張 軍，張 良，湯 偉,3，孫曉雯，唐 濤,3，喬曉妮，梁 萌，何增國

（1.中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，山東 青島 266000；2.青島百奧安泰生物科技有限公司，山東 青島 266000；3.青島海洋生物醫(yī)藥研究院股份有限公司，山東 青島 266000；4.山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗中心，山東 濟南 250000）

傳統(tǒng)抗菌藥物在醫(yī)療衛(wèi)生、食品加工和畜牧養(yǎng)殖業(yè)中長期不規(guī)范應(yīng)用導(dǎo)致了耐藥性病原菌的產(chǎn)生和蔓延，對人類健康、食品安全和畜牧生產(chǎn)帶來了不利影響。因此，發(fā)掘綠色、安全的天然抗菌活性產(chǎn)物一直是醫(yī)療、食品和養(yǎng)殖業(yè)研究熱點。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）也將新型抗菌物質(zhì)的開發(fā)視為解決耐藥性病原菌的希望[1]。自然界中存在種類和數(shù)量眾多的微生物，在激烈的生存競爭過程中，進化出了諸多抑制其他微生物生長的手段，對這些具有抑菌作用代謝產(chǎn)物的發(fā)掘和研究，可以為對治耐藥性病原菌提供新的資源[2]。

芽孢桿菌是自然界中廣泛存在的一類微生物，由于所處環(huán)境多樣且復(fù)雜，常蘊含豐富的具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物，如脂肽、細菌素等，具有潛在的應(yīng)用價值[3]。有報道顯示，芽孢桿菌產(chǎn)生具有拮抗作用的代謝產(chǎn)物占總基因組的比例高達5%～8%[4]。貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是近年來廣受關(guān)注的一種芽孢桿菌。2005 年B.velezensis首次分離于西班牙南部馬拉加貝萊斯河流域，因此命名為B.velezensis[5]。之后研究發(fā)現(xiàn)，其與解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）在理化性質(zhì)上具有一定的相似性，在分類學(xué)上曾一度將其歸于B.amyloliquefaciens，之后其命名幾經(jīng)反復(fù)，最終在2016年通過全基因組比較，確立其為一個獨立的種[6-8]。B.velezensis來源廣泛，在土壤、動植物體內(nèi)、池塘、海洋中均有發(fā)現(xiàn)[9]。B.velezensis蘊含了多種具有抑菌作用的代謝產(chǎn)物基因，包括脂肽類、聚酮類、環(huán)肽類和抗生素類[10]。因此，B.velezensis作為新型抑菌物質(zhì)的來源，具有巨大的應(yīng)用潛力。目前B.velezensis較多作為生防菌應(yīng)用于種植業(yè)[4,7]，而在醫(yī)療衛(wèi)生、食品加工、畜牧生產(chǎn)和環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用較少，可能與大多數(shù)B.velezensis來源于土壤環(huán)境相關(guān)[11]。因此，為擴大B.velezensis的應(yīng)用范圍，一方面需要豐富其來源，從不同環(huán)境中篩選具有生物活性的菌株；另一方面需要深入研究其功能性代謝產(chǎn)物的種類和作用機制。

本研究從口腔樣品中分離得到1 株具有抑菌活性的B.velezensis，通過對其發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)的分離純化，鑒定其結(jié)構(gòu)，并通過抑菌譜、抑菌活性、溶血性等對活性產(chǎn)物的特性進行研究，進而為其在醫(yī)療衛(wèi)生、食品加工、畜牧生產(chǎn)和環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌株

