張碧宇，周建峰，項(xiàng)林敏，顏艷陽，隋玉杰

（1.溫州市質(zhì)量技術(shù)檢測科學(xué)研究院，浙江 溫州 325000；2.溫州市食品藥品檢驗(yàn)科學(xué)研究院，浙江 溫州 325000）

我國是世界上肉制品生產(chǎn)和消費(fèi)第一大國。隨著生活水平的提高，肉類食品在居民食品消費(fèi)中的比例日益增加，人們對肉制品的安全問題也越來越重視。同時(shí)，肉制品中的農(nóng)藥殘留問題也逐漸引起人們的關(guān)注。肉制品中常見的農(nóng)藥殘留主要有有機(jī)磷農(nóng)藥殘留、有機(jī)氯農(nóng)藥殘留和擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留等。目前，殘留最多的種類是有機(jī)磷農(nóng)藥[1]。一方面，有機(jī)磷農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛使用，導(dǎo)致農(nóng)作物中存在不同程度的農(nóng)藥殘留，并對土壤和水體環(huán)境造成一定程度的污染，由此導(dǎo)致畜禽飼料及生活環(huán)境的有機(jī)磷農(nóng)藥污染。其中，倍硫磷更是對水生生物具有極高毒性，可能對水體環(huán)境產(chǎn)生長期不良影響，澳大利亞自2015年10月以后禁止使用含有倍硫磷的產(chǎn)品；另一方面，在畜牧養(yǎng)殖加工過程中，二嗪磷、辛硫磷、倍硫磷等作為獸藥殺蟲劑廣泛用于畜類防疫殺蟲方面，可按比例配制成藥液，噴涂牲畜體表或進(jìn)行藥浴。其中，二嗪磷可注射牛體，滅殺牛瘤蠅的幼蟲，也可作為家庭衛(wèi)生用殺蟲噴霧劑。

此外，在我國，因農(nóng)藥殘留引起的食品中毒事件時(shí)有發(fā)生，不法商家在腌制火腿等食品中，添加有機(jī)磷農(nóng)藥用來防腐和防蟲[2]，更有甚者，用有機(jī)磷農(nóng)藥浸泡肉制品來牟取非法利益。有機(jī)磷農(nóng)藥超標(biāo)會導(dǎo)致人體出現(xiàn)一系列神經(jīng)中毒癥狀，如出汗、震顫、精神錯(cuò)亂、語言失常，嚴(yán)重者會出現(xiàn)呼吸麻痹，甚至死亡[3]。

由此可見，二嗪磷、辛硫磷、倍硫磷不僅可以作為農(nóng)藥殺蟲劑，還可作為獸藥殺蟲劑，從而導(dǎo)致肉制品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留超標(biāo)，通過生物鏈富集到人體，進(jìn)而產(chǎn)生殘留毒性，嚴(yán)重威脅人體健康。但在國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)中并無肉制品中有機(jī)磷殘留量的檢測方法[4]，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中也未見肉制品中有機(jī)磷殘留量的GC-MS/MS檢測方法。目前，對于肉制品中有機(jī)磷的前處理方法主要有液液萃取法[5]、固相萃取法和GPC凈化法等[6-7]。這些方法在處理樣品的過程中，有機(jī)試劑使用量大，導(dǎo)致洗脫、濃縮過程耗時(shí)、費(fèi)力、污染大。而基于QuEChERS法的前處理方法具有試劑使用量少、前處理過程簡單、回收率高等優(yōu)點(diǎn)[8]，不僅有利于實(shí)驗(yàn)室提高檢測效率，還能減少有機(jī)試劑的污染。有機(jī)磷的檢測方法主要有光譜法[9-10]、氣相色譜法[11-13]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-16]、液相色譜-三重四極桿聯(lián)用法[17-19]。但是，氣相色譜法僅能依靠時(shí)間定性，在結(jié)果判斷中易出現(xiàn)把雜峰誤認(rèn)為目標(biāo)峰的情況，從而導(dǎo)致判斷錯(cuò)誤，影響檢測結(jié)果；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法也同樣有類似的問題，時(shí)間相近的且離子碎片質(zhì)量相同的情況下無法準(zhǔn)確定性；液相色譜-三重四極桿聯(lián)用法雖然準(zhǔn)確性比前兩者高，但它不能檢測有機(jī)氯農(nóng)藥，存在一定局限性。而GC-MS/MS檢測方法，不僅檢出限低、干擾少，能夠同時(shí)檢測多種類農(nóng)藥殘留，且以多反應(yīng)監(jiān)測進(jìn)行判斷，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。試驗(yàn)通過對QuECh-ERS前處理方法的優(yōu)化，并采用高靈敏度和準(zhǔn)確度的GC-MS/MS檢測肉制品中二嗪磷、辛硫磷、倍硫磷、倍硫磷砜、倍硫磷亞砜殘留量。這不僅能確保肉制品的質(zhì)量，達(dá)到有效監(jiān)管，維護(hù)消費(fèi)者的權(quán)益；還能為今后肉制品中有機(jī)磷國家標(biāo)準(zhǔn)的制定提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同種類的市售肉制品樣品，包括醬油肉、鹵羊排、醬牛肉、鹵雞腿、烤鴨、燒鵝、鹵豬心、醬鴨舌、鹵豬肝、鹵牛百葉、鹵鴨腸（依次編號為1～11），市售；乙腈、乙酸乙酯、C18粉、硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉、PSA，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司提供；二嗪磷、辛硫磷、倍硫磷、倍硫磷砜、倍硫磷亞砜、環(huán)氧七氯B標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量濃度100 mg/L），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

