呂宇婧 吳丹丹 孔春艷，2 楊宇 龔明

（1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心 云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室，昆明 650500；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，紅河 661699）

木葡聚糖是雙子葉和非禾本科單子葉植物初生細胞壁中最豐富的半纖維素多糖［1-3］。其具有1,4-β-葡聚糖主鏈，主鏈上有1,6-α-木糖基殘基［4］。木葡聚糖與纖維素通過非共價鍵連接，與果膠和其他多糖等物質(zhì)作用形成一個三維網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)成了植物初生細胞壁的主要承重結(jié)構(gòu)［5］。木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水 解 酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases,XTH）屬于糖苷水解酶16 家族（glycoside hydrolase 16, GH16），是細胞壁的修飾酶，參與植物細胞壁的擴張、重建和重構(gòu)［6］。目前已知XTH 的最適底物是低聚葡聚糖和木葡聚糖。該酶可以切斷木葡聚糖并將新產(chǎn)生的還原端連接到另一個木葡聚糖的非還原端（葡萄糖轉(zhuǎn)移）或水解，故而具有兩種活性，即催化木葡聚糖分子1,4-β-糖苷鍵斷裂的木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶活性（XET）和催化木葡聚糖水解的水解酶活性（XEH）［7-8］。

XTH 家族由多基因編碼，研究表明XTH基因家族在擬南芥［9］、水稻［10］、煙草［11］、大豆［12］和大麥［13］中分別有33、29、56、61 和24 個成員。XTH家族成員具有一個高度保守的催化位點ExDxE；還存在兩個保守結(jié)構(gòu)域，分別命名為Glyco_hyho_16和XET_C。XET_C 結(jié)構(gòu)域是XTH 蛋白區(qū)別于GH16超家族其他蛋白的主要原因。根據(jù)XTH 蛋白的結(jié)構(gòu)特點，可將該家族成員分為Group I/II、Group III和祖先組。Group I/II 表現(xiàn)出顯著的木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶（XET）活性，Group III 成員被證明可以催化木葡聚糖水解（木葡聚糖內(nèi)水解酶活性，XEH）［14-15］。XTH 通過調(diào)控細胞壁擴張性、從而對調(diào)節(jié)植物細胞生長發(fā)育起重要作用，如花的發(fā)生、根的形成和維管組織發(fā)育。在康乃馨中，DcXTH2和DcXTH3轉(zhuǎn)錄本在花瓣中顯著積累，并在花期表現(xiàn)出高XET 活性［16］。擬南芥AtXTH21可通過改變纖維素的沉積和細胞壁的伸展來調(diào)節(jié)初生根的生長［17］。鷹嘴豆CaXTH1參與調(diào)節(jié)上胚軸薄壁細胞的伸長和維管組織的發(fā)育［18］。另一方面，多種非生物脅迫會對細胞壁代謝產(chǎn)生影響；植物響應(yīng)脅迫時，XTH的表達水平及酶活性會發(fā)生變化，通過調(diào)節(jié)細胞壁的可塑性、進而調(diào)節(jié)植物細胞對逆境脅迫的響應(yīng)與適應(yīng)［19］。過表達辣椒CaXTH3基因可增強擬南芥植株的抗旱和抗鹽性［20］。過表達AtHAP5A的擬南芥植株對冰凍脅迫表達出更強的耐受性［21］。AtXTH31通過調(diào)節(jié)細胞壁木葡聚糖含量和鋁結(jié)合能力來影響擬南芥對鋁脅迫的敏感性［15］。過表達胡楊PeXTH可增強木葡聚糖的降解，從而降低轉(zhuǎn)基因煙草對Cd2+的吸收和積累，使Cd2+的毒性得到緩解［22］；并通過改善煙草在鹽脅迫下根系的生長和葉片的肉質(zhì)化，進而提高其耐鹽性［23］。上述研究表明XTH參與調(diào)節(jié)植物細胞的生長發(fā)育及其對多種逆境脅迫的抗性。

