潘少香，趙岑，閆新煥，李洪霄，劉雪梅，宋燁，吳茂玉，馬超，熊永星*，鄭曉冬*

（1.中華全國(guó)供銷合作總社濟(jì)南果品研究院，山東省果蔬貯藏加工技術(shù)創(chuàng)新中心，山東濟(jì)南 250014）

（2.聊城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東聊城 252000）

靈芝（Ganoderma lucidum）是擔(dān)子菌綱（Homobasidiomycetes）多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬（Ganoderma）真菌，是一種食藥兩用的真菌，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用[1,2]。靈芝孢子粉是靈芝生長(zhǎng)成熟時(shí)從菌蓋彈射出來(lái)的淡霧狀的極其微小的孢子，主要含有多糖類、三萜類、甾醇類和生物堿類等活性成分，具有抗癌、保肝、降血脂、降血糖、抗缺氧、抗炎、清除自由基以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)作用[3-5]。我國(guó)是世界上靈芝主要的生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，2019年靈芝產(chǎn)量18.55萬(wàn)t，占全球產(chǎn)量的75%。目前靈芝的種植以人工栽培為主，我國(guó)靈芝種植主要分為四大種植區(qū)域，分別為閩浙的武夷山及龍泉區(qū)域、東北吉林長(zhǎng)白山區(qū)域、安徽一帶大別山區(qū)域和山東魯西區(qū)域，這四大區(qū)域的孢子粉產(chǎn)量占全國(guó)總產(chǎn)量的 60%以上[6]。赤芝、美芝、新大片是目前市場(chǎng)主栽的靈芝品種，藏芝、香血芝因其價(jià)值較高在山東魯西區(qū)域逐漸被引進(jìn)種植。

靈芝子實(shí)體和孢子粉中含有鈣、鎂、鐵、鋅、銅、硒等豐富的微量元素，其中豐富的硒元素越來(lái)越引起學(xué)者的關(guān)注[7]。靈芝孢子粉作為保健品，越來(lái)越受到人們的青睞，其安全性也倍受關(guān)注。由于近年來(lái)環(huán)境污染嚴(yán)重，靈芝孢子粉易受污染，特別是有害重金屬的蓄積問(wèn)題[8,9]。靈芝孢子細(xì)胞壁極為堅(jiān)固，由幾丁質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)組成，直接服用很難被胃酸消化，在實(shí)際應(yīng)用中，將靈芝孢子粉破壁后食用，或破壁提取靈芝孢子粉有效成分食用是主流服用方式[10]。目前主要工業(yè)應(yīng)用的靈芝孢子粉破壁加工方法是機(jī)械破壁法[11]，機(jī)械方法常會(huì)增加破壁靈芝孢子粉金屬元素含量，甚至造成超標(biāo)[6,11-13]，因此對(duì)于破壁靈芝孢子粉的金屬元素含量評(píng)估是非常重要的。

本研究針對(duì)我國(guó)魯西地區(qū)主栽靈芝品種，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測(cè)定靈芝子實(shí)體及孢子粉中元素及重金屬含量，開(kāi)展元素質(zhì)量及安全分析評(píng)價(jià)，同時(shí)研究目前破壁孢子粉企業(yè)廣泛應(yīng)用的擠壓破壁方式對(duì)孢子粉重金屬含量的影響，以期為靈芝子實(shí)體及孢子粉的生產(chǎn)和深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

美芝、赤芝、新大片、香血芝、藏芝等靈芝子實(shí)體、孢子粉及破壁孢子粉樣品均從魯西地區(qū)靈芝生產(chǎn)基地采取，美芝、赤芝、新大片、香血芝、藏芝等靈芝子實(shí)體均為代料栽培靈芝，赤芝粉、美芝粉、新大片粉均為代料栽培靈芝孢子粉，赤芝椴木粉為椴木栽培靈芝孢子粉。

1.2 儀器與設(shè)備

WX-8000微波消解儀，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；ICAP電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，德國(guó)默克密理博有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 元素檢測(cè)方法

1.3.1.1 微波消解條件

稱取0.3 g樣品，于微波消解內(nèi)罐中，加入5 mL純硝酸，搖勻，放入微波消解儀中，按微波消解程序進(jìn)行消解（見(jiàn)表1）。消解完成后，將消解罐轉(zhuǎn)移至電熱板上趕酸，趕酸至近干，加水溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容，搖勻[14]。

表1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion program

1.3.1.2 儀器工作參數(shù)

ICP-MS法儀器工作參數(shù)為：功率1 550 W，冷卻氣流量14.0 L/min，霧化氣流量1.0 L/min，輔助氣流量0.8 L/min，樣品提升量4.0 L/min，采樣深度7.8 mm，重復(fù)采樣3次[14]。