分離樣品采集自中國人民解放軍戰(zhàn)略支援部隊醫(yī)院口腔科的離體牙樣品，置于無菌生理鹽水中。

綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、白色念珠菌（Candida albicans）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、大腸桿菌（Escherichia coli）均由本研究室分離和保存；副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）ATCC17802、單核細胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19115、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）CICC21605分別購自廣東微生物菌種保藏中心、寧波明舟生物科技有限公司和中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯（tryptic soy-yeast extract broth，TSB-YE）培養(yǎng)基：TSB培養(yǎng)基30 g，酵母提取物6 g，加水至1 L，121 ℃滅菌15 min；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加水至1 L，115 ℃滅菌20 min；LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、MH（Mueller-Hinton）培養(yǎng)基和MSR（de Man,Rogosa and Sharpe）培養(yǎng)基購自青島海博科技有限公司。

葡聚糖凝膠G-50 西安藍曉科技新材料股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Epoch酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；CR21N冷凍離心機 日本日立公司；ALPHA 1-2Ldplus真空冷凍干燥機 德國Marin Christ公司；HA99-1蛋白純化系統(tǒng) 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種篩選

將采集的離體牙樣品充分振蕩混勻，在TSB-YE培養(yǎng)基中37 ℃富集12 h。之后，進行10 倍梯度稀釋，選取合適的稀釋度，涂布TSB-YE固體平板，37 ℃培養(yǎng)至長出單菌落。以L.monocytogenesATCC 19115為指示菌（下同），采用Over-lay法進行菌落篩選[12]，選擇抑菌圈最大的菌株（編號為1-3），在LB培養(yǎng)基上劃線純培養(yǎng)3 次，保藏于-80 ℃。

1.3.2 菌株分類鑒定

在LB固體平板上對保存的菌株1-3劃線，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察其菌落形態(tài)特征。采用革蘭氏染色法，在顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)特征。對培養(yǎng)的菌株1-3進行需氧性實驗、氧化酶實驗、觸酶實驗以及糖發(fā)酵實驗，測定其生理生化性質(zhì)。

挑取LB平板上的菌株1-3單菌落，采用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進行菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增菌株1-3的16S rRNA基因序列。之后，將PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測得的序列在NCBI網(wǎng)站進行比對，在LPSN（List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature）網(wǎng)站（https://lpsn.dsmz.de/）選擇相應(yīng)模式菌株的16S rRNA基因序列，使用MEGA7.0軟件，采用鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，判定菌株1-3的種屬類型。將菌株1-3在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)中期，菌液離心后，棄上清液，菌體用生理鹽水漂洗2 次，將菌體送生工生物工程（上海）股份有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。在測得序列中，隨即抽取9636 條序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，進一步確定其種屬信息。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)及抑菌活性物質(zhì)的分離純化

取保存的菌株1-3甘油管50 μL，接種到5 mL的TSBYE培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖培過夜。1%的接種量轉(zhuǎn)接到100 mL的TSB-YE培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖培24 h，每4 h取樣1 mL，12000 r/min離心10 min，取上清液。在含有指示菌的平板上，采用瓊脂擴散法檢測發(fā)酵液中的抑菌活性，并測定不同取樣時間的pH值。

采用硫酸銨沉淀法分離目標(biāo)產(chǎn)物。培養(yǎng)24 h的菌株1-3發(fā)酵液離心取上清液，加入飽和度30%的硫酸銨在4 ℃條件下沉淀過夜。10000 r/min、4 ℃離心30 min，沉淀用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶。上清液繼續(xù)補加硫酸銨至飽和度60%，10000 r/min、4 ℃離心30 min，沉淀用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶。同樣的操作得到90%硫酸銨的沉淀。在含有指示菌的平板上，采用牛津杯法檢測各組抑菌活性。

將硫酸銨沉淀活性最強的組分，用葡聚糖凝膠G-50進一步純化。用去離子水洗脫，流速0.5 mL/min，檢測波長280 nm。收集不同洗脫時間的組分進行真空凍干，復(fù)溶于磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，采用牛津杯法檢測不同保留時間組分的抑菌活性，并將該組分作為脂肽粗品進行表征。