小桐子（Jatropha curcasL.）又稱麻瘋樹、膏桐等，由于其種子的高含油量、莖葉中某些生物活性物質(zhì)的醫(yī)學(xué)用途及耐干旱瘠薄土壤環(huán)境的特性，是一種極具開發(fā)潛力的多用途能源植物［24-25］。由于其原產(chǎn)地為中美洲和南美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)［26］，也是一種對零上低溫敏感的冷敏植物（chilling-sensitive plant），當遭受零上低溫脅迫時，細胞會發(fā)生一系列變化，如膜損傷、活性氧產(chǎn)生、滲透脅迫以及丙二醛積累等［27］。本團隊前期研究表明，12℃低溫鍛煉48 h 可顯著緩解小桐子幼苗在1℃強低溫脅迫下的氧化脅迫和滲透脅迫，提高其存活率和抗冷性［28-29］。

miRNAs（microRNAs）是一種長度為21-24 nt的內(nèi)源性小RNA，可通過轉(zhuǎn)錄本剪接、翻譯抑制等參與對靶基因表達的負調(diào)控，進而參與植物細胞生長發(fā)育的調(diào)控及對逆境脅迫的響應(yīng)［30-31］。前期研究表明，12℃低溫鍛煉會引發(fā)小桐子細胞內(nèi)數(shù)百個miRNAs 的響應(yīng)，進而調(diào)控抗冷性相關(guān)基因的表達［32］。但是否有miRNAs 參與調(diào)控植物XTH基因目前尚未見報道。

基于本實驗室早期研究［33］和近期完成的小桐子低溫鍛煉的轉(zhuǎn)錄組及降解組測序結(jié)果的數(shù)據(jù)分析［34-35］，發(fā)現(xiàn)小桐子中有數(shù)個XTH基因?qū)?2℃低溫鍛煉表現(xiàn)出強烈響應(yīng)，且有多個miRNAs 靶向作用于小桐子XTHs，但目前小桐子XTH基因家族及其與之互作的miRNAs 尚未見報道。本研究對小桐子XTH基因家族以及對該基因家族成員具有靶向調(diào)控作用的miRNAs 進行了全基因組鑒定，分析了該家族各成員的理化性質(zhì)、染色體定位、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、蛋白特征、基因結(jié)構(gòu)及在小桐子植株不同器官及低溫鍛煉、干旱及鹽脅迫下的表達情況，構(gòu)建了JcXTH基因家族成員與相應(yīng)miRNAs 的互作網(wǎng)絡(luò)圖，以試圖從一個側(cè)面闡明JcXTH基因家族及與之互作的miRNAs 在小桐子對低溫響應(yīng)與適應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用小桐子種子來自云南元謀縣。種子用1.5%硫酸銅消毒后進行暗萌發(fā)，待其生根后，種入基質(zhì)中并在植物培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度條件為26℃/20℃，光周期為16 h/8 h。待幼苗的第3 片真葉展開后，于12℃進行低溫鍛煉，分別在0、6、12、24 和48 h 取樣，液氮速凍后置于-80℃下保存?zhèn)溆茫?4-36］。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組、miRNA 組和降解組測序 小桐子幼苗在12℃低溫鍛煉過程中的轉(zhuǎn)錄組、miRNA 組和降解組測序見前文［34-35］。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)登錄號為PRJNA661688，miRNA 組登錄號為PRJNA660857，降解組登錄號為PRJNA661178。

1.2.2 小桐子XTH 家族成員的鑒定與理化性質(zhì)預(yù)測 將擬南芥［9］、水稻［10］和大麥［13］的XTH蛋白序列作為種子序列，在小桐子基因組數(shù)據(jù)庫JCDB［37］（http://jcdb.liu-lab.com/） 中 進 行blastp比對，以及通過HMM 的Glyco_hydro_16 結(jié)構(gòu)域（PF00722）和XET_C 結(jié)構(gòu)域（PF06955）對小桐子蛋白庫進行搜索，得到候選蛋白序列。進一步使用CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）和MEME v5.3.3（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）對XTH蛋白保守結(jié)構(gòu)域、特征性motif 進行驗證［38-39］。去除冗余序列，將鑒定到的蛋白命名為JcXTH（1-29）。將小桐子XTH 蛋白序列提交至ExPASy 中的ProParam 工具（https://web.expasy.org/protparam/），計算氨基酸殘基數(shù)量、分子量（Mw）、理論等電點（pI）和總親水性平均值（GRAVY）。蛋白質(zhì)亞細胞定位的預(yù)測通過Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#））進行。

