楊 佳，黨 凱，薛美蘭, *，梁 惠 *，張 楠，王 青，裴忠仟，秦益民

（1.青島大學基礎醫(yī)學院，山東 青島 266071；2.青島大學公共衛(wèi)生學院，山東 青島 266071；3.青島大學附屬醫(yī)院眼科，山東 青島 266021；4.青島明月海藻集團有限公司，海藻生物活性物質國家重點實驗室，山東 青島 266555）

隨著人們生活水平的不斷提高，越來越多的居民飲酒，據世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全世界每年約有330萬人死于過量飲酒[1]。研究表明長期過度飲酒是危害肝臟造成嚴重肝病的主要原因之一，其中酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）在臨床上最為常見。ALD是一種逐漸加重的肝臟疾病，包括從早期的脂肪變性到肝炎、肝纖維化和肝硬化的一系列進行性病理變化。脂肪變性和炎癥損傷是ALD發(fā)生發(fā)展的主要早期驅動因素，研究表明，自噬在維持基礎代謝、抑制炎癥損傷和調節(jié)免疫方面具有重要作用，通過調節(jié)自噬在病變早期對ALD進行積極有效的干預，對阻斷ALD病程進展顯得至關重要。研究發(fā)現(xiàn)，激活自噬可減輕炎癥損傷和改善脂質代謝紊亂[2-3]。同時，有文獻報道酒精可靶向激活自噬負調控通路磷酸肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路，下調轉錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）的表達，通過減少自噬加重酒精誘導的肝損傷[4]。ALD的發(fā)病機制復雜，臨床上主要通過改善癥狀及預防并發(fā)癥對其進行治療，盡管已嘗試多種干預措施改善后，但目前ALD的治療仍然是基于戒酒和短期接觸皮質類固醇[5]。研究表明仍然有近40%的ALD患者沒有受益于此治療，因此，加快研究其主要的發(fā)病機制并研發(fā)相應藥物進行治療顯得尤為重要。

研究報道上調Parkin誘導的線粒體自噬可能是治療乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）或酒精介導的肝病的潛在新療法，其通過清除受損線粒體減輕酒精或APAP引發(fā)的肝損傷[6]。蓋芒槭提取物可以上調自噬相關基因的水平，誘導肝細胞自噬，保護肝臟免受酒精誘導的損傷[7]。另外，甘氨酸香豆素（glycine coumarin，GCM）通過上調p62基因表達激活核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）通路，并誘導小鼠肝細胞自噬，從而減少暴露于慢性或急性乙醇的小鼠的肝毒性損傷[8]。上述研究均表明，通過相應干預物誘導自噬可以減輕酒精暴露引發(fā)的肝毒性損傷。

巖藻多糖是褐藻類植物（如昆布、海帶）中所特有的硫酸化多糖分子，又稱為褐藻多糖硫酸酯。研究表明，巖藻多糖因富含豐富的硫酸基以及獨特的多糖結構使其具有多樣的生物活性，如抗氧化、降脂、抗病毒、抗腫瘤、調節(jié)免疫等，加之我國褐藻資源非常豐富，因而成為研究熱點[9]。在動物實驗和HepG2細胞實驗中，研究發(fā)現(xiàn)巖藻多糖減少促炎環(huán)氧化酶2和一氧化氮的產生，改善酒精引起的肝臟炎癥損傷[10]。此外研究顯示巖藻多糖具有調節(jié)自噬的活性，Zhang Jie等[11]發(fā)現(xiàn)巖藻多糖通過增強自噬改善多柔比星誘導的急性心臟損傷。前期研究也證實，巖藻多糖通過下調mTOR/核糖體蛋白70S6激酶（ribosomal protein 70S6 kinase，p70S6K）/TFEB通路誘導乳腺癌細胞自噬從而抑制腫瘤的發(fā)展[11]。

