鄭耀林，林秋鳳，楊 樂，周瑞錚，沈昌瑩，易華娟，吳佳鋒

（1.東莞市食品藥品檢驗所，廣東 東莞 523808；2.華南理工大學化學與化工學院，廣東 廣州 510640）

食品安全事關民生福祉，應切實加強食品安全監(jiān)管，用“四個最嚴”筑牢舌尖安全的每一道防線。隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，人民生活水平不斷提高，對動物源性產(chǎn)品的需求量不斷增加，獸藥殘留問題也越來越受重視[1-2]。獸藥的合理使用可預防動物疾病，促進動物生長，提高動物源性食品產(chǎn)量和質(zhì)量，滿足人民群眾對肉類蛋白的攝取需求。然而，部分不法商販盲目追求經(jīng)濟效益，違背動物生長規(guī)律，濫用獸藥，導致動物源性食品中獸藥殘留超標問題時有發(fā)生，不僅危害人體健康，而且污染環(huán)境，給養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展帶來極大挑戰(zhàn)[3-4]。

耐藥性反應是最為常見的獸藥殘留危害，養(yǎng)殖過程中的不合理用藥或者未嚴格執(zhí)行休藥期規(guī)定均會導致獸藥在動物源性食品中嚴重蓄積[5-6]。殘留藥物通過食物鏈富集作用在人體內(nèi)蓄積，產(chǎn)生耐藥反應，嚴重威脅人們的身體健康和藥物治療效果[7-8]。因此，必須對動物源性食品安全監(jiān)管提出更高要求，為獸藥殘留檢測技術的發(fā)展注入更強動力。

目前，獸藥殘留的檢測技術主要依賴液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜[9-11]，因其出色的定性、定量能力和高靈敏響應特點，被廣泛用于獸藥殘留檢測工作。但是，獸藥種類繁多，檢驗標準多樣，給獸藥殘留的監(jiān)管和檢驗工作帶來極大挑戰(zhàn)[12]。一方面，現(xiàn)有的檢驗方法多為對已知獸藥的定量分析，對動物源性食品中未知獸藥的殘留風險卻難以評估[13-14]；另一方面，檢驗標準多樣，對檢驗人員能力和設備性能提出了更高要求，雖然能夠相對準確獲得檢驗結(jié)果，但檢驗效率卻大打折扣，檢驗成本高昂，已無法滿足人民群眾日益增長的食品安全需求。

高分辨質(zhì)譜是近年來發(fā)展較快的檢測技術，能夠在單次分析中鑒別、定量和確認復雜混合物中更多痕量級的化合物組成[15-16]，在不影響質(zhì)譜靈敏度、質(zhì)量分辨率或定量重現(xiàn)性的情況下，獲得極其可靠的分析結(jié)果，是食品安全[17-20]、代謝組學[21-23]、法醫(yī)毒理[24-25]、結(jié)構(gòu)解析[26-27]以及成分分析[28-29]等應用領域的研究熱點。本文對2018—2021年液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術在獸藥殘留檢測分析中的應用情況進行綜述，以期為動物源性食品中獸藥殘留的快速篩查及風險監(jiān)測提供技術參考和依據(jù)。

1 高分辨質(zhì)譜的種類及特點

高分辨質(zhì)譜是一種分辨率≥104半峰寬、質(zhì)量準確度＜5×10－6的精確質(zhì)量分析器?；衔锼槠x子進入質(zhì)量分析器，在外加電磁場的作用下做特征運動，依靠各自強大的信號采集系統(tǒng)和數(shù)據(jù)分析軟件，獲得高質(zhì)量分辨率和高精度的全掃描數(shù)據(jù)，具備非靶向高通量篩查和定量分析未知化合物的能力[30-31]。高分辨質(zhì)譜按照質(zhì)量分析器種類可分為：磁質(zhì)譜（magnetic mass spectrometry，Magnetic MS）、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry，F(xiàn)TICR MS）、飛行時間質(zhì)譜（time-of-flight mass spectrometry，TOF MS）以及靜電場軌道阱質(zhì)譜（orbitrap mass spectrometry，Orbitrap MS）。4 種質(zhì)量分析器的技術特點及其應用如表1所示。Magnetic MS技術經(jīng)典、成熟、定量能力卓越，但成本高昂、操作復雜等劣勢限制了其廣泛應用。未發(fā)現(xiàn)文獻報道將其用于獸藥殘留的檢測，常與氣相色譜串聯(lián)使用，多見于二噁英、多氯聯(lián)苯等多鹵取代的平面芳烴類化合物的檢測[32-33]。FTICR MS是分辨率更高、定性能力更好的軌道離子阱質(zhì)量分析器，但龐大的體積和高昂的維護成本限制其進一步推廣使用，一般不用于獸藥殘留的檢測，常見于石油化工[34-35]、蛋白質(zhì)組學[36-37]、代謝組學[38-39]及中藥成分分析[40-41]等領域。TOF MS和Orbitrap MS是目前商品化普及率更高的質(zhì)量分析器，已被廣泛應用于獸藥殘留檢測領域。