1.2.3 小桐子XTH基因家族染色體定位與系統(tǒng)發(fā)育分析 根據(jù)Wu 等［40］發(fā)表的基因連鎖圖譜獲取JcXTHs的位置信息，鑒定家族蛋白中存在的重復(fù)事件，計算Ka/Ks 值。Ka/Ks 值是每個非同義位點的非同義替換次數(shù)（Ka）與每個同義位點的同義替換次數(shù)（Ks）之比，該值大于1、等于1 及小于1 分別表示正向選擇、中性選擇和純化選擇，可以用來衡量重復(fù)基因?qū)χg的作用。使用MEGA 10.0.5 對擬南芥和小桐子XTH 蛋白進行多序列比對，以鄰接法（Neighbour-Joining method, NJ）、Bootstrap method 1 000 次重復(fù)構(gòu)建進化樹。

1.2.4 小桐子XTH 家族的基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域以及保守蛋白基序分析 使用Gene Structure Display Server 2.0（http://gsds.gao-lab.org/）分析JcXTH家族的基因結(jié)構(gòu)組成。利用TBtools 的Smart 工具分析家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。使用MEME v5.3.3（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）分析家族的保守蛋白基序。

1.2.5JcXTH家族基因的表達譜分析和相應(yīng)miRNAs作用網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 基于本實驗室的小桐子低溫鍛煉轉(zhuǎn)錄組（PRJNA661688）及miRNA 組（PRJNA660857）數(shù)據(jù)，對JcXTH家族成員及相應(yīng)的miRNAs 進行表達譜分析。從小桐子數(shù)據(jù)庫JCDB 下載RNAseq 數(shù)據(jù)［37］，分析小桐子植株不同器官及鹽和干旱脅迫下該家族成員的表達情況。從miRNA 組（PRJNA660857）和降解組（PRJNA661178）中獲得靶向于JcXTHs基因的miRNAs，并在Cytoscape 軟件中將靶向關(guān)系進行可視化展示，miRNAs 與JcXTHs基因用不同顏色進行區(qū)分。

1.2.6 小桐子XTH基因家族在低溫鍛煉下的RTqPCR 分析 為研究在低溫鍛煉的過程中小桐子XTH基因家族的響應(yīng)，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，將6 個顯著變化的JcXTHs進行RT-qPCR 驗證。使用TRIzol試劑依說明書從葉片中提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa, 大連）說明將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，存于-80℃。根據(jù)基因序列設(shè)計RT-qPCR 引物，以GAPDH作為內(nèi)參基因［41］（表1）。利用LightCycler?96 System（Roche，Switzerland）進行RT-qPCR 反應(yīng)。配置10 μL 終反應(yīng)體系，TB Green Premix Ex Taq II 5 μL、正反向引物各0.4 μL（10 μmol/L）、cDNA 模板1 μL 和ddH2O 3.2 μL。程序設(shè)置為95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火5 s，2 步擴增45 個周期；最后一步進行60-97℃熔解曲線分析。采用2-ΔΔCT方法對基因的相對表達量進行分析［41］。用SPSS（v26.0）進行顯著性分析，以不同的英文字母表示顯著性差異（P<0.05）。

表1 RT-qPCR 分析相關(guān)引物Table 1 Related primers for RT-qPCR analysis

2 結(jié)果

2.1 小桐子XTH家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

將擬南芥、水稻和大麥已鑒定的XTH 蛋白序列對小桐子蛋白庫通過blastp 以及HMM 方法得到小桐子XTH基因家族的候選序列后，將蛋白序列提交至CDD 以及MEME 驗證其結(jié)構(gòu)域，鑒定到小桐子中XTH 家族成員共有29 個，將其命名為JcXTH1-29。對家族成員的理化性質(zhì)預(yù)測分析結(jié)果表明（表2），該家族成員蛋白序列長度在269-341 個氨基酸，平均長度為291 個氨基酸，分子量在30.87-39.64 kD，理論等電點在4.88-9.05，GRAVY 均小于0，為親水性蛋白。對蛋白的亞細胞定位顯示，所有XTHs 均定位于細胞壁，其中15 個也同時定位于細胞質(zhì)中。