1.3.4 抑菌活性物質(zhì)的鑒定

采用排油方法鑒定產(chǎn)物的表面活性劑成分。在潔凈的培養(yǎng)皿中加入無菌水，在水中加入200 μL食用油，使之在水面形成油膜，然后在油膜中心加入10 μL脂肽樣品，觀察油膜是否被擠向四周形成圓環(huán)。

將G-50 純化的樣品用薄層色譜（thinlayer chromatography，TLC）層析分離并用生物自顯影方法確定抑菌活性物質(zhì)的位置。具體方法為：將G-50層析收集的脂肽凍干樣品，復(fù)溶于含有50%甲醇的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，點于預(yù)制硅膠板上，用三氯甲烷-甲醇-水64∶25∶4的展開劑層析，用波長為254 nm的紫外燈檢測層析結(jié)果。展開結(jié)束后，將硅膠板放在碘缸中熏蒸，觀察層析板上是否有黃色的脂質(zhì)斑點出現(xiàn)。在同時層析的另一塊硅膠板晾干后，倒扣于含有指示菌的平板上，4 ℃冰箱中放置2 h，使產(chǎn)物充分?jǐn)U散于瓊脂中。之后將平板轉(zhuǎn)移至37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h，觀察培養(yǎng)皿中是否有抑菌圈出現(xiàn)。計算碘缸熏蒸和生物自顯影的遷移率。

采用高效液相色譜分離脂肽粗品，采用C18柱，流動相分別為乙腈和水，洗脫條件為：0～3 min，乙腈20%；3～10 min，乙腈20%～40%；10～15 min，乙腈40%～50%；15～30 min，乙腈50%～100%；30～40 min，乙腈100%。流速0.5 mL/min，檢測波長280 nm。收集不同洗脫時間的樣品，進行抑菌實驗，將有抑菌活性的組分進行基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionizer-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）檢測，對目標(biāo)峰進行二級質(zhì)譜檢測，并解析脂肽的結(jié)構(gòu)。

1.3.5 抑菌活性物質(zhì)的表征

1.3.5.1 抑菌譜

將各保存的受試菌株甘油管按照1%的接種量，接到相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其中，P.aeruginosa、S.aureus、V.parahaemolyticusATCC17802、V.cholerae、B.cereus、E.coli用MH培養(yǎng)基37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。C.albicans用YPD培養(yǎng)基在28 ℃條件下靜置培養(yǎng)12 h。E.faecalisCICC21605用MRS培養(yǎng)基在 37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。L.monocytogenesATCC 19115用TSB-YE培養(yǎng)基37 ℃，180 r/min培養(yǎng)12 h。之后，將各菌種對應(yīng)的固體培養(yǎng)基融化，待降溫到40 ℃左右，按照1%的接種量接入相應(yīng)的菌種，迅速混勻，倒入平板。采用牛津杯法進行抑菌實驗，每孔加入20 μL的樣品，分別在各菌株對應(yīng)的溫度下培養(yǎng)12 h，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，并測量抑菌圈直徑。

1.3.5.2 抑菌活性

純化樣品對L.monocytogenesATCC 19115的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測定參考Zhang Jun等[13]方法進行。將樣品用無菌水配制成2560 μg/mL樣液，用無菌水進行2 倍梯度稀釋，共稀釋12 管至質(zhì)量濃度0.125 μg/mL。挑取指示菌平板上的單菌落至5 mL的TSB-YE培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)過夜。按照1%的接種量，將過夜培養(yǎng)的指示菌轉(zhuǎn)接到30 mL的TSB-YE培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)至OD600nm為0.4，用TSB-YE培養(yǎng)基稀釋1000 倍備用。在96 孔板中，分別加入90 μL稀釋好的菌液和10 μL各稀釋樣品，每個稀釋度做3 個平行。氨芐青霉素（ampicillin，Amp）和無菌水分別為陽性和陰性對照。之后將96 孔板密封，37 ℃、50 r/min搖培12 h，使用酶標(biāo)儀檢測OD600nm。以96 孔板內(nèi)完全抑制指示菌生長質(zhì)量濃度為相應(yīng)的MIC值。

