張春華,翟愛華
(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),黑龍江 大慶 163319;2.綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,黑龍江 綏化 152061)
紅小豆具有高蛋白、低脂肪、多營養(yǎng)的特點(diǎn)[1],其含有的多種生物活性物質(zhì),如多酚、黃酮等成分,具有抗氧化、降血糖、提高免疫力、抗癌等功效,紅小豆是一種藥食同源雜糧[2]。紅小豆內(nèi)含人類機(jī)體必需的8類氨基酸,含量最大的是賴氨酸(Lys)與谷氨酸(Glu)[3],為植物蛋白的優(yōu)質(zhì)供體。紅小豆中的蛋白含量為20.92%~24.00%,高于肉類、雞蛋、牛奶和禾谷類食物[4]。豆類分離蛋白除了營養(yǎng)價(jià)值高、易吸收外,還具有良好的功能性,可以添加到各種食品中[5-7]。提取豆類分離蛋白方面,酶解法、堿溶酸沉法、超濾膜法與超聲波輔助法等的應(yīng)用率很高[8-11],各具優(yōu)劣勢。
超聲波和纖維素酶處理可以分解和破壞植物細(xì)胞壁纖維結(jié)構(gòu),使原料中的蛋白質(zhì)溶出,以提高蛋白質(zhì)的提取率。具諸多優(yōu)勢,包括反應(yīng)條件溫和、高提取率、低成本、提取時(shí)間少等[12-14]?,F(xiàn)多采用多種方法結(jié)合,提高提取效率。通過利用超聲輔助纖維素酶的方法建立了一種紅小豆蛋白質(zhì)的提取方法。此法可使紅小豆蛋白質(zhì)得率顯著提升,改善提取技術(shù),為后續(xù)開發(fā)應(yīng)用紅小豆蛋白質(zhì)打下良好基礎(chǔ),在理論上給予借鑒。
紅小豆,種子公司出售。
FA2104型電子天平,上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司產(chǎn)品;DFY-500型高速搖擺式超微粉碎機(jī),溫山市林大機(jī)械有限公司產(chǎn)品;SH10A型可見分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品;PHS-25型數(shù)顯酸度計(jì),上海偉業(yè)儀器廠產(chǎn)品;Scientz-IID型細(xì)胞超聲破碎儀,寧波新芝公司產(chǎn)品;PS-08A型超聲波清洗機(jī),東莞市潔康超聲波設(shè)備公司產(chǎn)品;TGL-16B型臺(tái)式高速離心機(jī),湖南星科科學(xué)儀器公司產(chǎn)品;DW-86L型超低溫保存箱,青島海爾股份有限公司產(chǎn)品;FD-27型冷凍干燥機(jī),北京德天佑科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品;K9840型自動(dòng)定氮儀,濟(jì)南海能儀器有限公司產(chǎn)品;HYP-1004型消化爐,上海纖檢儀器有限公司產(chǎn)品;BGZ-30型電熱鼓風(fēng)干燥器,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品;SRJX-4-9型箱式電阻爐,江蘇東臺(tái)縣電器廠產(chǎn)品。
2.1.1 蛋白質(zhì)含量
參照GB 5009.5—2016測定。
2.1.2水分含量
參照GB 5009.3—2016測定。
2.1.3脂肪含量
參照GB 5009.6—2016測定。
2.1.4灰分含量
參照GB 5009.4—2016測定。
2.1.5上清液中蛋白質(zhì)含量的測定
參照考馬斯亮藍(lán)法[15]。
首先,利用纖維素酶(50 U/mg)水解紅小豆粉,破壞植物細(xì)胞壁纖維結(jié)構(gòu),以增加堿溶酸沉法提取時(shí)蛋白質(zhì)的溶出率。隨后進(jìn)行超聲波處理,再利用堿溶酸沉法提取,可大大提高蛋白質(zhì)的提取率。
其工藝流程如下:
紅小豆→清洗浸泡去皮→冷凍干燥→粉碎過篩→石油醚脫脂→脫脂紅小豆粉→加纖維素酶處理→超聲處理→堿溶酸沉法提取→離心分離→收集上清液→調(diào)節(jié)pH值至等電點(diǎn)→離心分離→取沉淀物→反復(fù)水洗離心→真空冷凍干燥→紅小豆蛋白質(zhì)。
計(jì)算公式如下:
式中:M提取——提取出紅小豆蛋白的質(zhì)量,即上清液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量,g;
M原料——脫脂紅小豆粉的質(zhì)量,g;
C總蛋白含量——單位質(zhì)量紅小豆中蛋白質(zhì)的含量,%。
2.4.1 超聲物料濃度選擇試驗(yàn)