表2 已鑒定的小桐子XTH 蛋白的理化性質(zhì)和亞細胞定位Table 2 Physicochemical properties and subcellular location of identified XTH proteins in J. curcas

2.2 小桐子XTH家族系統(tǒng)發(fā)育分析

將擬南芥（AtXTH）［9］和小桐子（JcXTH）的62 個XTH 全長蛋白序列進行比對，使用MEGA 10.0.5 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，XTHs 可被分為3 個主要類群，擬南芥和小桐子在各類群中的蛋白數(shù)量分布相似（圖1）。分析結(jié)果表明，Group I 和Group II 之間無明顯差別，成為XTH 家族最大的分支；22 個JcXTHs 和22 個AtXTHs 聚類于Group I/II中，5 個JcXTHs 在Group III 中。Group III 可 被 進一步分為A 和B 兩個組，分別有2 個和3 個蛋白；Ancestral Group 則聚類到了AtXTH1、2、3 和11 及JcXTH21 和22。Group I/II 通常表現(xiàn)出顯著的木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶（XET）活性，而聚類在Group III 中的5個蛋白JcXTH（12-16）可能具有XEH 活性。

圖1 小桐子和擬南芥XTH 家族系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of XTH family from J. curcas and Arabidopsis

2.3 小桐子JcXTH基因家族成員染色體定位和重復(fù)事件分析

基于已報道的連鎖圖譜［40］，小桐子共有11 條染色體。將JcXTHs進行染色體定位，結(jié)果顯示，29 個JcXTHs基因分布于其中9 條染色體上，且呈現(xiàn)不均勻分布（圖2）。其中JcXTH22、JcXTH27、JcXTH25分別定位在chr01、chr08、chr10 上，在chr06 和chr09 上分布了2 個JcXTHs，chr02、chr03和chr07上各有4個JcXTHs，chr11 上分布的XTH基因最多，僅一條染色體上就有10 個JcXTHs成員（圖2）。

一般認為位于100 kb 的距離范圍內(nèi)，5 個或更少的基因座所分隔的基因被認為是串聯(lián)復(fù)制的。在chr11 和chr02 上100 kb的范圍內(nèi)檢測到6對基因（JcXTH3/JcXTH4、JcXTH3/JcXTH5、JcXTH4/JcXTH20、JcXTH5/JcXTH6、JcXTH6/JcXTH7、JcXTH8/JcXTH10）為串聯(lián)復(fù)制。串聯(lián)復(fù)制基因?qū)Φ鞍仔蛄邢嗨菩暂^高，除JcXTH4/JcXTH20的相似性為73.8%以外，其他5 對均超過90%。此外，復(fù)制的基因距離較遠，甚至位于不同的染色體上被認為是片段復(fù)制，故推測JcXTH21/JcXTH22和JcXTH23/JcXTH25兩個基因?qū)赡軄碜杂谄螐?fù)制或全基因組復(fù)制。為了確定基因的選擇行為，對所有復(fù)制基因進行Ka/Ks 檢驗，Ka/Ks 比值均小于1（圖2），說明小桐子XTH的重復(fù)基因?qū)赡苁菑募兓x擇進化而來。