8890A-7000D型氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電子轟擊源EI）、HP-5型色譜柱（30 m×250μm×0.25μm，美國Agilent公司產(chǎn)品；T25型分散機(jī)，德國IKA公司產(chǎn)品；水浴加熱氮吹儀，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品；SIGMA 3K15型冷凍離心機(jī)（轉(zhuǎn)速≥5 000 r/min），美國Sigma公司產(chǎn)品；渦旋混合儀，賽默飛世爾LP Vprtex Mixer公司產(chǎn)品；移液器（Research Plus），美國Eppendorf公司產(chǎn)品；微孔濾膜（0.22μm有機(jī)相），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確移取5種有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)品1.00～10 mL棕色容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，配制成10.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在-18℃下避光保存。稱取5 mg環(huán)氧七氯B標(biāo)準(zhǔn)品至10 mL棕色容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，配制成500.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在-18℃下避光保存。移取環(huán)氧七氯B標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0～100 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，配制成5.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在進(jìn)行測試前，移取適量有機(jī)磷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和環(huán)氧七氯B標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制成標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線質(zhì)量濃度為10.0，20.0，50.0，100.0，500.0 ng/mL，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為100.0 ng/mL。

1.3.2 樣品的制備

（1）樣品制備。將樣品1～11分別用粉碎機(jī)粉碎、裝袋、標(biāo)號，密封后保存于-18℃冰箱中。

（2）加標(biāo)樣品制備。取2.00 g粉碎后的樣品1室溫解凍，按照0.05，0.10，0.50 mg/kg這3個(gè)水平的加標(biāo)量，將稀釋后的有機(jī)磷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到肉制品中，加入乙酸乙酯溶液5.0 mL，在室溫下自動(dòng)振蕩12 h，待混合均勻后，氮吹揮去多余溶劑，即獲得加標(biāo)樣品，與冰箱4℃下保存，備用。前處理優(yōu)化及部分方法學(xué)數(shù)據(jù)以樣品1為代表進(jìn)行檢測，而實(shí)際樣品分析是將樣品2～11號按照2.3.2加標(biāo)制備所得。

1.3.3 樣品前處理[20-21]

稱取2.0 g樣品（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入乙腈10 mL、硫酸鎂4 g、氯化鈉1 g、檸檬酸鈉1 g、檸檬酸氫二鈉0.5 g，勻漿1 min后以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心5 min。吸取上清液6 mL加到硫酸鎂1 200 mg、PSA 400 mg及C18400 mg的15 mL塑料離心管中，渦旋混勻1 min，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確吸取上清液2 mL于10 mL試管中，40℃水浴中氮?dú)獯抵两?。加入?nèi)標(biāo)溶液20μL，加入乙酸乙酯1 mL復(fù)溶，過微孔濾膜，用于測定。

1.3.4 GC-MS/MS參數(shù)

色譜柱：Agilent HP-5 Ultra Inert（30 m×250μm×0.25μm）；程序升溫（70℃保持2 min，然后以25℃/min升溫至150℃，再以5℃/min升溫至240℃，12℃/min升溫至300℃，保持6 min）；載氣：He（純度≥99.999%），流速1.2 mL/mim；進(jìn)樣口溫度280℃；進(jìn)樣量1μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；電子轟擊源70 eV；離子源溫度280℃；MSD傳輸線溫度280℃；溶劑延遲3 min；多反應(yīng)監(jiān)測：各目標(biāo)物分別選取一對定量離子、一對定性離子。

定量離子、定性離子其保留時(shí)間、定量離子對、定性離子對和碰撞電壓見表1。

表1 定量離子、定性離子其保留時(shí)間、定量離子對、定性離子對和碰撞電壓

1.3.5 前處理優(yōu)化試驗(yàn)

（1）萃取溶劑的選擇。準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品于50 mL塑料離心管中，分別以乙腈、甲醇、丙酮進(jìn)行萃取，其他條件不變，按1.3.3處理，考查回收率，確定最佳的萃取試劑。