當(dāng)超聲時(shí)間、超聲功率、超聲溫度與酸堿度依次為20 min,400 W,35℃,9.0時(shí),分析不同料液比(1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30)對紅小豆分離蛋白質(zhì)得率的影響。
2.4.2 超聲功率選擇試驗(yàn)
當(dāng)超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比、酸堿度依次為20 min,35℃,1∶25,9.0時(shí),分析不同超聲功率(100,200,300,400,500 W)對紅小豆蛋白質(zhì)得率狀況的影響。
2.4.3 超聲時(shí)間選擇試驗(yàn)
當(dāng)超聲溫度、超聲功率、料液比與酸堿度依次為35℃,400 W,1∶25,9.0時(shí),分析不同超聲時(shí)間(10,15,20,25,30 min)對紅小豆蛋白質(zhì)得率的影響。
2.4.4 纖維素酶酶解時(shí)間試驗(yàn)
固定加酶量250 U/g,pH值4.8,酶解溫度30℃,料液比1∶25,分析不同酶解時(shí)間(20,25,30,35,40 min)對紅小豆蛋白得率狀況的影響。
2.4.5 纖維素酶酶解pH值試驗(yàn)
固定加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度與料液比依次為250 U/g,35 min,30℃,1∶25,分別在pH值為4.0,4.4,4.8,5.2,5.6的條件下,分析對紅小豆蛋白提取率的影響。
2.4.6 酶解溫度試驗(yàn)
固定加酶量250 U/g,pH值4.8,酶解時(shí)間35 min,料液比1∶25,分別考查在酶解溫度為25,30,35,40,45℃的條件下對紅小豆蛋白提取率的影響。
2.4.7 加酶量選擇試驗(yàn)
固定料液比1∶25,調(diào)節(jié)pH值至4.8,分別按照100,150,200,250,300 U/g的加酶量加入纖維素酶,置于水浴鍋中于30℃溫度條件下進(jìn)行酶解35 min,考查對紅小豆蛋白提取率的影響。
采取單因素試驗(yàn),將纖維素酶酶解溫度、酶解時(shí)間與pH值依次固定為30℃,35 min,4.8,考查指標(biāo)為提取率,對紅小豆蛋白提取效果有顯著影響的主要因素超聲功率、超聲時(shí)間、料液比、纖維素酶用量進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。
正交設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。
表1 正交設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)
脫脂紅小豆粉主要成分含量見表2。
表2 脫脂紅小豆粉主要成分含量/%
3.2.1 料液比對紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響
料液比對紅小豆蛋白提取率的影響見圖1。
圖1 料液比對紅小豆蛋白提取率的影響
由圖1可知,料液比同蛋白質(zhì)得率間的關(guān)系,料液比初始為1∶10,隨著料液比的提高,紅小豆蛋白得率先逐漸提高;當(dāng)料液比為1∶25時(shí),得率達(dá)峰值;當(dāng)料液比為1∶30時(shí),得率大幅降低。這表明適宜的料液比可以促使蛋白質(zhì)溶出,再增大料液比,溶液濃度降低,溶質(zhì)減少,提取率隨之下降[12]。因此,在此試驗(yàn)條件下料液比為1∶25最好。
3.2.2 超聲功率對紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響
超聲功率對紅小豆蛋白提取率的影響見圖2。
圖2 超聲功率對紅小豆蛋白提取率的影響
由圖2可知,在超聲功率逐漸增大時(shí),紅小豆蛋白得率呈先提高再下降的表現(xiàn),功率為400 W時(shí),提取率達(dá)最大值,這可能是由于超聲破碎紅小豆的細(xì)胞壁使其細(xì)胞中的蛋白溶出,提高了蛋白的得率,然而在超聲功率〉400 W時(shí),超聲會(huì)破壞蛋白質(zhì)的溶出,導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,使得蛋白質(zhì)得率下降[14]。
3.2.3 超聲時(shí)間對紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響
超聲時(shí)間對紅小豆蛋白提取率的影響見圖3。
由圖3可知,當(dāng)超聲時(shí)間處于10~25 min水平,隨紅小豆蛋白質(zhì)得率增加呈上升表現(xiàn),當(dāng)超聲時(shí)間為25 min時(shí),蛋白質(zhì)得率達(dá)峰值;但超聲時(shí)間〉25 min時(shí),紅小豆蛋白得率在超聲時(shí)間提高的同時(shí)稍見下降,這是因?yàn)槌晻r(shí)間過長,破碎已溶出的蛋白,同時(shí)超聲時(shí)間過長產(chǎn)生熱量對蛋白具有破壞作用,所以提取率反而下降[14]。