1.3.2 孢子粉破壁率

孢子粉破壁率檢測(cè)方法參照NY/T 1677-2008《破壁靈芝孢子粉破壁率的測(cè)定》[15]。

在進(jìn)行施工準(zhǔn)備工作前，一定要積極配合建設(shè)單位進(jìn)行組織設(shè)計(jì)的交底工作，對(duì)于施工的設(shè)計(jì)文件一定要進(jìn)行仔細(xì)的審核，也要結(jié)合實(shí)際的工程需要，進(jìn)行必要的驗(yàn)證以及補(bǔ)測(cè)。對(duì)于可能發(fā)生塌方的區(qū)域，必須要做好一定的必要準(zhǔn)備，在施工的過(guò)程中，必須做好相對(duì)應(yīng)的預(yù)防措施。在必要的情況下，采取相對(duì)的應(yīng)急措施以消除各種不利因素的影響。只有這樣，才可以避免塌方的產(chǎn)生。由于隧洞的地質(zhì)條件相對(duì)比較復(fù)雜，對(duì)于質(zhì)量的監(jiān)控以及地址預(yù)報(bào)的工作必須要做好。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD，n=3），每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，方差分析（ANOVA）用于顯著性分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；點(diǎn)線圖由Origin 9.0軟件繪制完成，聚類熱圖由R軟件分析完成，聚類方式采用歐氏距離法。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同品種靈芝子實(shí)體元素差異分析

利用ICP-MS法對(duì)赤芝、美芝、新大片、香血芝、藏芝5種靈芝子實(shí)體樣品中K、Ca、Na、Mg、Al、Fe、Cu、Zn、Mn、Se、Ni、B、Ti、V、Co、Sr、Ba17種元素進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。除K、Ca、Na、Mg四種常量元素外，F(xiàn)e、Cu、Zn、Mn 4種微量元素在5種靈芝子實(shí)體中含量相對(duì)較高，這與閆征等[16]、何晉浙等[17]研究結(jié)果一致。將5種靈芝子實(shí)體樣品元素含量進(jìn)行z-score標(biāo)準(zhǔn)化，消除各元素間量綱差異后做聚類熱圖，見(jiàn)圖1。由圖1可知，不同品種靈芝子實(shí)體樣品中元素含量差異明顯，藏芝和香血芝樣品元素含量明顯高于赤芝、美芝和新大片樣品元素含量。

由表2可知，5種子實(shí)體常量元素含量差異顯著，K含量范圍1 178~5 999 mg/kg，Ca元素含量范圍為186~1 235 mg/kg，Na元素含量范圍62.3~113 mg/kg，Mg元素含量范圍173~1 283 mg/kg。在Fe、Cu、Zn、Mn、Se、B、V、Co、Sr9種人體必需微量元素中，除B、Cu、Sr 3種元素外，藏芝子實(shí)體中其余6種微量元素含量均為最高，F(xiàn)e元素含量達(dá)到234 mg/kg、Zn元素含量達(dá)到57.9 mg/kg、Se達(dá)到0.309 mg/kg。香血芝子實(shí)體樣品B、Cu、Sr 3種元素含量最高，分別為5.75、54.1、3.60 mg/kg。5種靈芝子實(shí)體中赤芝子實(shí)體Fe、Cu、Se、Sr 4種微量元素含量相對(duì)較低，新大片子實(shí)體Zn、Mn、V、Co 4種元素含量相對(duì)較低；美芝子實(shí)體9種微量元素含量均高于赤芝和新大片樣品，低于藏芝和香血芝子實(shí)體樣品。由表2和圖1可知，赤芝、美芝、新大片3種靈芝子實(shí)體微量元素含量低于藏芝和香血芝子實(shí)體，這可能是因?yàn)槌嘀ァ⒚乐?、新大片品種是經(jīng)多年培育的產(chǎn)孢子粉靈芝品種，子實(shí)體元素品質(zhì)質(zhì)量稍差。

表2 不同品種靈芝子實(shí)體元素分布Table 2 Element content of different varieties of Ganoderma lucidum

圖1 不同品種靈芝子實(shí)體元素聚類熱圖Fig.1 Cluster heat map of elements of different varieties of Ganoderma lucidum

2.2 不同品種靈芝孢子粉元素差異性分析

選取赤芝粉、美芝粉、新大片粉3種目前魯西地區(qū)主要的靈芝孢子粉樣品，同時(shí)以赤芝椴木粉為對(duì)照，分析赤芝粉、美芝粉、新大片粉3種孢子粉元素營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量。4種孢子粉17種元素含量見(jiàn)表3。由表3可知，靈芝孢子粉中元素分布規(guī)律與靈芝子實(shí)體中元素分布規(guī)律相似，微量元素中Fe、Cu、Zn、Mn 4種微量元素含量較高，與程齊來(lái)等[18]研究結(jié)果一致。不同品種孢子粉元素含量差異顯著，赤芝粉常量元素K、Ca含量較高，美芝粉常量元素Na、Mg含量較高，赤芝椴木粉常量元素Ca含量低于赤芝粉、美芝粉、新大片粉3種孢子粉，赤芝椴木粉K、Na、Mg 3種元素含量介于赤芝粉、美芝粉、新大片粉3種孢子粉之間。

