BDX以順序接種方式發(fā)酵土加克（Trnjak）、巴比奇（Babic）、布萊塔那（Blatina）、藍佛朗克（Frankovka）4 種紅葡萄酒，與BDX單獨發(fā)酵相比，乳酸乙酯、乙酸異丁酯（甜香、果香）、香葉醇（花香）的含量都顯著增加。另外，在白比諾葡萄酒發(fā)酵中，LT與釀酒酵母混合發(fā)酵增加了2-苯乙醇（花香）、琥珀酸二乙酯（果香）和乙酸苯乙酯（蜂蜜味）含量[53]。

2.3 對葡萄酒顏色的影響

顏色是評價葡萄酒質(zhì)量的重要指標之一。紅葡萄酒的主要呈色物質(zhì)是花色苷，其組成和含量是決定葡萄酒顏色和穩(wěn)定性的重要因素[60]?；ㄉ盏慕M成和含量會受到輔色效應(yīng)的影響。輔色效應(yīng)是指花色苷與其他有機物或金屬離子發(fā)生作用，形成呈色的輔色復(fù)合體，增加葡萄酒中呈色花色苷的比例可以影響葡萄酒的顏色[61]。pH值對花色苷的輔色效應(yīng)具有重要影響，當(dāng)葡萄酒的pH值在3左右時，輔色效應(yīng)最強，隨著pH值的升高，較多的花色苷會轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色的甲醇假堿，導(dǎo)致減色效應(yīng)加劇[62]。Benito等[63]發(fā)現(xiàn)，LT與釀酒酵母混合發(fā)酵后酒樣的顏色強度比釀酒酵母單獨發(fā)酵增加了10%，這主要歸結(jié)為其增酸效應(yīng)降低了pH值，導(dǎo)致呈色花色苷比例增加，這種變化對于陳釀過程中保持酒體的色澤穩(wěn)定性至關(guān)重要。Benito等[64]在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，與釀酒酵母相比，LT能夠降低對花色苷的吸附作用，大幅增加葡萄酒中花色苷含量（飛燕草素葡萄糖苷含量增加25%，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量增加50%，矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷含量增加50%）。這些結(jié)果表明LT能夠增強葡萄酒的顏色及穩(wěn)定性，這種作用與其增酸降pH值和低花色苷吸附能力有關(guān)。

2.4 多糖和胞外酶產(chǎn)生情況

多糖是構(gòu)成葡萄酒中大分子物質(zhì)的主要成分之一，可以改善葡萄酒的酒體和口感，增強蛋白質(zhì)和酒石酸的穩(wěn)定性，同時還能夠保護葡萄酒中的酚類物質(zhì)，使其免受氧化[65]。Comitini等[36]比較了5 株LT菌株與3 株釀酒酵母單獨發(fā)酵后的多糖含量，發(fā)現(xiàn)5 株LT菌株多糖質(zhì)量濃度（163～260 mg/L）均高于釀酒酵母對照組（3 株釀酒酵母多糖質(zhì)量濃度分別為132、128、152 mg/L）。Gobbi等[16]也發(fā)現(xiàn)LT無論是單獨發(fā)酵還是混合發(fā)酵多糖質(zhì)量濃度均高于釀酒酵母（增加30%～60%不等）。上述結(jié)果表明LT具有高產(chǎn)多糖的能力，會對葡萄酒的品質(zhì)將產(chǎn)生積極貢獻。

酵母菌除了合成不同的代謝產(chǎn)物外，還能夠通過分泌各種酶來影響葡萄酒的感官和香氣品質(zhì)，胞外酶主要包括蛋白酶、果膠酶和糖苷酶[66]。Porter等[66]對111 株LT的產(chǎn)酶情況進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所研究的LT菌株中98%都不具有蛋白酶活性，只有12%的LT菌株具有β-糖苷酶活性。目前對于LT產(chǎn)果膠酶情況還鮮有報道。LT產(chǎn)糖苷酶和果膠酶能力可以作為篩選優(yōu)良菌株的一個條件。