以上結果表明，酒精通過靶向mTOR蛋白通路抑制自噬，而激活自噬可減輕ALD早期的炎癥損傷和脂質代謝紊亂，巖藻多糖是否可通過調節(jié)mTOR/p70S6K通路誘導自噬來抑制ALD小鼠的早期進展還有待進一步研究探討。本實驗通過建立ALD小鼠模型，用巖藻多糖進行干預，通過相應指標測定來探究其對ALD早期進展的抑制作用及相應機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

C57BL/6小鼠，雄性，8 周齡，體質量（22±2）g，無特定病原體，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于青島大學公共衛(wèi)生學院動物飼養(yǎng)中心的光控房間中（12 h明暗循環(huán)），控制溫度（21±2）℃、相對濕度50%～60%。實驗期間小鼠自由獲得食物和自來水。

巖藻多糖購買于美國Sigma公司，其來源于墨角藻，分子式為C18H27O21S3，分子質量為675.6 kDa。巖藻多糖是水溶性多糖，故采用水提或酸提取法從藻類中分離，為硫酸化L-巖藻糖聚合物（純度95%）。

無水乙醇 天津科密歐化學試劑有限公司；戊巴比妥鈉、鋨酸醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛 北京索萊寶生物科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒 上海寶曼生物科技有限公司；電泳緩沖液、快速電轉緩沖液、配膠試劑盒上海雅酶生物技術有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-4、IL-6 美國Biolegend公司；谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測試劑盒、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；抗LC-3B II兔一抗、抗磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1（phosphorylated-mammalian target of rapamycin complex 1，p-mTORC1）兔一抗 美國Proteintech公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）熒光二抗、抗TFEB兔一抗、抗β-actin兔一抗、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記二抗 美國ABclonal公司；抗p62兔一抗、抗p-p70S6K兔一抗美國Cell Signaling Technology公司；增強化學發(fā)光液（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒 北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

HK400超純水機、YD-1508R輪轉切片機、TEC-2800型包埋機 日本Olympus公司；－80 ℃低溫冰箱美國Sigma公司；JA2003A精密電子天平、FacsCanto II流式細胞儀、MT-360多功能快速振蕩器、ELx808通用酶標儀 美國BioTek公司；DCM-120KE制冰機 英國Hoshizaki公司；Micro 17低溫離心機、OMS100自動溫控烘箱 美國Thermo公司；VCX130超聲波細胞粉碎儀美國Bio-Rad公司；CX40型光學顯微鏡 日本Hitachi公司；Nikon Eclipse80i熒光顯微鏡 日本Nikon公司；JEM1200EX型透射電子顯微鏡 美國Sonics公司；Countess II全自動生化分析儀 美國Invitrogen公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組和干預

將30 只8 周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠按體質量隨機分成3 組，每組10 只，分別為對照組（生理鹽水）、酒精模型組和巖藻多糖干預組。對酒精模型組和巖藻多糖干預組的小鼠，每天用體積分數50%乙醇溶液先以8 mL/kgmb灌胃2 周，再以12 mL/kgmb繼續(xù)灌胃6 周，建立ALD小鼠模型。同時，在乙醇灌胃2 h后給予巖藻多糖干預組小鼠灌胃300 mg/kgmb巖藻多糖（溶解于生理鹽水），1 次/d；對照組小鼠給予等量的生理鹽水；灌胃8 周。

1.3.2 樣品采集

實驗干預8 周后，小鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉。摘除眼球取血，然后分離并固定肝組織。將切下的肝組織一部分固定在質量分數4%多聚甲醛溶液中進行組織病理學分析，另一部分固定在2.5%戊二醛溶液中進行超微結構分析，其余部分在液氮中快速冷凍。

1.3.3 肝臟組織病理學檢查

肝臟標本用質量分數4%多聚甲醛4 ℃固定24 h后石蠟包埋。將肝臟組織切成4 μm厚的薄片并用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光學顯微鏡下進行組織病理學觀察。