表3 不同品種靈芝孢子粉元素分布Table 3 Element content of different varieties of Ganoderma lucidumspore power

2.3 靈芝子實(shí)體和孢子粉重金屬安全性評(píng)價(jià)

對(duì)藏芝、赤芝、美芝、香血芝、新大片5種靈芝子實(shí)體和赤芝粉、美芝粉、新大片粉和赤芝椴木粉4種孢子粉樣品中As、Pb、Hg、Cr、Cd 5種重金屬進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2。由圖2可知，5種子實(shí)體樣品中Hg元素均低于檢出限（0.001 mg/kg），As元素含量范圍為0.068 8~0.639 mg/kg，Pb元素含量范圍為0~ 0.268 mg/kg，Cr元素含量范圍為0.110~2.08 mg/kg，Cd元素含量范圍為0.023~0.364 mg/kg。目前靈芝子實(shí)體重金屬限量沒(méi)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/68C 002-2019《靈芝干品》[19]中僅對(duì)As、Pb、Hg 3種元素設(shè)定了限量要求（As≤1.0 mg/kg、Pb≤2.0 mg/kg、Hg≤0.2 mg/kg），團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/JZLZ 003-2019《金寨靈芝》[20]中對(duì)As、Pb、Hg 3種元素也設(shè)定了限量要求（As≤0.9 mg/kg、Pb≤1.8 mg/kg、Hg≤0.1 mg/kg）。從5種靈芝子實(shí)體檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，Pb、Hg 2種重金屬含量遠(yuǎn)低于相關(guān)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)限量要求，安全性較高，藏芝、香血芝As元素含量較高，具有一定的安全性風(fēng)險(xiǎn)。

圖2 不同品種靈芝子實(shí)體及孢子粉重金屬含量Fig.2 Heavy metal content in different varieties of Ganoderma lucidum and spore powder

4種孢子粉重金屬檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，由圖2可知，赤芝粉、美芝粉、新大片粉和赤芝椴木粉4種孢子粉樣品中Hg元素均低于檢出限（0.001 mg/kg），As元素含量范圍為0.063 7~0.689 mg/kg，Pb元素含量范圍為0~0.291 mg/kg，Cr元素含量范圍為0.035~0.204 mg/kg，Cd元素含量范圍為0.043~0.144 mg/kg。目前靈芝孢子粉尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中只有供銷行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GH/T 1335-2021《靈芝孢子粉》[21]，但標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)對(duì)重金屬的限量要求。團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)如T/68C 002-2019《靈芝干品》[18]、T/JZLZ 003-2019《金寨靈芝》[19]對(duì)孢子粉中重金屬限量與子實(shí)體一致，從4種孢子粉重金屬As、Pb、Hg檢測(cè)結(jié)果可知，孢子粉中Pb、Hg 2種重金屬含量遠(yuǎn)低于相關(guān)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)限量要求，安全性較高，這與胡曉等[22]研究結(jié)果一致。新大片孢子粉中As元素含量較高，為0.698 mg/kg，具有一定的安全性風(fēng)險(xiǎn)。

2.4 破壁對(duì)孢子粉重金屬含量的影響

對(duì)輥式擠壓破壁技術(shù)是目前企業(yè)最常用的靈芝孢子粉破壁技術(shù)之一，實(shí)驗(yàn)對(duì)美芝、新大片、赤芝孢子粉原料及經(jīng)對(duì)輥式擠壓破壁的破壁孢子粉中As、Pb、Hg、Cd、Cr、Cu、Ni 7種重金屬元素含量進(jìn)行檢測(cè)，三種孢子粉破壁后破壁率分別為96%、97%、96%，元素檢測(cè)結(jié)果如圖3。從圖3可知，Hg元素在所有樣品中均未檢出，安全性較好。新大片孢子粉樣品除As、Pb、Cd 3種元素破壁前后無(wú)顯著性差異外，其余重金屬含量均顯著提高，重金屬含量變化與沐華等[13]研究結(jié)果一致。其余孢子粉樣品經(jīng)對(duì)輥式擠壓破壁后6種重金屬元素含量變化與厲炯等[23]、鄒小龍等[12]研究一致，均發(fā)生了顯著提高。

圖3 破壁對(duì)孢子粉金屬元素含量的影響Fig.3 Effect of broken wall on the heavy metal element content of Ganoderma lucidum spore powder