2.5 對蘋果酸-乳酸發(fā)酵的影響

在乙醇發(fā)酵過程中使用LT會產(chǎn)生大量的乳酸（大于4 g/L），這對于后續(xù)的LAB啟動蘋果酸-乳酸發(fā)酵具有一定的抑制作用。但這種作用對于需要抑制蘋果酸-乳酸發(fā)酵的情形是有利的，例如溫暖產(chǎn)區(qū)的葡萄酒，可以避免大幅降酸以保持葡萄酒較高的酸度和生物穩(wěn)定性，提升其感官品質(zhì)，特別是新鮮型葡萄酒。而對于需要進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵的葡萄酒，可以利用將LT與LAB同時接種再延遲接種釀酒酵母的方式，在這種接種方式下，增酸作用來自于LT和LAB將一部分糖轉(zhuǎn)化為乳酸。該混菌發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)用于1 t葡萄汁的發(fā)酵生產(chǎn)，最終產(chǎn)品pH值為3.3，而釀酒酵母對照產(chǎn)品的pH值為4[15]。需要注意的是這種接種方式要避免揮發(fā)酸含量的增加。粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）可以用于降解蘋果酸，以取代LAB的蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程，但是粟酒裂殖酵母代謝蘋果酸的終產(chǎn)物是乙醇，而蘋果酸的大量降解會造成酸度過低的現(xiàn)象[20]。LT與粟酒裂殖酵母混合接種可以在一定程度上彌補該缺陷。

2.6 生物防治作用

赭曲霉毒素A（ochratoxins，OTA）是2A類致癌物，在葡萄酒中的含量有嚴格的規(guī)定[67]。Ponsone等[68]的研究表明，將LT菌株作為抗真菌劑噴施在葡萄上能夠降低赭曲霉的生長，抑制OTA的積累，具體的抑制效果與OTA種類、LT菌株以及底物的水分活度和溫度有關(guān)。Zeidan等[69]發(fā)現(xiàn)存活和滅活狀態(tài)下的LT細胞對緩沖溶液中OTA的去除率高達71%和82%，這主要是因為LT菌株對OTA具有很強的吸附能力。因此，LT具有應(yīng)用于果蔬產(chǎn)品OTA生物防控的潛能。

3 耐熱克魯維酵母高產(chǎn)乳酸的分子機制

乳酸的合成與乙醇、乙酸和乙醛合成密切相關(guān)，對LT高產(chǎn)乳酸的分子機制進行研究有助于有效、合理地調(diào)控其產(chǎn)酸能力，但目前相關(guān)研究還非常少[70]。Souciet等[71]首次對LT進行了全基因測序。在此基礎(chǔ)上，Talla等[72]認為LT在糖代謝中是通過乳酸脫氫酶（LDH1、LDH2、LDH3）將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，而通過乙醇脫氫酶（ADH1、ADH2）將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醇（圖2）。比較具有乳酸與乙醇合成差異的不同LT菌株的基因型可以揭示乳酸合成的分子機制[73]。Sgouros等[74]比較了3 株高產(chǎn)乳酸LT菌株（P-HO1、P-PT4和P-PHO8，乳酸產(chǎn)量分別為15.6、14.8 g/L和10.7 g/L）和兩株低產(chǎn)乳酸的LT菌株（A1L7和P-PT5，乳酸產(chǎn)量分別為0.6 g/L和1.4 g/L）的基因型差異：在單獨發(fā)酵條件下測定了3 種乳酸脫氫酶基因（LDH1、LDH2、LDH3）和2 種乙醇脫氫酶基因（ADH1、ADH2）的相對表達量，發(fā)現(xiàn)ADH1、ADH2、LDH1和LDH3在所有菌株中的表達量都沒有明顯的差異，只有LDH2基因在高產(chǎn)LAB株中高水平表達，而在低產(chǎn)乳酸的菌株中表達水平低，表明LDH2是調(diào)控LT菌株高產(chǎn)乳酸的關(guān)鍵基因。據(jù)此結(jié)果，有可能通過測定LDH2的表達水平來篩選高產(chǎn)乳酸的LT菌株。

