賴(lài)嵐玉，羅志鋒，朱思陽(yáng)，陶倩，黎攀，杜冰*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）（2.無(wú)限極（中國(guó)）有限公司，廣東廣州 510623） （3.花安堂生物科技集團(tuán)有限公司，廣東廣州 511500）

巴戟天為茜草科植物巴戟天（Morinda officinalisnHow.）的干燥根，全年均可采挖，其產(chǎn)地主要分布于廣東、廣西、福建、海南等地。近幾年巴戟天作為保健食品原料，其功能活性物質(zhì)備受大家關(guān)注。在中醫(yī)理論中認(rèn)為巴戟天味辛、甘，性微溫，歸腎、肝經(jīng)，具祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨等功效[1]。現(xiàn)代科學(xué)也證明巴戟天具有廣泛的藥理和保健功能，其具有免疫調(diào)節(jié)[2]、抗骨質(zhì)疏松[3,4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]和抗抑郁[7]等多種生物活性，其中主要活性成分有多糖[3,4,6]、寡糖[7]、 蒽醌[8]和環(huán)烯醚萜[9]等，多糖作為巴戟天中活性成分之一[10]，是一類(lèi)具有功能活性的大分子物質(zhì)。多糖是植物中一種功能活性物質(zhì)，具有副作用小，安全性較高等特點(diǎn)，是功能性食品及保健食品開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)，近年來(lái)備受專(zhuān)家學(xué)者們的關(guān)注。

鹽制巴戟天作為傳統(tǒng)炮制加工的一種方式，早在宋代的《太平惠民和劑局方》中有提及“巴戟鹽揚(yáng)浸”?，F(xiàn)在鹽制仍然是巴戟天炮制的主要方式，《中華人民共和國(guó)藥典（2020）》亦收載有鹽制巴戟天[1]。關(guān)于鹽制巴戟天多糖的研究還處于提取工藝以及含量測(cè)定階 段[11]。現(xiàn)有的研究已經(jīng)證實(shí)，多糖結(jié)構(gòu)與其功能活性密切相關(guān)[12]。因此對(duì)鹽制巴戟天多糖結(jié)構(gòu)表征是研究其功能活性的重要一步。雖然已有人對(duì)巴戟天多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定[4,6,13,14]，但是炮制前后得到多糖會(huì)有所不同。在萬(wàn)曉瑩[15]的研究中酒制前后黃精多糖有所不同。因此對(duì)鹽制巴戟天多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，對(duì)巴戟天多糖結(jié)構(gòu)的研究具有重要意義。

鑒于此，本研究中采用離子交換纖維素DEAE-52和葡聚糖凝膠Sephadex G100柱分離純化得到鹽制巴戟天多糖（Salt-processedMorinda officinalisnPolysaccharides，SMP）得到多糖SMP-4，測(cè)定其分子量，單糖組成和結(jié)構(gòu)等并研究其免疫活性。探究SMP的結(jié)構(gòu)并評(píng)價(jià)其免疫活性，為鹽制巴戟天多糖的研究奠定理論基礎(chǔ)。同時(shí)，巴戟天作為國(guó)家衛(wèi)健委規(guī)定可用于保健食品的原料，對(duì)于其活性成分的研究，為巴戟天在功能性食品方面的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用指明方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

抽芯巴戟天，廣東省云浮市郁南縣大方鎮(zhèn)巴戟天市場(chǎng)；RAW264.7巨噬細(xì)胞，中山大學(xué)細(xì)胞庫(kù)；離子交換纖維素DEAE-52（DE-52）、葡聚糖凝膠Sephadex G100等為國(guó)產(chǎn)分析純；小鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和CCK-8 ELISA試劑盒，欣博盛生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Vertex 70傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó)布魯克·道爾頓公司；LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；Heratherm?高端微生物培養(yǎng)箱、Evolution 300紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、Multiskan? FC酶標(biāo)儀、Thermo Scientific? ISQ? 7000 GC-MS單四極桿，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Hei-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)Heidolph公司；SHZ-III循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 鹽制巴戟天制備

將巴戟天去除泥土，用清水洗凈，瀝干待用。洗凈瀝干水分的巴戟天按料液比1:1（g/mL）加入2%（m/V）鹽水煮60 min，撈出瀝干。60 ℃熱風(fēng)干燥24 h，干燥后粉碎過(guò)24目篩，得干燥的鹽制巴戟天粉末。