1.3.4 透射電子顯微鏡觀察肝臟超微結構

肝組織樣本依次用3%戊二醛溶液和1%鋨酸溶液固定。再用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌，并用不同體積分數丙酮溶液（30%、50%、70%、80%、90%、100%）脫水。將樣品嵌入環(huán)氧樹脂浸透中并在自動溫控烘箱中固化。再用超薄切片機將固化后的樣品切成40～60 nm的超薄切片。再用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對切片進行雙染染色。最后，通過透射電子顯微鏡對切片進行觀察和分析。

1.3.5 血脂指標檢測

血清樣本于3 000 r/min離心15 min，再通過ELISA試劑盒測定TG、TC、LDL-C、HDL-C和TBA水平，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.6 血清轉氨酶和肝臟炎癥因子的檢測

將分離出的動物血清樣品放入全自動生化分析儀中。按照設定程序自動檢測ALT和AST活力。用ELISA試劑盒檢測肝臟中的IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α水平。

1.3.7 炎性細胞比例檢測

將來源于肝臟的單核細胞與純化的特定一抗在4 ℃下孵育10 min，然后再用相應的二抗孵育30 min。在流式細胞儀上進行檢測，檢測干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、IL-4、IL-17和表面抗原分化簇4（the people surface antigen cluster of differentiation 4 protein，CD4）的含量，并用Flowjo軟件分析數據，計算炎性細胞輔助性T細胞（helper T cell，Th）1、Th2和Th17的比例。

1.3.8 微管相關蛋白1輕鏈3β熒光抗體檢測

冷凍的肝組織用體積分數10%甲醛溶液固定12 h。再依次用體積分數75%乙醇溶液對其進行脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。再用3%小牛血清封閉切片，一抗微管相關蛋白1輕鏈3β（microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta，LC3B）于4 ℃孵育過夜，再用Tris緩沖鹽溶液（Tris buffered saline，TBS）洗滌3 次，滴加4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染液，避光孵育5 min，用抗熒光衰減封片劑封片，再用熒光標記的二抗對樣品進行孵育1 h，最后，在暗室中用熒光顯微鏡進行免疫熒光檢查和成像觀察。

1.3.9 蛋白免疫印跡分析

用裂解緩沖液提取肝組織總蛋白，然后用BCA蛋白濃度定量法計算蛋白濃度。蛋白質通過12.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行分離，用電轉儀將其轉移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。膜在室溫下依次用5%脫脂牛奶封閉1 h，并進一步與特定的一抗和二抗一起孵育。特異性一抗如下：LC3B II（V（抗體）∶V（抗體稀釋液）＝1∶1 000，下同）、p62（1∶1 000）、p-MTORC1（1∶1 000）、p-p70S6K（1∶1 000）、TFEB（1∶1 000）、HRP二抗（1∶1 000）。最后，用ECL對膜進行可視化，并使用Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.4 數據處理與統(tǒng)計

采用SPSS13.0軟件對采集到的數據進行分析，通過平均值±標準差評估定量數據。數據通過單因素方差分析進行顯著性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 巖藻多糖對酒精暴露小鼠肝組織形態(tài)學的影響

HE染色結果顯示，對照組肝小葉結構清晰，肝細胞索呈放射狀排列于小葉中央靜脈周圍，肝細胞內無明顯脂肪變性。酒精模型組肝細胞腫脹，有Mallory小體，伴有脂肪變性，中央靜脈和小葉中央區(qū)域可見炎性細胞浸潤。巖藻多糖干預后，肝細胞細胞質中的Mallory小體和脂肪滴較少，肝索排列整齊，組織結構趨于正常（圖1A）。電子顯微鏡觀察到，對照組細胞器豐富，大量線粒體形態(tài)正常，內嵴結構清晰，可見較多自噬體（箭頭所示）。酒精模型組線粒體嵴模糊，自噬體減少。巖藻多糖干預后，線粒體嵴清晰，自噬體增多（箭頭所示，圖1B）。Liu Xiao等[12]研究報道，酒精引起小鼠肝索腫脹、肝細胞壞死和炎性細胞浸潤。將受精后4 d的斑馬魚幼蟲暴露于350 mmol/L乙醇溶液32 h，HE染色結果顯示肝臟腫大明顯、肝實質空泡化和行為異常，并伴有肝脂肪變性和脂質過氧化損傷，證實酒精暴露會造成肝組織不良病理損傷[13]。