1.3.5.3 pH值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性

用無菌水配制2 mg/mL的樣品溶液，分別加入等體積0.1 mol/L的Gly-HCl緩沖液（pH 2.0）、醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.0）、磷酸鹽緩沖液（pH 6.0和pH 8.0）和Gly-NaOH緩沖液（pH 10.0），將各處理組在37 ℃條件下水浴1 h。熱穩(wěn)定性實驗，用pH 6.0磷酸緩沖液配制1 mg/mL樣品溶液，分別在20、40、60、80 ℃條件下水浴1 h，100 ℃水浴30 min。不同處理的樣品采用牛津杯法，測定樣品對指示菌的抑菌活性。

1.3.5.4 溶血性

采用心臟采血法對Sprague Dawley（SD）大鼠進行心臟取血，加入肝素管中。取500 μL血液加入2.5 mL生理鹽水，8000 r/min離心4 min，棄上清液，沉淀的血細胞用生理鹽水重復(fù)洗滌2 次至上清液無色。取200 μL血細胞加入9.8 mL生理鹽水制成2%紅細胞懸液。取450 μL細胞懸液加入到9 個1.5 mL的EP管中，分別加入50 μL樣品稀釋液（終質(zhì)量濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL）。以相同體積生理鹽水和2%曲拉通-100為陰性和陽性對照。各處理組在37 ℃條件下孵育1 h，之后各樣品取100 μL至96 孔板中，在540 nm波長處檢測吸光度，每個處理組做3 個平行。各處理組溶血性按下式計算：

式中：A樣品為各處理組的吸光度；A0為生理鹽水處理組的吸光度；A100為曲拉通-100處理組的吸光度。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選鑒定

以L.monocytogenesATCC 19115為指示菌，采用Overlay的方法從離體牙樣品中篩選得到1 株具有抑菌活性的菌株1-3。菌落形態(tài)觀察，呈圓形，半透明，表面皺褶，有凸起（圖1A）。革蘭氏染色呈陽性，1000 倍顯微鏡下觀察為桿狀（圖2B）。對菌株1-316S rRNA基因序列測序后在NCBI網(wǎng)站用BLASTn比對，選擇相應(yīng)模式菌株的16S rRNA基因序列使用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示菌株1-3與B.velezensis聚類到一個分支上（圖2），與B.velezensisAJAS1（MT459821.1）的相似性達99.93%。將上述16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)上傳到國家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心（National Microbiology Data Center，NMDC），獲得序列號：NMDCN0000QQ7。

圖1 菌株1-3的菌落（A）和菌體（B）形態(tài)特征Fig.1 Colonial (A) and cellular (B) morphology of strain 1-3

圖2 菌株1-3的進化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene sequence of strain 1-3

糖、醇發(fā)酵實驗結(jié)果顯示，菌株1-3可以利用蔗糖、乳糖、甘油、果糖、葡萄糖、棉子糖、甘露醇、熊果苷、苦杏仁苷、阿拉伯糖產(chǎn)酸，而不能利用蜜二糖產(chǎn)酸，另外對纖維二糖和甲基α-D-半乳糖苷的利用則不明顯（表1）。以上結(jié)果與《伯杰氏細菌手冊》和文獻中B.velezensis的生理生化特征描述基本一致[10,14]。因此，判定菌株1-3為B.velezensis，將其命名為B.velezensis1-3。進一步對菌株1-3轉(zhuǎn)錄組測序的CDS序列中，隨即抽取9636 條序列進行BLASTn比對分析，發(fā)現(xiàn)其中的9566 條序列與B.velezensis一致（表2），更進一步證實了該菌株屬于B.velezensis。

表1 菌株1-3的理化性質(zhì)Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain 1-3

表2 菌株1-3轉(zhuǎn)錄組測序隨機比對結(jié)果Table 2 Results of random transcriptome sequence alignment of strain 1-3