1.3.2 鹽制巴戟天粗多糖提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取鹽制巴戟天粉末，按料液比1:60（g/mL）加入φ=80%乙醇，80 ℃回流兩次，每次2 h，過(guò)濾后取濾渣。再按料液比1:100（g/mL）加入蒸餾水，100 ℃回流提取、過(guò)濾、減壓濃縮，加入4倍體積的φ=95%乙醇，4 ℃靜置12 h。取沉淀加少量φ=75%乙醇溶解后，在4 000 r/min離心10 min，得到的沉淀用少量水溶解后，采用Sevage法脫蛋白質(zhì)，再裝入透析袋中，透析至透析液電導(dǎo)率≤1.5 μs/cm。透析后的多糖溶液真空冷凍干燥48 h，得到鹽制巴戟天粗多糖。

1.3.3 鹽制巴戟天粗多糖純化

將鹽制巴戟天粗多糖樣品配制成濃度為10 mg/mL的溶液，用0.22 μm濾膜過(guò)膜處理后，上樣到DE-52交換柱（Φ1.5×40.0 cm），流速為2.0 mL/min，用0.00、0.02、0.10、0.30 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，自動(dòng)收集器收集分離組分（5 mL/管）。共收集到4個(gè)不同組分：SP-1、SP-2、SP-3、SP-4，苯酚-硫酸法測(cè)定收集組分的多糖含量。再使用Sephadex G100柱對(duì)含量較高的組分SP-4（Φ1.5×40 cm）進(jìn)一步純化，最后通過(guò)減壓濃縮、透析脫鹽和真空冷凍干燥得到純化多糖（SMP-4）。

1.3.4 多糖結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.4.1 傅里葉變換紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)T-IR）檢測(cè)

在無(wú)水的條件下，將1 mg的SMP-4粉末與100 mg KBr粉末混合，充分磨成1 mm微球，用壓片機(jī)壓片，用Vertex 70傅立葉變換紅外光譜儀在4 000~400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描分析SMP-4。

1.3.4.2 單糖組成檢測(cè)

參考黃曉蘭等[16]的方法。精確稱(chēng)取100 mg SMP-4，加入8 mL的2 mol/L H2SO4，加熱回流6 h，冷卻后加入飽和Ba(OH)2溶液中和至中性，過(guò)濾，將濾液旋干，加入14 mg鹽酸羥胺和1 mL吡啶置于90 ℃水浴加熱1 h，取出冷卻至室溫，加入5 mL乙酸酐，再于90 ℃水浴加熱1 h，冷卻至室溫，加入10 mL蒸餾水破壞乙酸酐。用氯仿對(duì)乙?；a(chǎn)物進(jìn)行萃取，經(jīng)蒸餾水洗滌后，用無(wú)水硫酸鈉脫水后氮吹濃縮至 1 mL，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析，得到SMP-4的圖譜。采用核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行GC-MS分析，得到單糖標(biāo)準(zhǔn)品圖譜。SMP-4通過(guò)與單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖的保留時(shí)間，確定單糖組成。

GC-MS條件：色譜柱為SE-30，柱溫初溫100 ℃，以10 /min℃ 升溫至280 ℃，載氣為氦氣，柱前壓為70.0 kPa，分流比為10:1，進(jìn)樣量為1 μL。

1.3.4.3 相對(duì)分子量測(cè)定

參考黃曉蘭等[16]的方法。采用高效凝膠滲透色譜（HPGPC）分析SMP-4的分子量。準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg SMP-4用0.050 mol/L含0.05% NaN3的NaH2PO4- Na2HPO4緩沖液溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)后進(jìn)行HPGPC分析。根據(jù)峰面積歸一化求得該多糖的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

HPGPC條件：流動(dòng)相為0.1 mol/L磷酸緩沖溶液，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL溶液（質(zhì)量濃度為1 g/L），色譜柱和RID的溫度均保持在35.0 ℃。 1.3.4.4 甲基化檢測(cè)