圖2 LT的發(fā)酵糖代謝簡圖[72]Fig.2 Simplified schematic representation of fermentative sugar metabolism in LT[72]

4 耐熱克魯維酵母與其他非釀酒酵母混合發(fā)酵對葡萄酒品質(zhì)的影響

除了與釀酒酵母進行混合接種，LT還可以與其他非釀酒酵母進行混合接種（為了完成乙醇發(fā)酵，最終也接入釀酒酵母）改善或提升葡萄酒的相關(guān)品質(zhì)，目前研究最多的是粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomces pombe）。粟酒裂殖酵母能夠?qū)⑻O果酸轉(zhuǎn)化成乙醇[75]，已經(jīng)被成功地應(yīng)用于棕櫚酒和朗姆酒的生產(chǎn)[76]。利用該特性可以降解葡萄酒中的蘋果酸，以取代蘋果酸-乳酸發(fā)酵（雖然會引起乙醇含量的升高）[77]。利用粟酒裂殖酵母降解蘋果酸，可以避免LAB蘋果酸-乳酸發(fā)酵產(chǎn)生的生物胺、氨甲酸乙酯和乙酸含量升高的問題，同時大幅縮短葡萄酒發(fā)酵時間[75,78]。但是會導(dǎo)致酸度大幅降低，通過混合接種LT與粟酒裂殖酵母可以在一定程度上彌補酸度的降低，解決該問題[63]。Benito等[48]發(fā)現(xiàn)與釀酒酵母單獨發(fā)酵相比，LT與粟酒裂殖酵母混合發(fā)酵時葡萄酒中組胺濃度降低至原來的1/5，同時酸度和果香味增加。國內(nèi)也有學(xué)者進行了相關(guān)研究，例如王玉華等[78]以甘肅武威產(chǎn)區(qū)美樂葡萄為原料，先接入3 株不同的LT菌（編號LTA、LTB、LTC），延遲4 d后接入粟酒裂殖酵母菌株。結(jié)果表明，與釀酒酵母單獨發(fā)酵相比，混合發(fā)酵的揮發(fā)酸質(zhì)量濃度降低0.11～0.16 g/L，總酸質(zhì)量濃度增加0.96～1.97 g/L，某些香氣物質(zhì)（苯乙醇、萜烯類和大馬酮）含量也得到提升，另外酒體顏色也發(fā)生了改變（色度增加、色調(diào)降低）。需要指出的是，以上研究結(jié)果都是基于巴氏殺菌的實驗室規(guī)模實驗，目前鮮見工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的數(shù)據(jù)。但可以肯定的是LT與粟酒裂殖酵母混合接種是一種很有潛力的接種工藝，可以滿足消費者對葡萄酒多樣化的需求以及降低生產(chǎn)成本。

除了粟酒裂殖酵母，Cristian等[79]嘗試將LT分別與有孢漢遜酵母（Hanseniaspora vineae，HV）、德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii，TD）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima，MP）3 種非釀酒酵母進行混合接種，在發(fā)酵8 d后接入釀酒酵母（SC）進行三菌混合發(fā)酵。結(jié)果顯示，在發(fā)酵前8 d，實驗組的乙醇產(chǎn)量均遠低于釀酒酵母對照組，總酸含量也較高；在接入釀酒酵母后，最終實驗組的乙醇含量均低于對照組，增酸效果顯著，但揮發(fā)酸含量低于對照組。其中LT和MP與釀酒酵母的組合效果最為顯著，獲得最低的乙醇含量（10.97%）和最高的總酸含量（4.73 g/L）。本課題組在前期研究中將LT9分別與德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）TD12和葡萄園有孢漢遜酵母（Hanseniaspora vineae）HV6進行混合接種發(fā)酵，4 d后再接入釀酒酵母D254，結(jié)果表明，LT9參與的發(fā)酵乳酸含量都得到了提升，LT9與TD12混合接種乙酸含量最低，在香氣方面，TD12＋LT9＋D254三菌混合發(fā)酵進一步提高了乙醇酯濃度，尤其是辛酸乙酯和癸酸乙酯，與D254對照組和TD12＋D254雙菌發(fā)酵相比，其濃度分別提高了90.9%/31.9%和66.1%/29.9%[80]。HV6＋LT9＋D254三菌混合發(fā)酵實驗組進一步提高了異丁醇和苯乙醇的含量，分別是D254對照組的1.46 倍和1.96 倍。以上結(jié)果表明，將LT與其他的非釀酒酵母菌株混合接種發(fā)酵可以彌補單一非釀酒酵母菌株的某些缺陷，產(chǎn)生增酸（總酸）、降醇、降低揮發(fā)酸和增香的效果，是一種提升葡萄酒品質(zhì)和風(fēng)味多樣性的釀造方法。