2.2 抑菌活性物質(zhì)的表達與分離純化

如圖3所示，從8 h開始出現(xiàn)抑菌活性，隨著發(fā)酵時間延長抑菌圈逐漸增大，至24 h抑菌活性最大（圖3A），其中8～20 h發(fā)酵液上清液之間的抑菌圈直徑達到顯著差異水平，而20 h與24 h樣品的抑菌圈直徑差異不顯著（P＞0.05）（圖3B）。整個發(fā)酵過程中的pH值在7.0～8.0范圍內(nèi)，因此可以排除pH值變化對抑菌活性的影響。采用硫酸銨分步沉淀法沉淀具有抑菌活性的產(chǎn)物，結(jié)果顯示30%硫酸銨沉淀物的抑菌活性最大，隨著硫酸銨含量的增大，上清液和沉淀的抑菌活性逐漸減?。▓D4），表明30%硫酸銨可得到大部分活性物質(zhì)。將30%硫酸銨沉淀物進行葡聚糖凝膠G-50純化，通過收集不同時間的洗脫組分，進行抑菌實驗，結(jié)果如圖5所示，在保留時間150 min左右的抑菌活性最高。將該組分收集后凍干，作為鑒定和特性研究的樣品。

圖3 不同培養(yǎng)時間上清液的抑菌活性（A）和抑菌圈直徑（B）Fig.3 Antibacterial activity (A) and inhibition zone diameter (B) of supernatants at different culture time

圖4 硫酸銨沉淀抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of precipitates obtained by ammonium sulfate salting-out

圖5 G-50分子篩凝膠層析純化層析圖譜和抑菌活性Fig.5 Sephadex G-50 column chromatogram

2.3 活性物質(zhì)鑒定

排油實驗發(fā)現(xiàn)純化產(chǎn)物可以將水面油膜迅速擠向四周，形成一個圓環(huán)，表明純化產(chǎn)物具有表面活性劑的功能。該性能為其應(yīng)用于水體、土壤等方面的有機污染物清理提供了便利[15]。同時，在石油開采中，生物表面活性劑可以有效減少界面鹽水和油之間的張力，通過改變油驅(qū)比，提高了石油開采的效率[16]。這對解決日益嚴(yán)重的能源危機同樣具有積極意義。采用預(yù)制硅膠板對葡聚糖凝膠G-50層析收集到的活性產(chǎn)物進行TLC分離，在254 nm紫外光下的成像結(jié)果如圖6A所示。用碘缸熏蒸后出現(xiàn)了3 個比較明顯的斑點（圖6B），其遷移率分別為42%、54%和71%。通過TLC-生物自顯影的方法確定純化產(chǎn)物中含有抑菌活性的組分（圖6C），發(fā)現(xiàn)遷移率為71%的組分具有抑菌活性。之前有報道，顯示一種源自B.cereus的脂肽表面活性素（Surfactin）的遷移率為70%[17]，與本次分離的產(chǎn)物類似，因此判斷該產(chǎn)物可能是具有表面活性劑功能的脂肽Surfactin。

圖6 脂肽物質(zhì)TLC和抑菌活性生物自顯影Fig.6 TLC and TLC-bioautographic analysis of lipopeptides