圖3 超聲時(shí)間對紅小豆蛋白提取率的影響
3.2.4 酶解時(shí)間對紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響
纖維素酶酶解時(shí)間對紅小豆蛋白提取率的影響見圖4。
圖4 纖維素酶酶解時(shí)間對紅小豆蛋白提取率的影響
由圖4可知,酶解時(shí)間在35 min時(shí),紅小豆蛋白提取率達(dá)到最高,隨后呈現(xiàn)下降的趨勢。這是由于隨著酶解時(shí)間增加,纖維素酶進(jìn)一步對破碎后的紅小豆細(xì)胞壁進(jìn)行水解,蛋白質(zhì)溶出,提取率升高;隨時(shí)間增加,蛋白質(zhì)變性,凝集沉淀,提取率降低[13]。
3.2.5 酶解pH值對紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響
酶解pH值對紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響見圖5。
圖5 酶解p H值對紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響
由圖5可知,不同的酶解pH值對紅小豆蛋白提取率不同,當(dāng)pH值4.4時(shí),紅小豆蛋白提取率最低,因?yàn)樵損H值位于紅小豆蛋白等電點(diǎn)附近,蛋白凝集沉淀,提取率最低;pH值4.8時(shí),蛋白提取率最高,此時(shí)纖維素酶活性最大,蛋白質(zhì)-水相互作用增強(qiáng),溶解性提高;隨pH值增大,纖維素酶活性降低,提取率降低[14]。
3.2.6 酶解溫度對紅小豆蛋白提取率的影響
酶解溫度對紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響見圖6。
由圖6可知,酶解溫度可影響紅小豆蛋白得率,在酶解溫度上調(diào)至30℃時(shí),得率最高,隨著溫度繼續(xù)提高,得率反而降低,原因在于溫度過高會(huì)減弱纖維素酶活力,使得酶解不徹底,同時(shí)在受熱情況下,紅小豆蛋白會(huì)發(fā)生分解,降低蛋白質(zhì)得率[13]。
圖6 酶解溫度對紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響
3.2.7 纖維素酶用量對紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響
纖維素酶用量對紅小豆蛋白提取率的影響見圖7。
圖7 纖維素酶用量對紅小豆蛋白提取率的影響
由圖7可知,在酶用量處于一定范圍時(shí),紅小豆蛋白得率正向相關(guān)于酶用量,在酶用量為250 U/g時(shí),可實(shí)現(xiàn)最大得率,隨著酶用量增加,得率稍見下降。可見,酶用量在250 U/g以下時(shí),酶量少,底物沒有充足的酶作用,這時(shí)增加酶用量可以使底物與酶解反應(yīng)充足和完全,隨著酶用量繼續(xù)增加,底物被酶飽和,不會(huì)出現(xiàn)明顯的酶解變化,且總固形物含量上升,同時(shí)纖維素酶擴(kuò)散作用降低,蛋白質(zhì)提取率也變化不大[13]。因此,單因素試驗(yàn)確定最佳酶用量為250 U/g。
正交試驗(yàn)方案和試驗(yàn)結(jié)果見表3,方差分析見表4。
表4 方差分析
通過表3所示R值能夠發(fā)現(xiàn),影響紅小豆蛋白質(zhì)得率最大的因素是料液比,其次為超聲功率,纖維素酶用量次之,超聲時(shí)間相對最弱,提取的最優(yōu)工藝為料液比1∶25(g∶mL),超聲功率400 W,纖維素酶用量250 U/g,超聲時(shí)間30 min。根據(jù)最優(yōu)組合A2B2C3D2,經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),此工藝下能夠?qū)崿F(xiàn)75.38%的紅小豆分離蛋白得率,與正交試驗(yàn)所示各處理得率相比皆偏高,可見所得優(yōu)化水平具可靠性。
表3 正交試驗(yàn)方案和試驗(yàn)結(jié)果
超聲輔助纖維素酶法技術(shù)對紅小豆蛋白的提取有顯著提高,可以大大增加蛋白質(zhì)的提取率,在纖維素酶用量250 U/g,料液比1∶25(g∶mL),超聲功率400 W,超聲時(shí)間30 min,實(shí)際提取率75.38%。比傳統(tǒng)的堿溶酸沉法節(jié)省了提取時(shí)間,降低了成本,優(yōu)化了紅小豆蛋白提取工藝,為下一步紅小豆蛋白質(zhì)的開發(fā)利用奠定了良好的基礎(chǔ),提供了理論指導(dǎo)。