《保健食品原料目錄破壁靈芝孢子粉》[24]原料技術(shù)要求中對(duì)破壁孢子粉中As、Pb、Hg、Cr、Cd、Ni 6中元素有明確限量要求（As≤1.0 mg/kg、Pb≤2.0 mg/kg、Hg≤0.1 mg/kg、Cd≤0.5 mg/kg、Cr≤2.0 mg/kg、Ni≤ 1.0 mg/kg）。除《保健食品原料目錄破壁靈芝孢子粉》原料技術(shù)要求外，供銷行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GH/T 113-2017《靈芝破壁孢子粉》[25]對(duì)As、Pb、Hg三種元素也有明確限量要求（As≤1.0 mg/kg、Pb≤2.0 mg/kg、Hg≤0.3 mg/kg），As、Pb限量與《保健食品原料目錄破壁靈芝孢子粉》原料技術(shù)要求一致，Hg限量較高。團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/ZZB 0474-2018《靈芝破壁孢子粉》[26]中對(duì)Cd、Cr、Cu、Ni四種元素限量做出了明確要求，其中Cd≤0.5 mg/kg、Cr≤2.0 mg/kg、Cu≤20 mg/kg、Ni≤1.0 mg/kg，與《保健食品原料目錄破壁靈芝孢子粉》原料技術(shù)要求中限量要求一致。經(jīng)對(duì)輥式擠壓破壁后，新大片粉Cu元素由12.0 mg/kg提高至16.8 mg/kg；赤芝粉As、Pb、Cr、Cd 4種含量分別由0.112、0.239、0.108、0.070 9 mg/kg提高至0.600、0.870、0.870、0.113 mg/kg，美芝粉As、Pb、Cr、Cd、Cu、Ni元素含量也有一定程度提高。因此在對(duì)輥式擠壓破壁過(guò)程中孢子粉仍存在被重金屬污染的風(fēng)險(xiǎn)，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中要嚴(yán)格控制破壁力度、破壁時(shí)間等相關(guān)破壁條件，減少重金屬污染。

3 結(jié)論

藏芝和香血芝子實(shí)體大部分元素含量明顯高于赤芝、美芝和新大片樣品，特別是Fe、Cu、Zn、Mn、Se、B、V、Co、Sr 9種人體必需微量元素，新引品種藏芝和香血芝元素營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量相對(duì)較高；赤芝粉和赤芝椴木粉元素營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量高于美芝粉和新大片孢子粉元素營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量，特別是孢子粉中營(yíng)養(yǎng)元素硒，赤芝粉和赤芝椴木粉中硒含量分別是美芝粉中硒含量的3倍和2倍。研究結(jié)果對(duì)于優(yōu)質(zhì)靈芝品種及孢子粉品種的引育及推廣具有重要的指導(dǎo)作用。

藏芝、赤芝、美芝、香血芝、新大片5種靈芝子實(shí)體及赤芝粉、美芝粉、新大片粉和赤芝椴木粉4種孢子粉樣品中，Pb、Hg兩種重金屬含量遠(yuǎn)低于相關(guān)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，安全性較高，藏芝、香血芝樣品樣品中As元素含量較高，說(shuō)明藏芝、香血芝等引進(jìn)品種在培育過(guò)程中對(duì)As元素的富集作用較強(qiáng)，具有一定的安全風(fēng)險(xiǎn)，在種植過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格控制培養(yǎng)基料中重金屬As的含量。

不同品種靈芝孢子粉對(duì)輥式擠壓破壁過(guò)程中As、Pb、Cd、Cr、Cu、Ni金屬元素含量均有不同程度的提高，其中變化最為明顯的赤芝粉經(jīng)破壁后As、Pb、Cr、Cd 4種含量分別由0.112、0.239、0.108、 0.070 9 mg/kg提高至0.600、0.870、0.870、0.113 mg/kg，因此在對(duì)輥式擠壓破壁過(guò)程中重金屬元素含量仍存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。破壁后孢子粉重金屬含量增加，是因?yàn)閷?duì)輥式擠壓破壁機(jī)是由金屬部件組成，高強(qiáng)度的破壁擠壓會(huì)造成金屬部件的磨損，從而使設(shè)備中的重金屬進(jìn)入孢子粉中。為避免重金屬污染，實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中破壁功率、破壁時(shí)間等相關(guān)破壁條件還需進(jìn)一步優(yōu)化研究，同時(shí)改進(jìn)破壁工藝，開(kāi)發(fā)材質(zhì)（如陶瓷）安全、易于推廣的破壁設(shè)備，減少破壁過(guò)程的二次污染，也是孢子粉破壁設(shè)備未來(lái)研發(fā)的主要方向。