參考鄭恒光等[17]方法，稍作修改。準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg SMP-4加入5 mL無(wú)水二甲基亞砜溶解，再加入100 mg NaOH粉末，超聲處理下直至完全溶解，冷卻至室溫，緩慢加入2 mL碘甲烷溶液?jiǎn)?dòng)甲基化反應(yīng)，避光反應(yīng)24 h后加入2 mL蒸餾水終止甲基化反應(yīng)。再加入3 mL氯仿進(jìn)行萃取，重復(fù)三次，合并萃取液，60 ℃減壓旋干。加入10 mL 4 mol/L三氟乙酸，100 ℃水解2 h，再在60 ℃減壓旋干，加入5 mL乙醇，減壓旋干，加入2 mL蒸餾水溶解，用1% NaOH溶液將pH值調(diào)至10，加入10 mg NaBH4，再室溫反應(yīng)6 h。加入冰乙酸溶液將pH值調(diào)至5.5，再60 ℃減壓濃縮，加入 1 mL吡啶和1 mL乙酸酐100 ℃反應(yīng)1 h后加入1 mL蒸餾水終止反應(yīng)。加入2 mL二氯甲烷萃取，重復(fù)三次，合并萃取液加入無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)膜備用。

GC-MS條件：色譜柱為HP-5石英毛細(xì)管柱，柱溫初溫150 ℃，以10 /min℃ 升溫至280 ℃，載氣為氦氣，分流比為50:1，進(jìn)樣量為1 μL。

1.3.4.5 核磁共振波譜（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMR）檢測(cè)

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg SMP-4溶解于600 μL D2O， 3 000 r/min離心10 min，取上清液于核磁管中，用500 Hz核磁共振波譜儀檢測(cè)1H-NMR信號(hào)和13C-NMR信號(hào)。

1.3.5 巴戟天多糖免疫活性研究

1.3.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)

參考于弋涵等[18]方法，稍作修改。RAW264.7巨噬細(xì)胞采用添加了10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基（含0.5%青鏈霉素和鏈霉素）的中進(jìn)行培養(yǎng)，置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。當(dāng)細(xì)胞鋪板率達(dá)到培養(yǎng)瓶底面積的80%以上時(shí)，用移液槍吸凈原培養(yǎng)基并吸取3 mL PBS對(duì)漂浮的死細(xì)胞進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次。然后用2 mL培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打至完全脫落，將細(xì)胞懸液濃度為每毫升1.0×104個(gè)，按每孔加入l00 μL的細(xì)胞懸浮液接種至96孔板中，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.3.5.2 細(xì)胞增殖活性以及細(xì)胞因子分泌水平測(cè)定

按1.3.5.1節(jié)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)完成后，吸盡培養(yǎng)液并用PBS進(jìn)行洗滌。對(duì)照組（Control組）每孔加入200 μL完全培養(yǎng)基；陽(yáng)性對(duì)照組（LPS組）每孔加入200 μL含10 μg/mL LPS溶液的完全培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)組每孔加入200 μL含不同質(zhì)量濃度（15.625、31.25、62.5、125、250和500 μg/mL）的SMP-4溶液完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)平行，孵育24 h。干預(yù)完成后，采用CCK-8 ELISA試劑盒測(cè)定巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖活性，采用ELISA試劑盒測(cè)定TNF-α和IL-1β的分泌水平。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)，收集所有結(jié)果，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 26.0版本的單因素方差分析（ANOVA）分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P值小于0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽制巴戟天多糖純化

圖1a為采用DEAE-52柱純化鹽制巴戟天粗多糖得到的洗脫曲線(xiàn)，共得到了4個(gè)不同的多糖組分，其中SP-4組分含量明顯高于其他組分，收集SP-4組分用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。圖1b為采用Sephadex G100柱純化SMP-4得到的洗脫曲線(xiàn)，結(jié)果顯示得到無(wú)拖尾單一峰，說(shuō)明組分純度較高，利于后面的實(shí)驗(yàn)。SMP-4得率為0.085%，純度為91.46%。

圖1 鹽制巴戟天多糖洗脫曲線(xiàn)Fig.1 Elution curve of polysaccharide from salt-processed Morinda officinalis