圖1 巖藻多糖對ALD小鼠肝組織形態(tài)的影響Fig.1 Effect of fucoidan on liver histomorphology in ALD mice

2.2 巖藻多糖對酒精暴露小鼠血清轉氨酶的影響

AST和ALT水平是肝損傷的常規(guī)指標，一般通過評估AST和ALT水平來檢測肝損傷?；趯LD患者的診斷，結果顯示ALT和AST水平出現(xiàn)非特異性輕中度增高[14]。此外，研究證實，慢性酒精刺激會引起小鼠體內ALT和AST水平的明顯升高，加重肝損傷[15]。如圖2所示，酒精模型組的ALT和AST水平顯著高于對照組，分別增加約1.8 倍和68%（P＜0.05或P＜0.01）。巖藻多糖干預后，與酒精模型組相比，ALT和AST水平分別降低55%（P＜0.05）和14%。

圖2 巖藻多糖對ALD小鼠血清ALT和AST活力的影響Fig.2 Effect of fucoidan on serum ALT and AST activities in ALD mice

2.3 巖藻多糖對酒精暴露小鼠血脂水平的影響

飲酒與血脂水平密切相關[16-18]。適度的飲酒會提高HDL-C和TG的水平，同時降低LDL-C的水平，而大量飲酒對血脂有不利影響。研究發(fā)現(xiàn)，在ALD小鼠體內，酒精可明顯升高血清TC、TG和LDL-C的水平，降低血清HDL-C的水平，造成肝臟中的脂質積累[18]。如圖3所示，酒精模型組TG、TC、LDL-C和TBA水平較對照組顯著升高（P＜0.05、P＜0.01或P＜0.001），分別升高60%、76%、51%和約12 倍。同時，酒精干預也降低了HDL-C水平（P＞0.05）。巖藻多糖干預后，血清TG、TC、LDL-C和TBA水平低于酒精模型組（分別下降22%、25%、39%和37%），其中TC、LDL-C和TBA水平差異顯著（P＜0.05），而HDL-C水平與模型組相比升高（P＞0.05）。

圖3 巖藻多糖對ALD小鼠血脂水平的影響Fig.3 Effect of fucoidan on blood lipid levels in ALD mice

2.4 巖藻多糖對酒精暴露小鼠炎癥因子水平的影響

Szabo等[19]發(fā)現(xiàn)酒精誘導的脂多糖激活Toll樣受體4受體復合物，然后導致活化B細胞的核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）途徑的下游激活，從而誘導促炎細胞因子和趨化因子的產生，包括TNF-α、IL-1β和IL-6。如圖4所示，酒精模型組IL-1β、TNF-α和IL-6水平較對照組顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），分別升高46%、55%和約1 倍，但IL-4水平明顯降低（P＞0.05）。與酒精模型組相比，巖藻多糖干預后IL-1β、TNF-α和IL-6水平顯著下降（P＜0.05），分別下降23%、49%和36%，此外，IL-4水平明顯增加，但沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖4 巖藻多糖對ALD小鼠炎性因子的影響Fig.4 Effect of fucoidan on liver inflammatory factors in ALD mice