表1 高分辨質(zhì)量分析器的技術特點及其應用Table 1 Technical features and application of HRMS

2 液相色譜-高分辨質(zhì)譜在獸藥殘留中的應用

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術將液相色譜的高效分離特點與質(zhì)譜強大的定性能力完美結(jié)合，是評價動物源性食品中獸藥殘留的常規(guī)技術手段[46-47]。高分辨質(zhì)譜技術的快速發(fā)展彌補了三重四極桿質(zhì)譜在未知化合物檢索方面的不足，其強大的定性篩查能力為獸藥殘留的監(jiān)督檢測和風險監(jiān)控提供新的技術手段，是獸藥殘留風險監(jiān)測和科學研究的熱點[48-49]。

2.1 液相色譜-飛行時間質(zhì)譜

液相色譜-飛行時間質(zhì)譜具有掃描速度快、靈敏度高、質(zhì)量范圍廣等特點，被廣泛應用于獸藥殘留檢測領域[50]。如表2所示，王聰?shù)萚51]根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號和GB 31650—2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定的禁限用獸藥化合物，建立了包含117 種禁限用獸藥的標準篩查譜庫。該方法使用超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜對豬肉中多種類獸藥進行篩查和確證，完成了實體標準品向電子標準品的轉(zhuǎn)化，通過標準譜庫比對，實現(xiàn)了在無標準品條件下對豬肉中獸藥殘留進行高通量篩查。該方法簡單、靈敏，對目標化合物選擇性好，已成功應用于實際樣品的檢測。田懷香等[52]等采用高效液相色譜-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜檢測技術，開發(fā)了一種生鮮乳中高通量的獸藥殘留篩查方法。該方法前處理摒棄傳統(tǒng)的固相萃取除雜方式，采用冷凍凈化除脂技術，不僅縮短了前處理時間，而且增強了目標化合物的篩查效果。樣液經(jīng)液相色譜分離，可在18 min內(nèi)完成174 種獸藥化合物的快速檢測，大大提高了獸藥的篩查效率。Li Xiaowen等[31]基于高分辨飛行時間質(zhì)譜建立了141 種禁限用藥物篩查譜庫，并將其成功應用到豬肉中獸藥殘留的高通量篩查確證。該方法探究了不同乙腈-水體積分數(shù)對目標化合物提取效果的影響，利用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）競爭性絡合基質(zhì)中的金屬離子，有效提高四環(huán)素類藥物的回收率，為獸藥殘留的快速篩查和定量檢測提供有益參考。Magalh?es等[53]建立豬肝中45 種抗生素的快速篩查方法，所有化合物在歐盟規(guī)定的最大殘留限量水平做加標回收實驗，準確度、精密度、回收率等方法學驗證結(jié)果均符合歐盟2002/657/EC準則要求。液相色譜-飛行時間質(zhì)譜在獸藥殘留檢測中的具體應用見表2。

表2 液相色譜-飛行時間質(zhì)譜在獸藥殘留檢測中的應用Table 2 Application of liquid chromatography-time of flight mass spectrometry in the detection of veterinary drug residues

2.2 液相色譜-靜電場軌道阱質(zhì)譜

Orbitrap MS是靜電場離子阱和傅里葉變換技術的結(jié)合，通過提供高質(zhì)量分辨率和高精度全掃描譜圖實現(xiàn)對未知化合物的篩查和確證，已成為動物源性食品中獸藥殘留檢測的研究熱點[4]。于慧娟等[12]采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法，建立了魚蝦樣品中18 類共計200 種藥物殘留的快速篩查方法。該方法利用標準溶液收集了200 種藥物的保留時間、母離子質(zhì)荷比及子離子質(zhì)荷比等特征信息，并將其整合成藥物篩查數(shù)據(jù)庫。魚蝦樣品經(jīng)乙腈和乙酸乙酯超聲提取，固相萃取柱凈化，樣液經(jīng)液相色譜分離后進入Orbitrap進行全掃描，當響應超過閾值離子時自動觸發(fā)二級子離子掃描以獲取詳細碎片離子信息。通過標準譜圖檢索比對進行定性確證，實現(xiàn)了在無標準品情況下對200 種藥物殘留進行同時檢測，單針分析時間僅需22 min。趙善貞等[60]利用同位素稀釋和液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術開發(fā)了水產(chǎn)品中100 種獸藥同時定性、定量分析方法。該方法前處理結(jié)合基質(zhì)分散固相萃取和同位素稀釋技術，有效消除定量過程中基質(zhì)效應的影響。與外標法相比，同位素內(nèi)標法在基質(zhì)效應的控制和定性定量信息準確性方面存在明顯優(yōu)勢。李云飛等[61]基于靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術建立了動物源性食品中33 種獸藥殘留的檢測方法，并建立33 種獸藥化合物高分辨質(zhì)譜標準庫，實現(xiàn)非靶向定性篩查。該方法標準庫定性確證匹配度高，僅在低含量時（10 μg/kg），響應較低的硝基咪唑類化合物二級碎片豐度比存在較大偏差。Zhao Wentao等[62]建立了一種快速的獸藥殘留檢測方法，并將其應用于動物源性食品中155 種藥物的高通量篩查和定量測定。該方法定性準確、靈敏度高，定量限低于常規(guī)的檢驗標準，為獸藥殘留的監(jiān)督檢驗和風險監(jiān)測提供新思路。液相色譜-靜電場軌道阱質(zhì)譜在獸藥殘留檢測中的具體應用見表3。