2.4 小桐子XTH家族的特征性motif和多序列比對

XTH 家族成員具有一個高度保守的催化位點：ExDxE，對29 個小桐子XTH 家族成員進行motif 分析，表明該位點高度保守（圖3-A）；通過DNAMAN對其家族各成員進行多序列比對表明（圖3-B），第一個谷氨酸殘基（E）作為催化親核試劑啟動酶促反應(yīng)，第二個E 殘基是激活底物的關(guān)鍵［42］。圖3-B 中以星號（*）標出了N-糖基化位點（NxT/S/Y），此位點可以與多聚糖結(jié)合，與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有關(guān)。在Group I/II 中，N-糖基化位點所在位置與催化結(jié)構(gòu)域相鄰；Group IIIA/B 的JcXTH（12-16）蛋白，N-糖基化位點從催化結(jié)構(gòu)域向C 端位移了12 個氨基酸，已報道的其他物種中也表現(xiàn)出相似的特征。JcXTH21 和JcXTH22 蛋白則沒有這個N-糖基化位點（圖2）。

圖2 小桐子JcXTH 基因家族成員染色體定位及重復(fù)事件分析Fig. 2 Chromosome location and repeat event analysis of JcXTH gene family members of J. curcas

圖3 小桐子XTH 家族的特征性motif（A）和多序列比對結(jié)果（B）Fig. 3 Characteristic motif（A）and multiple sequence alignment results（B）of XTH family in J. curcas

為揭示小桐子JcXTH家族成員對12℃低溫鍛煉的響應(yīng)，根據(jù)本實驗室的測序數(shù)據(jù)［34-35］，將其進行表達譜的繪制及分析。如圖6 所示，在12℃低溫鍛煉48 h 期間，小桐子JcXTH家族各成員呈現(xiàn)出不同的表達模式。其中JcXTH15、JcXTH8和JcXTH2在整個低溫鍛煉期間均上調(diào)表達，且在48 h 時表達倍數(shù)最高；JcXTH1在48 h 內(nèi)均上調(diào)表達并在24 h 時表達較顯著；JcXTH19、JcXTH3、用TBtools 的Smart 工具及MEME v5.3.3 對小桐子XTH 家族蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域和蛋白基序分析（圖4）。結(jié)果表明，XTH 家族蛋白中含有一個Glyco_hydro_16 結(jié)構(gòu)域和一個XET_C 結(jié)構(gòu)域，motif 6-3-4-1-7-2 覆蓋了Glyco_hydro_16 結(jié)構(gòu)域。在其中一些蛋白中，也有缺少motif 6、motif 7 的情況，對其進行結(jié)構(gòu)域檢測，Glyco_hydro_16 完整存在。motif 5-8 主要存在于XET_C 結(jié)構(gòu)域中，在JcXTH2、JcXTH20 蛋白中，motif 10 取代了motif 5。XTH 家族的特征性motif 為motif 4。

圖4 小桐子XTH 家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和motif 分析Fig. 4 Conserved domain and motif analysis of proteins in the XTH family of J. curcas

為進一步了解小桐子JcXTH基因在進化中的結(jié)構(gòu)多樣性，根據(jù)進化分組關(guān)系，使用GSDS 2.0 對其外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進行了分析，獲得了每個XTH蛋白的基因編碼序列的結(jié)構(gòu)。在29 個小桐子JcXTH基因家族成員中，15 個JcXTHs含有3 個外顯子，14 個JcXTHs含有4 個外顯子。Group III 和Ancestral Group 的基因均有4 個外顯子，Group I/II 中7 個成員具4 個外顯子，15 個含3 個外顯子（圖5）。

圖5 小桐子JcXTH 家族基因結(jié)構(gòu)分析Fig. 5 Analysis of gene structure of JcXTH family of J. curcas

2.5 小桐子XTH家族的保守結(jié)構(gòu)域和蛋白基序分析以及基因結(jié)構(gòu)分析

2.6 小桐子JcXTH基因家族成員在低溫鍛煉期間的表達譜分析

JcXTH27、JcXTH28、JcXTH16和JcXTH18則呈現(xiàn)出下調(diào)表達的趨勢；JcXTH24、JcXTH23和JcXTH11為先下調(diào)后上調(diào)，在24 h 時明顯下調(diào)；而JcXTH20和JcXTH21在冷鍛煉期間沒有檢測到表達。值得注意的是，該基因家族的大多數(shù)成員在冷鍛煉下的本底表達量均較低，JcXTH2、JcXTH18、JcXTH23和JcXTH24則顯示出較高的表達豐度（圖6）。