2.2 SMP-4結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 SMP-4的FT-IR譜圖分析

SMP-4的FT-IR檢測(cè)圖如圖2所示，SMP-4在 4 000~400 cm-1范圍內(nèi)具有多糖特征峰。如在3 403 cm-1處為多糖特征峰，峰型又強(qiáng)又寬是由O-H的拉伸振動(dòng)形成；在2 932 cm-1處的吸收峰是由C-H的拉伸和彎曲振動(dòng)形成的[19]。在1 240 cm-1處的吸收峰是吡喃糖的C-O-H伸縮振動(dòng)引起的。1 093 cm-1和537 cm-1處的吸收峰是吡喃糖苷上的C=O伸縮振動(dòng)引起，SMP-4具有吡喃環(huán)糖殘基[20,21]。1 044 cm-1出現(xiàn)的吸收峰，是由呋喃環(huán)C-O-C伸縮震動(dòng)引起的，說(shuō)明SMP-4含有呋喃糖[22]。SMP-4同時(shí)包含有吡喃糖和呋喃糖。在639 cm-1處的吸收峰可能是羰基的C=O扭曲振動(dòng)形成的[23]。在 1 613 cm-1吸收峰是由N-H彎曲振動(dòng)引起的[24]。在1 750~ 1 700 cm-1無(wú)吸收峰，表示SMP-4中不含有糖醛酸[25]。

圖2 SMP-4的FT-IR檢測(cè)圖Fig.2 FT-IR detection figure of SMP-4

2.2.2 SMP-4的單糖組成分析

多糖是由單糖殘基通過(guò)糖苷鍵連接而成的，因此在分析多糖結(jié)構(gòu)中，分析單糖組成是關(guān)鍵性步驟。采用GC-MS分析得到單糖標(biāo)準(zhǔn)品和SMP-4的結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 SMP-4(a)和單糖標(biāo)準(zhǔn)品(b)的GC-MS譜圖Fig.3 GC-MS profile of SMP-4 (a) and monosaccharide standard (b)

對(duì)色譜圖分析得到結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明SMP-4由核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其中阿拉伯糖含量最高，達(dá)到了54.74%。其次為半乳糖，含量達(dá)到了22.58%。這與之前的研究中，單糖的種類(lèi)較為一致，相對(duì)摩爾比具有較大的差異。如Zhang等[6]從巴戟天中分離具有抗氧化活性酸性多糖APMO由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，相對(duì)摩爾比為1:48.58:0.86:1.67:0.74:14.92。何傳波等[13]從巴戟天分離出的一種多糖主要有葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖構(gòu)成，摩爾比為5.08:2.91:1。何傳波等[14]關(guān)于分離純化巴戟天多糖的研究中，得到兩種多糖MOHP-Ⅰ和MOHP-Ⅲ其單糖組成分別為葡萄糖、果糖和阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖以及半乳糖。

表1 SMP-4的單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of SMP-4

2.2.3 SMP-4的相對(duì)分子量分析

多糖的分子量與其免疫活性有著密切的關(guān)系。HPGPC的檢測(cè)結(jié)果如表2，SMP-4的相對(duì)分子量為1.32×105u。分布列（Mw/Mn）為1.41＜2，說(shuō)明SMP-4的有良好的均一性和溶解性，在水中具有較小的粘度，能夠增大多糖與細(xì)胞特定基團(tuán)的接觸面積[26]。

表2 SMP-4分子量Table 2 Molecular weight of SMP-4

2.2.4 SMP-4的甲基化分析

在多糖的研究中，常采用甲基化分析多糖中單糖殘基連接的方式。SMP-4經(jīng)GC-MS分析，得到了SMP-4的單糖殘基組成、單糖殘基結(jié)構(gòu)、連接和分支，對(duì)SMP-4甲基化分析結(jié)果見(jiàn)表3。SMP-4主要由→3)-D-Araf-(1→、→6)-D-Galp-(1→、和→2)-D-Rhap-(1→殘基組成，摩爾比分別為58.35%、23.11%和12.54%。SMP-4是以(1→3)糖苷鍵為主要糖苷鍵，→3)-D-Araf-(1→、→6)-D-Galp-(1→為主要構(gòu)成的大分子多糖。這與FT-IR數(shù)據(jù)和單糖組成分析的結(jié)果一致。