G-50純化后的粗品經(jīng)高效液相色譜進一步純化后，在保留時間34.3 min的組分具有抑菌活性，將該樣品進行MALDI-TOF-MS檢測，發(fā)現(xiàn)有3 個特征峰，分子質(zhì)量分別為1030.642、1044.660 Da和1058.677 Da，3 個特征峰的分子質(zhì)量相差14 Da（圖7）。之前有研究顯示，B.velezensisKLP2016可以產(chǎn)生具有抑菌活性的Surfactin[15]，與本研究分離得到的活性產(chǎn)物分子質(zhì)量近似。對3 個特征峰進行二級質(zhì)譜鑒定，結(jié)果如圖8所示，對出現(xiàn)的碎片峰進行圖譜解析，發(fā)現(xiàn)3 個特征峰得到碎片規(guī)律類似，都含有4 個亮氨酸（Leu）、1 個纈氨酸（Val）、1 個天冬氨酸（Asp）和1 個谷氨酸（Glu）組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，以及14～16 個C的脂肪鏈。該結(jié)構(gòu)與之前發(fā)現(xiàn)自B.velezensisSH-B74的環(huán)狀脂肽Surfactin結(jié)構(gòu)近似[18]。因此，確定在B.velezensis1-3中分離的活性產(chǎn)物為C14～C16的環(huán)狀脂肽Surfactin。脂肽Surfactin并非由基因組直接合成，而是在非核糖體肽合成酶的作用下，將不同的模塊連接在一起的特殊結(jié)構(gòu)，具有復(fù)雜的生物合成過程[4]。另外，質(zhì)譜分析結(jié)果顯示在脂肪鏈中可能含有3 對雙鍵，并且化合物在254 nm的紫外燈下有明顯熒光吸收，說明其3 個雙鍵可能依次排列形成共軛體系，但其具體位置需要進一步研究確定。

圖7 脂肽物質(zhì)的鑒定Fig.7 Primary MS spectra of lipopeptides

圖8 3 種脂肽物質(zhì)的二級質(zhì)譜及結(jié)構(gòu)Fig.8 Secondary MS spectra and structures of three lipopeptides

2.4 抑菌譜和MIC

采用在醫(yī)療衛(wèi)生、食品加工和畜牧生產(chǎn)中常見的病原菌測定Surfactin的抑菌譜，其中包括5 株革蘭氏陽性菌（G＋）、6 株革蘭氏陰性菌（G-）和1 株真菌。如表3所示，Surfactin樣品對G＋和G-均有一定的抑制作用，且對G＋的效果明顯強于G-。之前的文獻報道，Surfactin對G＋的S.aureus、L.monocytogenes、B.subtilis、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），G-的E.coli、腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica）、費格森埃希菌（Escherichia fergusonii）、B.licheniformis和一些植物來源的真菌具有一定抗性[9,17,19-20]。本研究分離的Surfactin未表現(xiàn)出對C.albicans的抑制作用（表3）。但有研究顯示，當(dāng)Surfactin與氟康唑聯(lián)合使用時表現(xiàn)出對C.albicans生長的抑制[21]。除了直接的抑菌作用外，Surfactin還可以激活植物的防御系統(tǒng)。Chowdhury等[22]的研究顯示，來源于B.amyloliquefaciens的Surfactin可以促進萵苣根部防御基因PDF1.2的表達。同時，關(guān)于Surfactin的抗腫瘤、抗支原體、抗病毒和抑制藍藻等方面的研究也有一定的報道[16,23]。

表3 純化產(chǎn)物的抑菌譜Table 3 Antibacterial spectra of purified surfactin

L.monocytogenes是一種來源廣泛的食源性致病菌，在高鹽、酸性和低溫（約5 ℃）條件下也可繁殖，據(jù)WHO統(tǒng)計，L.monocytogenes雖然感染性不高，但致死率高達20%～30%，因此各國均將其列為重要的公共衛(wèi)生問題[24]。對樣品MIC實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化產(chǎn)物在第7孔和第8孔之間出現(xiàn)了明顯的菌濃度變化，因此將樣品對L.monocytogenesATCC 19115的MIC值確定為第7孔對應(yīng)樣品質(zhì)量濃度，即4 μg/mL。相同的實驗條件下，Amp對指示菌的MIC為0.0625 μg/mL。雖然Surfactin的MIC大于Amp，但面對日益嚴(yán)重的耐藥性病原菌問題，采用抑菌作用機制不同于傳統(tǒng)抗生素新型抗菌物質(zhì)，可能是解決耐受性病原菌的有效手段。研究顯示，Surfactin的抑菌機制是在病原菌的細胞膜上形成孔洞，引起細胞內(nèi)的核酸、蛋白、K＋、Ca2＋等物外流，使細胞代謝受阻，進而導(dǎo)致病原菌死亡[4,9,25-26]，而非傳統(tǒng)抗生素的對細胞壁合成的抑制。