圖6 小桐子JcXTH 基因家族成員在12℃低溫鍛煉期間的表達譜分析Fig. 6 Expression profile analysis of members of JcXTH gene family of J. curcas during chill-hardening at 12℃

2.7 小桐子JcXTH基因家族成員在不同器官中及在鹽和干旱脅迫下的表達譜分析

通過對已公開的RNA-seq 數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，小桐子JcXTH基因家族各成員在不同器官中及在干旱和鹽脅迫條件下均有明顯的差異化表達現(xiàn)象。如圖7-A 所示，在小桐子植株的不同器官中，JcXTH家族各基因在不同器官內(nèi)廣泛表達且表達量呈現(xiàn)出極大的差異。JcXTH29、JcXTH10和JcXTH13在種子和根中的表達相較于其他器官更高，在葉中的表 達 最 低；JcXTH6、JcXTH14、JcXTH1、JcXTH27和JcXTH21在各個器官中均顯示高表達且表達量相差不大，表明這些基因在不同器官中均可優(yōu)勢表達；相較于其他基因，JcXTH18在莖中顯著高表達，JcXTH3和JcXTH6在花蕾中高表達，暗示著這些基因在莖和花蕾形成中起重要作用。結(jié)果表明JcXTH基因家族的不同成員在不同的器官表現(xiàn)出特異性的表達模式，這可能與不同器官中特定JcXTH基因的獨特功能有關(guān)。

在鹽和干旱脅迫下，JcXTHs基因總體呈現(xiàn)明顯的上調(diào)，且JcXTHs對干旱比鹽脅迫響應(yīng)更強烈，但不同的JcXTHs基因?qū)}和干旱脅迫響應(yīng)有差異化的時空表達模式，在葉片中JcXTHs基因的總體上調(diào)表達趨勢較根系更為明顯。其中在鹽脅迫下7 d 后，葉片中JcXTH28、JcXTH12、JcXTH27和JcXTH29有顯著上調(diào)；在干旱脅迫下7 d 后，葉片中JcXTH28、JcXTH29、JcXTH13、JcXTH12、JcXTH14、JcXTH21等均有顯著上調(diào)；另一方面，JcXTH8和JcXTH10在葉片中的表達量較低或不表達（圖7-B）。

圖7 JcXTH 基因在小桐子不同器官中（A）以及在鹽和干旱脅迫下（B）的表達譜Fig. 7 Expression profiles of JcXTH genes in different organs（A）and under salt and drought stress（B）

2.8 小桐子JcXTH家族中低溫響應(yīng)基因的實時定量分析

表達譜分析結(jié)果表明，在12℃低溫鍛煉48 h期間，小桐子JcXTH家族29 個成員呈現(xiàn)出不同的表達模式（圖6）。為進一步驗證小桐子JcXTHs基因?qū)Φ蜏劐憻挼捻憫?yīng)，挑選出6 個在冷鍛煉下高響應(yīng)的JcXTHs基因，進行RT-qPCR 分析。如圖8 所示，在這6 個基因中，JcXTH2有其獨特的表達模式，從0 h 到24 h 不斷攀升，最高點的相對表達量是0 h 的90.75 倍，48 h 則下降，與6 h 時幾乎持平，相對表達量為0 h 的8 倍左右；JcXTH3和JcXTH18的表達在冷鍛煉期間呈下降趨勢；而JcXTH23和JcXTH27在48 h 冷鍛煉期間呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，JcXTH19則表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。將RT-qPCR 結(jié)果（圖8）與表達譜結(jié)果（圖6）進行相關(guān)性分析表明，其中5 個基因（JcXTH3、JcXTH18、JcXTH19、JcXTH23和JcXTH27）的相關(guān)系數(shù)依次為0.97、0.93、0.98、0.92 和0.83，相關(guān)性較高；而JcXTH2的表達譜數(shù)據(jù)在48 h 時達到最大值，RTqPCR 檢測在48 h 時的相對表達值較低，故相關(guān)系數(shù)較低，為0.41。