表3 液相色譜-靜電場軌道阱質(zhì)譜在獸藥殘留檢測中的應用Table 3 Application of liquid chromatography-electrostatic field orbitrap mass spectrometry in the detection of veterinary drug residues

乙腈具有良好的蛋白沉淀能力，是動物源性食品（主要成分為蛋白質(zhì)）中獸藥提取的首選溶劑[13]。乙腈中酸的濃度對獸藥化合物的提取效率產(chǎn)生顯著影響，是優(yōu)化前處理方法的主要研究方向。此外，EDTA可與基質(zhì)中的金屬離子發(fā)生絡合反應，提高大環(huán)內(nèi)脂類[74]、四環(huán)素類[31]藥物的回收率。固相萃取作為經(jīng)典的除雜技術，仍是動物源性食品在獸藥殘留檢測的常用凈化手段。QuEChERS法是近年發(fā)展較快的前處理方法，該方法通用、快速、高效的特點使其在獸藥殘留檢測中展現(xiàn)出極大的應用前景。研究者可根據(jù)不同的基質(zhì)和目標化合物個性化定制需要的溶劑、鹽包和吸附劑等材料，方法應用廣泛、可塑性強，更好地迎合了前處理向自動化發(fā)展的趨勢。此外，功能化的石墨烯、碳納米管等新型納米材料也被作為吸附劑成功地應用于獸藥的富集和凈化過程[50,66,71]，其超高比表面積和豐富的π-π吸附位點為獸藥化合物的高效富集提供更多可能，是前處理技術發(fā)展的重要方向。

色譜柱填料技術的快速發(fā)展提高了單位時間色譜峰容量，優(yōu)異的分離效果和狹窄的峰寬減少了化合物共流出的發(fā)生，為高分辨質(zhì)譜的檢測提供有利基礎。反相C18柱是獸藥殘留檢測最為常用的色譜柱，可實現(xiàn)絕大多數(shù)非極性獸藥的有效分離。而對于少部分極性獸藥，親水相互作用柱可能是更好的選擇。

高分辨質(zhì)譜能夠提供高質(zhì)量精度的全掃描數(shù)據(jù)，展現(xiàn)出卓越的定性分析能力。飛行時間質(zhì)譜掃描速度快，能夠提供高質(zhì)量的二級質(zhì)譜圖用于質(zhì)譜結(jié)構(gòu)鑒定。靜電場軌道阱質(zhì)譜質(zhì)量分辨率高，能夠獲得高精確度的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，適用于復雜基質(zhì)樣品的檢測。從文獻報道的檢出限、回收率、精密度等方法學驗證結(jié)果可以看出，高分辨質(zhì)譜技術在動物源性食品中獸藥殘留的高通量非靶向篩查檢測方面表現(xiàn)卓越，應用前景廣闊。

3 結(jié)語

獸藥種類繁多，目前的監(jiān)督檢測手段受檢驗標準方法制約，難以實現(xiàn)多種類高通量的獸藥篩查和定量分析，給動物源性食品安全的監(jiān)管工作帶來不便和風險隱患。高分辨質(zhì)譜技術的飛速發(fā)展給動物源性食品中獸藥殘留的風險篩查和定量檢測提供了新的思路，超高分辨率和質(zhì)量精度的質(zhì)量分析器使其在定性篩查方面表現(xiàn)卓越，能夠很好地彌補三重四極桿質(zhì)譜依賴標準品、寬泛性不足的弱點。然而，昂貴的設備價格和維護成本在一定程度上限制了液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術的普及推廣；此外，液相色譜-高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫仍處于高速發(fā)展階段，尚未形成國際認可、通用統(tǒng)一、類似NIST的標準質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。截止目前，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第197號-9-2019《畜禽血液和尿液中150 種獸藥及其他化合物鑒別和確認液相色譜-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜法》是唯一一個將高分辨質(zhì)譜技術應用到獸藥殘留檢驗領域的國家標準。隨著高分辨質(zhì)譜的普及應用，高分辨質(zhì)譜庫日趨完善，分析軟件和工具更新升級，相信不遠的將來會有越來越多簡單、快速、高通量的快篩方法被開發(fā)應用到獸藥殘留的風險監(jiān)測和日常監(jiān)督檢驗中，為動物源性食品的監(jiān)管和生產(chǎn)發(fā)展提供更加豐富、高效、科學的技術手段。