2.5 溶血性

不同質(zhì)量濃度稀釋樣品對SD大鼠紅細胞的溶血性如圖9所示，將陰性和陽性對照的溶血率分別設(shè)定為0%和100%，在4～64 μg/mL下溶血率在0.44%～0.89%之間，且組間未表現(xiàn)出顯著差異（P＞0.05），而當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達到128 μg/mL和256 μg/mL時，溶血率分別為1.63%和4.43%，雖然組間表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05），但其溶血率仍處于較低水平。Nozhat等[27]對Surfactin C-15進行的體外溶血性和細胞毒性研究顯示，其半溶血率（value of half of hemolytic，HC50）和半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為47 μmol/L和86.9 μmol/L；孫立軍等[28]在小鼠的體內(nèi)實驗表明，Surfactin無任何毒性反應(yīng)，評價為無毒級。Santos等[16]總結(jié)Surfactin的體內(nèi)毒性研究發(fā)現(xiàn)，其注射和經(jīng)口飼喂的半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）在100～2000 mg/kg。遠小于其發(fā)揮最小抑菌濃度的范圍。同時，Surfactin的肽類屬性其在消化道中會面臨諸多蛋白酶的降解，因此不會產(chǎn)生藥物殘留。

圖9 不同質(zhì)量濃度Surfactin的溶血性Fig.9 Effect of surfactin at various concentrations on hemolysis of erythrocytes

2.6 pH值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性

樣品在pH 4.0～10.0的環(huán)境中處理1 h，對指示菌抑菌活性未發(fā)生變化，而在pH 2.0的環(huán)境中抑菌活性有所下降，表明酸性pH值對抑菌活性有一定影響（圖10A）。在Surfactin樣品對溫度的耐受性實驗結(jié)果顯示，經(jīng)20、40、60 ℃處理1 h后，對抑菌活性沒有影響，而在80 ℃處理1 h和100 ℃處理30 min后，抑菌活性均能維持在90%左右（圖10B）。Surfactin穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)賦予了其良好的熱穩(wěn)定性和廣泛的pH值適應(yīng)性，不同來源的Surfactin均顯示具有良好的熱穩(wěn)定性和廣泛的pH值適應(yīng)性[20,29-30]。

圖10 Surfactin樣品的pH值穩(wěn)定性（A）和熱穩(wěn)定性（B）Fig.10 pH (A) and heat (B) stability of surfactin

3 結(jié)論

從口腔樣品中分離出1 株具有抑菌活性的B.velezensis1-3。通過硫酸銨沉淀、分子篩層析得到了具有抑菌活性的組分，經(jīng)排油實驗、TLC、MALDI-TOF-MS等手段確定該活性組分為含有14～16 個C的環(huán)狀脂肽Surfactin。抑菌譜和MIC結(jié)果表明Surfactin對常見的G＋和G-具有抑菌活性，對L.monocytogenesATCC 19115的MIC可達4 μg/mL。較低的溶血性表明Surfactin具有一定的成藥前景，而pH值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性研究則表明了其較強的環(huán)境適應(yīng)性。綜上所述，Surfactin顯示出在食品加工、醫(yī)療衛(wèi)生、畜牧生產(chǎn)和環(huán)境治理等方面可能具有一定的應(yīng)用潛能。然而，目前Surfactin的生產(chǎn)成本仍然較高，大約在100～1000 美元/kg[31]。因此，未來通過對代謝途徑的調(diào)控，大幅提高產(chǎn)生菌合成Surfactin的效率，將是其應(yīng)用的關(guān)鍵。