2.5 巖藻多糖對酒精暴露小鼠Th1、Th2和Th17細胞比例的影響

慢性乙型肝炎的發(fā)病機制與Th1/Th2失衡有關。Th1/Th2失衡會促進Th1/Th2細胞分泌炎癥因子，降低機體對病毒和細菌的免疫能力，進而加重疾病[20-21]。據報道Th1和Th17細胞與炎癥性腸病、多發(fā)性硬化和類風濕性關節(jié)炎的發(fā)病機制有關[22]。Th1和Th17細胞的定量在某些疾病的免疫紊亂研究中起著重要作用[23-24]。IFN-γ、IL-4和IL-17是炎性細胞分泌的特異性細胞因子，Th1主要分泌TFN-γ，Th2主要分泌IL-4，Th17主要分泌IL-17，它們都屬于CD4＋T淋巴細胞亞群。圖5A中IFN-γ比例代表Th1細胞比例，IL-4比例代表Th2細胞比例，圖5B中IL-17和CD4雙染比例代表Th17細胞比例。與對照組相比，酒精干預后Th1、Th2和Th17細胞比例顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。而在巖藻多糖干預后促炎性Th1、Th2和Th17細胞的比例明顯降低，分別降低了18%、27%（P＜0.05）和58%（P＜0.05）。

圖5 巖藻多糖對Th1、Th2和Th17細胞比例的影響Fig.5 Effect of fucoidan on the proportion of Th1,Th2 and Th17 cells

2.6 巖藻多糖對酒精暴露小鼠自噬蛋白活性的影響

研究酒精對小鼠自噬蛋白活性的影響，證實長期接觸酒精可促進p70S6K和eIF4E結合蛋白（eIF4E-binding protein，4EBP1）的磷酸化進而抑制自噬[25]。此外，用體積分數50%乙醇溶液（15 mL/kgmb）持續(xù)灌胃小鼠4 周，p62蛋白表達被上調，LC3B II/LC3B I轉化率減少，肝細胞自噬被抑制，可見小鼠肝組織脂質積累和氧化應激損傷[26]。另一動物研究也揭示慢性酒精喂養(yǎng)的小鼠肝細胞的溶酶體生物合成和自噬通量水平會減少，其中TFEB的蛋白表達被下調[27]。研究顯示，酒精對自噬的抑制機制與mTOR通路有關，酒精可激活mTOR的機制靶點并抑制TFEB的核轉位，造成自噬減少進而加重酒精誘導的肝損傷[28]。如圖6所示，Western blot結果表明，與對照組相比，酒精干預后p62、p-mTORC1和p-p70S6K磷酸化蛋白表達顯著上調（P＜0.05或P＜0.01），分別增加約9 倍、45%和約1 倍。另外，酒精干預對TFEB和LC3B II蛋白表達有抑制作用，分別降低了42%和39%（P＜0.05）。據報道海藻提取物可促進LC3B I向LC3B II的轉化，促進Beclin 1的表達，通過降低PI3K/Akt/mTORC1通路關鍵成分的磷酸化來介導細胞自噬[29]。此外，巖藻多糖作為一種從海藻中提取的硫酸化多糖，已證實其可上調LC3B II/I和TFEB表達，增強p62/SQSTM1選擇性自噬，進而抑制NOD結構域樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎性體的激活和細胞脂質積累，減緩頸動脈粥樣硬化斑塊的進展[30-31]。在體內外實驗中，巖藻多糖通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，激活自噬，進而抑制小鼠肝癌缺氧誘導的淋巴管生成和淋巴轉移，阻止肝癌進一步惡化[32]。研究表明，巖藻多糖能有效降低p62、p-mTORC1和p-p70S6K的蛋白表達（P＜0.05）（分別降低26%、24%和39%），明顯上調TFEB和LC3B II的蛋白表達（P＜0.05）（分別增加51%和35%）（圖6）。

圖6 巖藻多糖對ALD小鼠自噬蛋白活性的影響Fig.6 Effect of fucoidan on autophagy-related protein expression in ALD mice