（2）粉劑比例的優(yōu)化。準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品于50 mL塑料離心管中，其他條件不變，按1.3.3處理，在勻漿前，改變粉劑加入量，分別加入硫酸鎂4 g、氯化鈉1 g、檸檬酸鈉1 g、檸檬酸氫二鈉0.5 g（下稱“粉劑Ⅰ”）；C18粉2.0 g（下稱“粉劑Ⅱ”）；硫酸鎂4 g、氯化鈉1 g、檸檬酸鈉1 g、檸檬酸氫二鈉0.5 g、C18粉2.0 g（下稱“粉劑Ⅲ”）進(jìn)行考查，確定最優(yōu)粉劑加入比例。

（3）水浴溫度的優(yōu)化。準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品于50 mL塑料離心管中，其他條件不變，分別以40，50，60℃下水浴溫度進(jìn)行氮吹，考查回收率，確定氮吹時(shí)最佳的水浴溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 萃取溶劑的選擇及結(jié)果

不同萃取試劑及加標(biāo)回收率見圖1。

由圖1可知，不同的萃取試劑對這5種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率影響不大，但由于丙酮會萃取較多雜質(zhì)，且價(jià)格較甲醇和乙腈高，不利于實(shí)驗(yàn)室開展大批量試驗(yàn)計(jì)劃；而乙腈的極性比甲醇大，更適用于萃取大部分農(nóng)藥。因此，選取乙腈作為萃取溶劑。

圖1 不同萃取試劑及加標(biāo)回收率

2.1.2 粉劑比例的優(yōu)化及結(jié)果

不同粉劑比例及加標(biāo)回收率見圖2。

圖2 不同粉劑比例及加標(biāo)回收率

由圖2可知，隨著C18粉的增加，辛硫磷的回收率顯著下降，而倍硫磷亞砜在粉劑Ⅲ中回收率最高，綜合5種有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率數(shù)據(jù)，選擇粉劑Ⅰ為最優(yōu)粉劑比例，能滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求。

2.1.3 水浴溫度的優(yōu)化及結(jié)果

不同水浴溫度及加標(biāo)回收率見圖3。

圖3 不同水浴溫度及加標(biāo)回收率

由圖3可知，40℃水浴溫度下，加標(biāo)回收率略優(yōu)于其他溫度，因此選擇40℃作為水溶溫度。

2.2 方法學(xué)評價(jià)

2.2.1 線性關(guān)系、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限

取1.3.1配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液1.0 mL加入5個(gè)氮?dú)獯蹈傻目瞻讟悠分?，按?.3.4設(shè)置的氣相色譜儀和三重四極桿質(zhì)譜參數(shù)，分別進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。以目標(biāo)物響應(yīng)值于內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)、目標(biāo)物濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到5種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以3倍和10倍信噪比計(jì)算檢出限和定量限。

5種農(nóng)藥的線性關(guān)系、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。

表2 5種農(nóng)藥的線性關(guān)系、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.2.2 精密度、回收率

采用上述建立的方法，以1.3.2制備的樣品1進(jìn)行試驗(yàn)，在0.05，0.10，0.50 mg/kg這3個(gè)水平分別做6個(gè)平行試驗(yàn)，將樣品連續(xù)進(jìn)樣3 d，得到日內(nèi)和日間精密度。

日內(nèi)和日間精密度見表3。

表3 日內(nèi)和日間精密度

結(jié)果表明，5種農(nóng)藥在樣品1中的日內(nèi)和日間回收率均為86%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～11.7%，符合農(nóng)殘檢測的要求。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將2.2.2處理的樣品分別在第1天、第3天、第7天分別進(jìn)樣，以回收率判斷樣品的穩(wěn)定性。

穩(wěn)定性試驗(yàn)回收率見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)回收率

結(jié)果表明，樣品在7 d內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2.4 實(shí)際樣品加標(biāo)分析

按照1.3.2制備2～11號樣品，加標(biāo)量為0.10 mg/kg，按照2.2.2處理，每個(gè)樣品重復(fù)2次，并分別做空白試驗(yàn)。

實(shí)際樣品回收率見表5。

表5 實(shí)際樣品回收率

結(jié)果表明，樣品回收率在80%～120%，符合農(nóng)殘檢測的要求。

3 結(jié)論

建立了以QuEChERS法為基礎(chǔ)的GCQQQ同時(shí)檢測肉制品中5種農(nóng)藥殘留的方法。該方法具有前處理簡便、準(zhǔn)確度高、檢出限低、重復(fù)性好、穩(wěn)定性佳等優(yōu)點(diǎn)，適用于肉制品種農(nóng)藥殘留量的定性和定量分析，能為今后肉制品中農(nóng)藥殘留檢測提供依據(jù)。