5 耐熱克魯維酵母與釀酒酵母互作機制的研究

混合發(fā)酵過程中存在著不同屬種、菌株之間的相互作用，這種相互作用顯著影響著各個菌株的生長和代謝，改變了相關(guān)代謝產(chǎn)物的合成。研究發(fā)現(xiàn)，LT與釀酒酵母混合發(fā)酵過程中，高濃度的釀酒酵母會導(dǎo)致LT死亡[81]。有研究者認為這是由于釀酒酵母與LT接觸后會分泌某些抗菌肽[82]，但是缺乏相關(guān)的實驗數(shù)據(jù)支撐。Shekhawat等[83]利用RNA高通量測序技術(shù)對釀酒酵母與LT混合發(fā)酵時各自的基因表達進行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，結(jié)果表明：與單獨發(fā)酵相比，混合發(fā)酵時兩種酵母菌在轉(zhuǎn)錄水平上都發(fā)生了顯著的變化。在釀酒酵母中主要有兩類基因表達上調(diào)：與某些微量元素（如銅和鐵）代謝有關(guān)的基因（FRE1、ENB1、FIT2、CTR3等）以及與細胞壁結(jié)構(gòu)和完整性相關(guān)的基因（PAU5、PAU12、PAU17、PAU24等）。而在LT中，與細胞聚集、死亡以及應(yīng)答滲透脅迫的基因（MIG2、OPY2、ERG3、ERG11、PHO11等）都顯著上調(diào)。表明混菌發(fā)酵時釀酒酵母與LT做出的應(yīng)答響應(yīng)是不同的。釀酒酵母對LT造成環(huán)境脅迫，釀酒酵母為了更好地適應(yīng)環(huán)境需要大量攝取甾醇、銅、鐵等微量元素，并通過吸收更多的甘露糖蛋白來調(diào)節(jié)細胞壁組成，保持細胞壁和膜結(jié)構(gòu)的完整性；而LT對環(huán)境的適應(yīng)能力要弱于釀酒酵母，面對高乙醇、缺氧等環(huán)境脅迫會通過上調(diào)細胞聚集、消亡等相關(guān)基因來應(yīng)答，表明混菌發(fā)酵中LT處于弱勢地位。目前對于LT與釀酒酵母混合發(fā)酵中與葡萄酒品質(zhì)直接相關(guān)的分子機制，如產(chǎn)香的分子機制還鮮見報道，這將是今后的研究重點。

6 耐熱克魯維酵母的商業(yè)發(fā)酵劑的開發(fā)與應(yīng)用現(xiàn)狀

在LT商業(yè)發(fā)酵菌劑的開發(fā)中，Concerto?是一個受到廣泛關(guān)注的產(chǎn)品，它是由丹麥科漢森（Christian Hansen）公司開發(fā)和生產(chǎn)。根據(jù)該公司的產(chǎn)品宣傳，Concerto?不僅可以增加酸度，還能夠高產(chǎn)具有新鮮草莓香氣的異丁酸乙酯，增加葡萄酒的果香，適用于溫暖的葡萄酒產(chǎn)區(qū)[84]。同時該公司還推出了三元混合的商業(yè)發(fā)酵劑MelodyTM，包含釀酒酵母、德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii，TD）和LT，3 種酵母的比例分別為60%、20%和20%[85]。其目的是通過兩種非釀酒酵母同時增加酸度和花果類香氣，而通過釀酒酵母保證發(fā)酵順利完成。