2.7 巖藻多糖對酒精暴露小鼠LC3B蛋白活性的影響

免疫熒光結果（圖7）顯示，酒精模型組的LC3B蛋白表達水平明顯低于對照組，而在巖藻多糖干預后，其LC3B蛋白的表達水平明顯高于酒精模型組。肝細胞中LC3B蛋白經熒光染色后被染成紅色（即表達陽性），如圖8所示，酒精模型組LC3B蛋白表達陽性細胞數水平較對照組降低61%（P＜0.05），而巖藻多糖干預后，與酒精模型組相比，LC3B蛋白表達陽性細胞數顯著提高（P＜0.05），約提高1.5 倍。

圖7 免疫熒光分析LC3B蛋白表達水平（400×）Fig.7 Effect of fucoidan on LC3B protein expression analyzed by immunofluorescence (400×)

圖8 LC3B蛋白表達陽性細胞數Fig.8 Effect of fucoidan on the number of cells expressing LC3B protein

3 討論

酒精性肝病因高發(fā)生率和死亡率，已成為全球最普遍的慢性肝病類型[33]。ALD是長期大量飲酒所致的一種進行性加重的肝臟疾病，其發(fā)病機理復雜，包括酒精及其有毒代謝產物對肝臟的損害作用、氧化應激與脂質過氧化反應、腸道菌群失調和炎癥級聯(lián)應答等[34]。脂肪肝是ALD發(fā)生的第一階段，脂質產物的累積（如TG）導致脂質過氧化和氧化應激，進而誘導肝實質細胞凋亡和肝臟炎癥[35]。炎癥是ALD的主要特征之一，炎癥反應在酒精性肝炎向肝纖維化、肝硬化進展中起著關鍵性作用。過量飲酒可誘導Kupffer細胞向M1表型轉變，后者通過分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細胞因子以及炎癥介質招募中性粒細胞、淋巴細胞浸潤引起肝內炎癥反應[36]。本實驗通過8 周酒精灌胃建立ALD小鼠早期病變模型，再給予300 mg/kgmb巖藻多糖進行干預。研究結果表明，酒精干預明顯提高了TG、TC、LDL-C、TBA的水平，造成小鼠脂質代謝損傷，而巖藻多糖干預后明顯降低小鼠血清TG、TC、LDL-C和TBA的水平，改善了小鼠肝臟脂質代謝紊亂，降低小鼠肝臟脂質毒性，這與Park等[37]發(fā)現(xiàn)巖藻多糖可明顯降低血清TC、TG和LDL-C水平，改善泊洛沙姆-407誘導的小鼠高脂血癥研究結果一致。血清ALT和AST的水平是檢測肝損傷常用的敏感指標，ALT和AST的濃度越大，說明肝細胞損傷或壞死越嚴重[38]。ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)巖藻多糖降低了AST和ALT水平，并有效改善了酒精引起的肝損傷。另外，通過HE染色和透射電子顯微鏡觀察，酒精模型組肝細胞腫脹，有Mallory小體，伴有脂肪變性，以及中央靜脈和小葉中央區(qū)域可見大量炎性細胞浸潤。而巖藻多糖干預后明顯改善了肝臟的變形，并恢復了脂肪變性、腫脹和細胞質空泡化等肝細胞不良癥狀變化，使肝組織的結構趨于正常。

流式細胞儀觀察到酒精模型組Th1、Th2和Th17細胞比例顯著增加，提示酒精暴露可引起肝細胞炎癥。300 mg/kgmb和600 mg/kgmb巖藻多糖干預非肥胖糖尿病小鼠5 周后，明顯降低小鼠脾臟IL-1、IL-2、IL-6的水平，也降低Th1型細胞因子數量，下調Th1細胞介導的自身免疫反應[39]。Yang等[40]研究表明，低聚巖藻多糖治療可降低Th2和Th17細胞數量，減少炎性因子的產生，減少氣道炎癥。本研究結果也顯示巖藻多糖干預后明顯降低Th1、Th2和Th17細胞比例。此外，在對小鼠給予酒精灌胃給藥8 周后，小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高，而巖藻多糖干預后TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低，證實巖藻多糖具有良好的抗炎活性。