表3 SMP-4甲基化分析結(jié)果Table 3 Methylation analysis results of SMP-4

2.2.5 SMP-4的NMR圖譜分析

SMP-4的1H-NMR圖譜和13C-NMR圖譜如圖4、圖 5所示。多糖的特征峰[27]大多集中在δH3.0×10-6~5.5×10-6和δC60.0×10-6~100.0×10-6，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中氫譜和碳譜圖都符合這一特征。在δH4.700×10-6處出現(xiàn)的強(qiáng)烈信號(hào)是D2O中的HDO所導(dǎo)致的。一般認(rèn)為δH＞5.000×10-6是α構(gòu)型糖苷鍵氫信號(hào)，δH＜5.00×10-6是β構(gòu)型糖苷鍵信號(hào)[28]。SMP-4存在有δH5.040×10-6、5.133×10-6、5.692×10-6異位質(zhì)子信號(hào)表明其存在α構(gòu)型糖苷鍵。SMP-4存在有δH4.688×10-6、4.947×10-6異位質(zhì)子信號(hào)表明其存在β構(gòu)型糖苷鍵。在δH3.200×10-6~4.500×10-6環(huán)質(zhì)子區(qū)域的信號(hào)對(duì)應(yīng)于糖環(huán)中從C-2到C-6的質(zhì)子，而SMP-4的1H-NMR圖譜中δ值為3.200×10-6~4.500×10-6的信號(hào)被堆疊，表明多糖分子量較大，聚合程度高，結(jié)構(gòu)復(fù)雜導(dǎo)致信號(hào)重疊，較難分辨。在δH5.500×10-6~5.843×10-6（δH5.545×10-6、5.685×10-6、5.692×10-6）范圍內(nèi)出現(xiàn)信號(hào)峰中說(shuō)明 SMP-4 存在α-呋喃糖，在δH5.000×10-6~5.500×10-6（δH5.040×10-6、5.067×10-6、5.133×10-6、5.307×10-6、5.452×10-6）范圍內(nèi)出現(xiàn)信號(hào)說(shuō)明SMP-4存在α-吡喃糖[29]。在δC60×10-6~84×10-6（δC76.412×10-6、δC81.229×10-6）范圍內(nèi)出現(xiàn)的信號(hào)峰說(shuō)明SMP-4中存在吡喃糖構(gòu)型[30]。這與FT-IR分析的結(jié)果相一致。

圖4 SMP-4核磁共振氫譜圖Fig.4 NMR hydrogen diagram of SMP-4

圖5 SMP-4核磁共振碳譜圖Fig.5 NMR carbon diagram of SMP-4

綜上分析，SMP-4是以→3)-D-Araf-(1→和→6)-D-Galp-(1→為主要構(gòu)成的大分子多糖結(jié)構(gòu)。多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[12]。Yan等[3]從巴戟天中分離出能夠調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)從而改善骨質(zhì)疏松的多糖，其主要以(2→1)-β-D-Fruf為主鏈，以(1→)-α- D-Galp和(2→)-β-D-Frup為側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)。Zhang等[4]從巴戟天中分離抗骨質(zhì)疏松活性多糖MOP50-2，主要由α-D-Glcp-(1→、→1)-β-D-Fruf-(2→和β-D-Fruf-(2→殘基的構(gòu)成。在Yan等[3]和Zhang等[4]的研究中是采用巴戟天干燥處理后直接提取多糖，對(duì)比發(fā)現(xiàn)與本研究中分離出SMP-4有所不同，屬于不同的多糖。

2.3 SMP-4免疫活性研究

2.3.1 SMP-4對(duì)細(xì)胞增殖活性影響分析

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，在特異性免疫和非特異免疫中都發(fā)揮著重要的作用[31]。本實(shí)驗(yàn)中的SMP-4對(duì)于RAW264.7細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖6所示，與Control組相比，不同濃度SMP-4對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7不存在顯著差異（P＞0.5），說(shuō)明15.625~500.000 μg/mL SMP-4不影響巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖活性。在15.625~500.000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，進(jìn)行SMP-4對(duì)RAW264.7細(xì)胞免疫細(xì)胞因子分泌水平實(shí)驗(yàn)，不受細(xì)胞增殖活性的影響。

圖6 RAW264.7細(xì)胞的增殖活性Fig.6 Proliferative activity of RAW264.7 macrophages

2.3.2 SMP-4對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-1β分泌水平影響分析

TNF-α和IL-1β是由巨噬細(xì)胞分泌與機(jī)體的特異性免疫相關(guān)的細(xì)胞因子，對(duì)于研究各種炎癥性和免疫性疾病具有重要意義[32]。細(xì)胞因子在機(jī)體內(nèi)的平衡具有重要意義，現(xiàn)有的研究已證實(shí)，雖然機(jī)體內(nèi)炎癥因子的升高有利于細(xì)胞修復(fù)，但是過(guò)高的炎癥因子水平又會(huì)導(dǎo)致炎癥損傷。因此炎癥相關(guān)因子要保持在正常分泌水平以發(fā)揮最適合作用。圖7為不同濃度SMP-4對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌免疫細(xì)胞因子的影響。與LPS組相比，Control組的RAW264.7巨噬細(xì)胞相關(guān)因子分泌水平顯著低于LPS組（P＜0.05或P＜0.01），說(shuō)明RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥造模成功。