本課題組從遼寧冰酒產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵葡萄醪中篩選到一株LT（專利號ZL201910237439.9），該菌株具有很好的生理耐受性（包括耐受高糖、低溫和乙醇脅迫），產(chǎn)乳酸能力強，而揮發(fā)酸產(chǎn)量低、絮凝性強、起酵能力突出，與釀酒酵母混合接種可以實現(xiàn)有效增酸，同時產(chǎn)生典型的葡萄柚、菠蘿、芒果等水果類香氣，目前該菌株已開發(fā)為商業(yè)發(fā)酵菌劑CVE-7，應(yīng)用于新疆、甘肅、寧夏等葡萄酒企業(yè)，替代了傳統(tǒng)的物理增酸工藝。該菌株的廣泛使用有助于解決我國西部干熱葡萄酒產(chǎn)區(qū)“糖高酸低”的產(chǎn)業(yè)問題。

7 結(jié)語

全球氣候變暖使得世界各地所產(chǎn)葡萄“糖高酸低”的現(xiàn)象愈來愈普遍。LT高產(chǎn)乳酸的特性能夠增加葡萄酒的酸度，提升葡萄酒的生物和顏色穩(wěn)定性，這有助于新疆、寧夏等西部產(chǎn)區(qū)以及國外溫暖種植區(qū)葡萄酒的生產(chǎn)加工。除了增酸，LT與不同酵母混合接種還可以改善和提高葡萄酒其他感官和風(fēng)味特征，例如降低乙醇濃度、增加甘油和某些香氣產(chǎn)物含量，具有非常好的應(yīng)用前景。但是在應(yīng)用時需要注意以下幾點：1）釀造特性的菌株特異性：不同LT菌株的釀造和產(chǎn)香特性具有差異性，特別是產(chǎn)乳酸能力，因此，要根據(jù)生產(chǎn)目的進行預(yù)實驗，對所選菌株的發(fā)酵和釀造性能進行評價；2）與其他菌株的適配性：特定LT菌株與不同酵母菌株（包括釀酒酵母與非釀酒酵母）混合接種時，其產(chǎn)酸和產(chǎn)香能力會受到其他菌株的影響，如果LT生長和對環(huán)境的耐受能力強，這種影響就小。接種方式（包括接種比例和接種順序）也是影響混合發(fā)酵產(chǎn)酸和產(chǎn)香效果的重要因素，一般情況下，延遲接種方式的效果最好，因為可以在沒有（接種）釀酒酵母“存在”下獲得更高的LT濃度和更長時間的代謝活動，最大限度地“塑造”葡萄酒品質(zhì)。但此時要避免出現(xiàn)增酸過度的現(xiàn)象；3）需要進一步增強LT的產(chǎn)香性能：LT在增酸（乳酸）方面的能力是毋庸置疑的，但是與其他非釀酒酵母相比，其總體產(chǎn)香能力不是十分突出，除了進一步篩選優(yōu)良菌株外，優(yōu)化多菌發(fā)酵工藝是一種有效的改進方式，特別是采用三菌接種工藝，即再引入一種產(chǎn)香能力突出的非釀酒酵母。除此之外，還需要在分子水平上對LT的產(chǎn)酸、產(chǎn)香機制以及在混合發(fā)酵中的釀造表型進行更加系統(tǒng)和深入的研究，闡明LT單菌和多菌發(fā)酵時的代謝特征，從而更好地控制和發(fā)揮LT的釀造優(yōu)勢，以適應(yīng)不同區(qū)域、不同品種、不同風(fēng)格和不同消費需求的葡萄酒生產(chǎn)。