Ma Yue等[41]研究顯示，用含乙醇的Lieber-DeCarli飲食（前4 周內，乙醇的卡路里從30%增加到36%，每周增加2%）持續(xù)喂養(yǎng)小鼠5 周，免疫印跡實驗結果證實酒精暴露降低LC3B I的轉化，減少了自噬通量水平。在8 周酒精暴露小鼠的研究中，免疫熒光結果也顯示酒精降低LC3B熒光表達，同時免疫印跡實驗結果也表明酒精明顯上調p62、p-mTORC1和p-p70S6K磷酸化蛋白表達，抑制LC3B II/I的轉化和TFEB的表達，證實酒精明顯抑制小鼠肝細胞自噬。

目前，針對ALD早期患者的治療方式主要是戒酒、營養(yǎng)支持和藥物治療，因面臨戒酒困難，個體遺傳差異和藥物毒副作用等影響，ALD患者臨床總體治療效果并不理想[42]。因此，迫切需要研究新的特效藥物和治療方法。隨著對自噬深入的研究，研究者發(fā)現(xiàn)，激活肝細胞自噬是治療ALD的一種潛在治療方法。自噬的激活會加速脂質代謝和增加溶酶體中脂滴蛋白和脂質的數量[43]。Saito等[44]研究證實，自噬可通過促進核受體輔阻遏物1（the nuclear receptor corepressors1，NCoR1）的降解進而促進過氧化物酶體增殖劑激活受體-α（peroxisome proliferator-activated receptor-alpha，PPARα）的激活，從而增強β-氧化和酮體的產生，減少脂質氧化受損。此外，酒精代謝會增加體內乙醛、活性氧等有毒代謝產物，引發(fā)線粒體損傷，損傷的線粒體會釋放線粒體活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）、mtDNA，進而激活肝巨噬細胞中的NLRP3炎癥小體，引發(fā)肝炎癥反應。而激活自噬清除損傷線粒體可阻止NLRP3炎性體激活，抑制中性粒細胞浸潤和炎性因子的分泌進而改善炎癥[45]。Yuan Chunlin等[46]研究表明，紅景天根可上調自噬蛋白自噬相關4同源物B和LC3B的表達，通過激活自噬促進PPARα、肉堿棕櫚酰轉移酶1α的表達，增強果糖誘導大鼠的脂肪酸β-氧化，減輕大鼠肝脂肪變性損傷。Kim等[47]發(fā)現(xiàn)依折麥布通過AMPK激活和TFEB核易位誘導自噬，抑制NLRP3炎癥小體的激活，改善脂肪性肝炎。在本研究中，免疫印跡實驗結果顯示巖藻多糖干預明顯下調了p62、p-mTORC1和p-p70S6K蛋白表達，提高LC3B II/I的轉化率，促進TFEB的核轉位，表明巖藻多糖通過抑制mTORC1/p70S6K通路促進肝細胞自噬。結果表明，巖藻多糖可能通過激活自噬改善ALD小鼠肝臟脂質毒性和炎癥損傷，但其靶向自噬影響脂質代謝和炎癥的具體機制在未來還需進一步研究。綜上，巖藻多糖可作為預防和治療酒精性肝病的有效分子。

4 結論

本研究結果表明，巖藻多糖對ALD小鼠早期病變具有改善作用，可減少小鼠肝細胞脂質積累，發(fā)揮降脂活性。此外，巖藻多糖也可減少炎性細胞數量和降低炎性因子分泌水平，發(fā)揮抗炎活性。另外，巖藻多糖可抑制mTORC1/p70S6K自噬通路，促進肝細胞自噬，抑制ALD小鼠早期病變進展。在機制上，巖藻多糖對ALD小鼠早期病變的改善作用可能與自噬調節(jié)有關。因此，合理補充巖藻多糖等海藻類生物活性物質可能是預防ALD的潛在方法。