圖8 小桐子JcXTH 基因家族中響應(yīng)冷鍛煉基因在12℃冷鍛煉期間的RT-qPCR 分析Fig. 8 RT-qPCR analysis of the genes responding to chill-hardening in JcXTH gene family of J. curcas during chill-hardening at 12℃

2.9 靶向JcXTHs基因的miRNAs的鑒定與互作網(wǎng)絡(luò)分析

基于本實驗室的小桐子轉(zhuǎn)錄組和降解組數(shù)據(jù)，對靶向于JcXTHs的miRNAs 進行篩選鑒定，共發(fā)現(xiàn)68 個miRNAs 靶向調(diào)控JcXTH基因家族中的26 個成員。圖9 表明，miRNAs 與JcXTHs基因的靶向互作普遍存在著一對多和多對一的關(guān)系。其中JcXTH14受到了9 個miRNAs 調(diào)控，JcXTH23與JcXTH28、JcXTH12與JcXTH16分 別 受 到 了6 個和5 個miRNAs 的調(diào)控；從miRNA 的角度來看，miR10412-y 靶向調(diào)控7 個JcXTHs成員，miR2948-x、miR5293-x、miR529-x 和miR5641-y 分別靶向調(diào)控3個JcXTHs成員（圖9）。

2.10 低溫鍛煉期間靶向于JcXTHs基因的部分miRNAs的表達譜分析

從靶向于JcXTHs基因的68 個miRNAs 中，選取低溫鍛煉期間表達變化差異顯著的7 個miRNAs進行表達譜分析（圖10），結(jié)果顯示，miR3631-y、miR7747-x 和miR7731-y 總體呈現(xiàn)出上調(diào)表達的趨勢；miR5293 表現(xiàn)出先下調(diào)后上調(diào)的趨勢，在12 h的下調(diào)表達倍數(shù)最高，miR11117-y 表達則與之相反；miR5373-y 和novel-m0125-5p 在6 h 時負調(diào)，12-48 h 時為正調(diào)。根據(jù)miRNAs 與JcXTHs的靶向關(guān)系（圖9），對它們的表達譜（圖6 和圖10）進行相關(guān)性分析，miR5373 和miR7747-x 靶向于JcXTH16，相關(guān)系數(shù)為-0.74 和-0.76；miR3631-y 靶向作用于JcXTH26，其相關(guān)系數(shù)為-0.81，表明這些miRNAs 與靶向的JcXTHs基因總體呈負調(diào)控趨勢。

圖9 miRNAs 靶向調(diào)控JcXTHs 的網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 9 Network diagram of targeted regulated JcXTHs by miRNAs

圖10 靶向于JcXTHs 基因的部分miRNAs 在12℃低溫鍛煉期間的表達譜Fig. 10 Expression profile of some miRNAs targeting JcXTHs genes during chill-hardening at 12℃

3 討論

木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶（XTH）作為一種細胞壁修飾酶，可通過內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶活性對細胞壁進行松弛和重建，進而調(diào)控細胞的生長發(fā)育和對逆境脅迫的響應(yīng)與適應(yīng)［6,43］。XTH基因家族的鑒定在擬南芥、水稻、煙草、大豆和大麥等植物中已有研究［9-13］，但在小桐子中尚未見報道。本研究表明，小桐子JcXTH基因家族共有29 個成員，可分為3 個組別，分別為具木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶（XET）活性的Group I/II、具木葡聚糖水解酶（XEH）活性的Group III 以及Ancestral Group。這29 個成員不均勻地分布于9 條染色體上；其中存在著6 對串聯(lián)復(fù)制事件，均為Group I/II 的成員，以及2 對片段復(fù)制或全基因組復(fù)制事件?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，小桐子JcXTH基因家族29 成員均含3-4 個外顯子，編碼269-341 個氨基酸，其蛋白主要定位于細胞壁，結(jié)構(gòu)均具有Glyco_16 結(jié)構(gòu)域和XET_C 結(jié)構(gòu)域，并且具有負責(zé)催化活性的保守催化位點ExDxE 以及可以與多聚糖結(jié)合的N-糖基化位點。在不同的物種中，ExDxE 序列高度保守［9-13］，并且是所有XTH 蛋白的結(jié)構(gòu)特征，這種保守性意味著這些蛋白質(zhì)的功能保守。