TNF-α是由巨噬細(xì)胞分泌的免疫細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[33]。SMP-4對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α的影響如圖7a所示。與Control組相比，在15.625~500.000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)SMP-4能顯著增加TNF-α的分泌，并隨著SMP-4濃度的增大TNF-α分泌水平也隨之增高，呈濃度依賴(lài)性。尤其是在250 μg/mL質(zhì)量濃度下，TNF-α達(dá)到了2 100 pg/mL，差異極顯著（P＜0.001）。但在15.625~500.000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)SMP-4促進(jìn)TNF-α分泌水平均低于LPS組。這表明在15.625~500.000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能夠提高RAW264.7細(xì)胞的TNF-α分泌水平，同時(shí)又可以避免過(guò)高的分泌水平所導(dǎo)致的炎癥。在趙文俊等[26]從美藤果粕中分離出的植物多糖SISDF在質(zhì)量濃度為 62.5~1 000.0 μg/mL范圍內(nèi)能夠使得RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α質(zhì)量濃度達(dá)到1 400~1 500 pg/mL，相比之下，62.5~500.0 μg/mL質(zhì)量濃度下SMP-4也能達(dá)到相近的效果且能避免過(guò)高分泌水平。

IL-1β是由活化的單核巨噬細(xì)胞分泌的免疫細(xì)胞因子，在介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖和分化中起重要作用。SMP-4對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-1β的影響如圖7b所示。在15.625~500.000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)SMP-4促進(jìn)IL-1β分泌水平均低于LPS組。與Control組相比，15.625~31.250 μg/mL質(zhì)量濃度下SMP-4能提高IL-1β的分泌水平（P＜0.05）。在31.25 μg/mL下IL-1β質(zhì)量濃度最高，達(dá)到了 14.5 pg/mL，未呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。這可能是不同濃度SMP-4對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的某一通路的刺激程度不一，導(dǎo)致細(xì)胞的IL-1β分泌水平有所不同。關(guān)于SMP-4刺激RAW264.7細(xì)胞中潛在的信號(hào)通路的研究有待進(jìn)一步探討。對(duì)比Zhang等[34]從羅望子中提取的具有良好免疫活性的植物多糖TKP-2-1，不同濃度的TKP-2-1能夠使得RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌的IL-1β質(zhì)量濃度達(dá)到10~15 pg/mL，而SMP-4質(zhì)量濃度為31.25 μg/mL時(shí)，能達(dá)到與之相近的分泌水平且不具有計(jì)量濃度依賴(lài)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SMP-4能夠平衡特異性免疫相關(guān)因子的分泌水平，能夠促進(jìn)分泌水平升高的同時(shí)避免過(guò)高的分泌水平，說(shuō)明SMP-4在免疫活性方面的開(kāi)發(fā)具有較大的潛力。

圖7 不同濃度SMP-4對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響Fig.7 RAW264.7 macrophage secretion level of related factors

SMP-4具有良好的免疫活性可能與其多糖結(jié)構(gòu)中存在有一定的聯(lián)系。SMP-4是以→3)-D-Araf-(1→和→6)-D-Galp-(1→為主要構(gòu)成的大分子多糖結(jié)構(gòu)。多糖以(1→3)糖苷鍵為主鏈的連接方式與其免疫活性有關(guān)[35]。如Shen等[36]，從玫瑰茄中分離出的多糖主要的由(1→3)糖苷鍵相連的HSP-II，具有良好的免疫活性。在以半乳糖和阿拉伯糖為主要單糖組成的多糖已被證實(shí)具有較高的免疫活性[37]。

3 結(jié)論

本研究分析的鹽制巴戟天多糖SMP-4是以→3)-D-Araf-(1→和→6)-D-Galp-(1→為主要糖殘基，分子量在1.32×105Da的大分子多糖。在免疫活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中，SMP-4不影響RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖，同時(shí)能夠提高RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β的水平且避免過(guò)高分泌水平導(dǎo)致炎癥。SMP-4可作為一種良好的功能性食品免疫調(diào)節(jié)劑，應(yīng)用于保健食品產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中。本研究為鹽制巴戟天多糖在功能性食品方面的開(kāi)發(fā)提供了理論支撐，這將對(duì)巴戟天作為保健食品原料的開(kāi)發(fā)具有積極的意義。