已有一些研究表明XTHs基因參與植物對多種逆境脅迫的響應(yīng)與適應(yīng)。過表達柿子DkXTH1增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對鹽、ABA 和干旱脅迫的耐受性［44］。在低溫脅迫下，水稻OsXET9在葉片和穗部的各發(fā)育階段均能被顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達［45］。擬南芥中，5 個XTH基 因（XTH-9、-15、-16、-17和-19）在近紅外線到遠紅外線的條件下呈正向調(diào)控；敲除XTH15和XTH17基因的突變體對光信號的避光反應(yīng)喪失，這些結(jié)果表明XTH介導(dǎo)的細胞壁松弛是植物避陰反應(yīng)的關(guān)鍵因素［46］。玉米ZmXTH可以通過減少Al 在植物根和細胞壁的積累來提高轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對Al 的耐受性［47］。擬南芥XTH19和XTH23通過油菜素內(nèi)酯信號通路轉(zhuǎn)錄因子BES1 依賴的途徑，參與側(cè)根的發(fā)育并幫助側(cè)根適應(yīng)鹽脅迫［48］。本實驗室前期研究表明，在12℃下低溫鍛煉2 d 可顯著提高植株的耐冷性。對低溫鍛煉期間轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及RT-qPCR 分析表明，小桐子JcXTH家族各成員呈現(xiàn)出不同的表達模式，其中JcXTH2呈現(xiàn)極顯著上調(diào)，在冷鍛煉24 h 可比對照高出90.8 倍，暗示著JcXTH2可能在小桐子低溫適應(yīng)中起重要作用，可作為后續(xù)小桐子分子育種的候選基因。此外，對小桐子植株不同器官的JcXTHs表達譜分析發(fā)現(xiàn)，大部分JcXTH家族基因具有組織特異性的表達模式，而JcXTH家族的不同成員基因?qū)}和干旱脅迫也呈現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式。這些研究結(jié)果有助于解析JcXTH基因家族不同成員的特定功能，更好探索JcXTHs基因在小桐子生長發(fā)育及逆境脅迫適應(yīng)中的作用。

已知眾多miRNAs 參與數(shù)以萬計基因的調(diào)控、進而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育及其對逆境脅迫的響應(yīng)與適應(yīng)［49］，但目前尚未見到植物XTH基因被miRNAs調(diào)控的報道。本研究基于降解組測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，68 個miRNAs 靶向調(diào)控JcXTH基因家族中的26 個成員，并普遍呈現(xiàn)著一對多和多對一的關(guān)系；對低溫鍛煉高響應(yīng)的miRNAs 與其靶向的JcXTHs的基因表達譜進行的相關(guān)分析表明二者之間呈現(xiàn)總體的負相關(guān)，表明miRNAs 的確參與了低溫鍛煉下JcXTHs基因的表達調(diào)控。這也表明植物XTHs基因的表達除受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控外，還受到許多miRNAs的調(diào)控。后續(xù)深入研究miRNAs 如何調(diào)控XTHs基因表達對更好理解植物XTH基因家族功能及其調(diào)控有重要的科學(xué)意義，而進一步闡明低溫鍛煉期間小桐子JcXTHs基因與相應(yīng)的miRNAs 如何互作來參與小桐子對低溫脅迫的適應(yīng)，有助于從一個側(cè)面揭示小桐子抗冷性形成的分子機制。

4 結(jié)論

從小桐子中鑒定到JcXTH基因家族成員29 個，可分為3 個組別，定位于9 條染色體上。29 個家族成員在小桐子不同器官、低溫鍛煉過程及干旱和鹽脅迫下各成員存在顯著的差異化表達模式，表明該基因家族不同成員的作用不盡相同。鑒定到68 個miRNAs 靶向調(diào)控JcXTH基因家族中的26 個成員，miRNAs 與其靶向的JcXTHs的基因表達呈總體負相關(guān)，表明miRNAs 參與了低溫鍛煉下JcXTHs基因的表達調(diào)控。